陳得勝,林炎水

成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 關節(jié)外科(成都 610500)

·綜 述·

骨髓基質干細胞體外誘導成骨細胞的研究進展*

陳得勝,林炎水△

成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 關節(jié)外科(成都 610500)

骨髓基質干細胞；成骨細胞；成骨誘導

大量科學研究表明，來源于中胚層的未分化的間充質細胞是骨髓非造血干細胞中的一類，這類細胞體外擴增程度高、可多個向分化、容易進行移植、可支持造血等，其獨特之處為該細胞可向諸如成骨細胞、軟骨細胞、脂細胞、肌細胞、神經細胞、內皮細胞、肝細胞等多種細胞分化，所以其又被稱為骨髓基質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)。BMSCs是獲取目標細胞、目標組織熱門的種子細胞[1]。近幾十年來，關于BMSCs的多向分化特性有了不斷深入的研究，在探討如何將BMSCs誘導分化為成骨細胞的方法方面做了大量的科學研究?，F(xiàn)就BMSCs體外定向誘導成骨細胞的方法作一綜述，對其研究進展作一回顧。

1 BMSCs分離培養(yǎng)方法

目前，BMSCs的分離與培養(yǎng)技術已較成熟，方法多種多樣，常見的有密度梯度離心法、全骨髓培養(yǎng)法、流式細胞儀法和免疫磁珠分離法等，各有優(yōu)缺點，可以根據(jù)實驗條件和實驗要求進行選擇。

1.1 免疫磁珠分離和流式細胞儀分離法

采用免疫磁珠分離和流式細胞儀分離方法所獲得的BMSCs純度較高，不足在于這兩種方法均使細胞的分化能力和活性減低，且對實驗條件要求較高，對骨髓的要求量較大，所以不常采用。

1.2 全骨髓培養(yǎng)法

BMSCs有貼壁生長的特性，可以利用該特點進行全骨髓培養(yǎng)來分離培養(yǎng)細胞，該方法不會破壞BMSCs的原始生活環(huán)境，有利于細胞的生長和分化。但把造血干細胞和其他種類細胞共培養(yǎng)，難以避免其他雜質細胞在貼壁細胞中出現(xiàn)，且BMSCs和其他雜質細胞的性質差別很大，較難得到純化的BMSCs[2]。

1.3 密度梯度離心法

密度梯度離心法使用較普遍，該方法是利用骨髓各成分間密度的差異，通過離心力的作用去除大部分的血細胞來提取BMSCs，此時的BMSCs內含有小部分造血系血細胞，有待進一步純化，其主要利用造血系細胞和BMSCs的貼壁性能差異反復更換培養(yǎng)液將懸浮生長的血細胞去除，使BMSCs得到純化。

1.4 細胞片層技術法

細胞片層技術分離培養(yǎng)BMSCs是一種新的方法，和傳統(tǒng)方法相比具有獨特的優(yōu)勢[3]。細胞貼壁培養(yǎng)過程中胞外的蛋白使細胞間或細胞與培養(yǎng)瓶內壁黏連，此時直接吹打細胞來進行傳代培養(yǎng)難度大，吹打下來的細胞易受到嚴重的損害，所以傳統(tǒng)方法用胰蛋白酶對細胞進行消化來分離和傳代培養(yǎng)細胞。由于消化時間和消化過程難以得到精準控制，細胞外基質一定程度上受到破壞，細胞活性降低，細胞染色體突變機會增加[4]。國外研究者[5]發(fā)現(xiàn)一種復合物組成的培養(yǎng)皿具有很強的溫度反應特異性，該培養(yǎng)皿由聚異丙基丙烯酰胺與普通聚乙烯培養(yǎng)皿共價結合組成，對溫度和CO2飽和濕度的變化十分敏感，隨著溫度和CO2飽和濕度的變化，培養(yǎng)基表面變成親水性或疏水性。在培養(yǎng)皿表現(xiàn)為疏水性的條件下，BMSCs可以在培養(yǎng)皿的表面進行附著、擴增、增殖；當培養(yǎng)皿表面表現(xiàn)為親水性時，聚異丙基丙烯酰胺與普通聚乙烯培養(yǎng)皿復合物在培養(yǎng)皿的表面形成水化層，細胞在此時可以主動脫落形成細胞片層。該研究還指出培養(yǎng)皿表面表現(xiàn)為疏水性的條件環(huán)境溫度為32 ℃、CO2飽和濕度為5%，而親水性的條件是溫度20 ℃、CO2飽和濕度為5%。有研究指出：細胞培養(yǎng)的效果還與細胞片層厚度相關，當厚度過薄或過厚時細胞均不會良好生長；當厚度在15～20 nm時，培養(yǎng)皿表面的細胞可迅速附著、擴增，超過30 nm時細胞的黏附率和增殖數(shù)目均會受到影響[6]，但最佳厚度有待進一步研究。應用細胞片層技術所獲得的種子細胞進行成骨誘導時可獲得類似板層狀骨，通過可降解生物支架材料為載體，再通過載體的轉運功能把單層或多層的BMSCs細胞片層植入受區(qū)，并對BMSCs加以成骨誘導，使其細胞-支架復合物最終形成類似于板層結構的組織工程骨，這是構建組織工程骨較好的思路[3]。

2 成骨細胞的主要標志物及檢測方法

2.1 主要標志物

堿性磷酸酶(簡稱ALP或AKP)是廣泛分布在人體肝臟、骨骼、腸、腎、胎盤等組織中的一種酶，ALP是成骨細胞所分泌的酶蛋白，目前已發(fā)現(xiàn)ALP有ALP1～ALP6 六種同工酶，其中第1、2、6三種來源于肝臟，第3種來源于骨細胞，第4種來源于胎盤以及癌細胞，第5種來源于小腸絨毛上皮和成纖維細胞。由于骨細胞能夠分泌產生ALP，可通過對ALP活性表達的分析來判斷BMSCs的成骨分化特性。

2.2 主要檢測方法

堿性磷酸酶(ALP)活性測定、骨鈣素分泌量測定、鈣鹽沉積量測定、電鏡掃描、HE染色、基因表達量分析等。

3 不同誘導方法誘導BMSCs向骨細胞分化

3.1 物理因素誘導BMSCs成骨

國內研究[7]表明，恒定磁場可以促進BMSCs向成骨細胞分化，該實驗通過控制變量對比分析有無恒定磁場兩組的BMSCs向成骨細胞誘導分化的效果，干預條件除一組有恒定磁場干預外，其他的條件均一樣，對誘導后的兩組培養(yǎng)皿同時在不同的時間段進行ALP活性測定、細胞增殖數(shù)目、VonKossa 染色檢測，MTT顯示在第3天時兩組培養(yǎng)皿內的細胞增殖有差異，恒定磁場組的細胞增殖數(shù)目和速度明顯高于無恒定磁場組，差異隨時間的變化更加明顯，在第5、7天檢測時發(fā)現(xiàn)所有檢測項目磁場組均高于非磁場組。研究[8]表明，細胞的某些特殊結構還能被恒定磁場干預發(fā)生改變，如恒定磁場可作用于細胞的表面微細結構對細胞的排列順序進行調整，從而加快細胞的增值分化，有利于成骨細胞成骨。國外已有研究報道，脈沖電磁場可作用于mc3t3-e1 成骨樣細胞系，通過促進細胞的增殖分化來加速骨樣組織的形成，但其作用機制有待進一步研究。自上世紀八十年代Haupt等報道體外沖擊波成功治療骨折不愈合1例后，國內外很多學者對其作用機制進行了大量研究。Wang等[9]發(fā)現(xiàn)低能沖擊波可使BMSCs的細胞膜發(fā)生電勢超極化，可促進BMSCs向成骨細胞方向分化，并形成骨小節(jié)。國內研究者[10]把8.5 kV 的工作電壓作用于BMSCs細胞培養(yǎng)皿，發(fā)現(xiàn)脈沖有促進BMSCs成骨分化的作用，且不同頻次脈沖的作用強度有差異，說明低能沖擊波促進BMSCs成骨分化的作用機制與c-fos、c-jun基因表達量增加有關。

3.2 化學試劑誘導

化學試劑是在傳統(tǒng)的BMSCs向成骨細胞分化的誘導劑中比較常見的選擇，這些化學試劑可以通過MAPK信號傳導途徑誘導BMSCs向成骨細胞分化，如抗壞血酸、地塞米松和B-磷酸甘油等。但這些刺激因素對細胞的分化具有反向作用，如地塞米松抑制了細胞的分裂和增殖，所以種子細胞的數(shù)目很難得到滿足[11]。

3.3 誘導因子誘導

3.3.1 生長因子誘導BMSCs成骨 國內有研究證明富血小板血漿對BMSCs向成骨細胞的分化有誘導作用，該作用可能與富血小板血漿內含有某種特殊的生長因子有關，其內的細胞因子能促進BMSCs的增殖與成骨分化，且PRP完全來源于自體，制作簡單，無免疫排斥反應，因此在臨床上具有良好的應用前景。國內研究者[12-13]利用富血小板血漿誘導BMSCs向成骨細胞分化，但PRP濃度和作用時間有待進一步研究。有研究指出不同部位和不同年齡階段的PRP對人BMSCs的誘導作用存在一定的差異，如Murphy等[14]把成人血和臍帶血制作的PRP進行對比，發(fā)現(xiàn)臍帶血制作的PRP對BMSCs的促進作用強于成人血制作的PRP。張曄等[15]實驗結果表明，富血小板血漿刺激骨細胞增殖，增強成骨活性，作用機制可能是富血小板血漿內的轉化生長因子β誘發(fā)細胞內基因水平的改變，并有向cbfal基因的成骨啟動基因進一步進行基因調控而增加成骨活性，加速骨的修復。除富血小板血漿內的轉化生長因子有促進BMSCs向成骨細胞分化作用外，近年還發(fā)現(xiàn)富血小板血漿內的其他多種高濃度生長因子也有類似的功能，如血小板源性生長因子、血管內皮生長因子、表皮生長因子、胰島素樣生長因子等[16]，這些生長因子大部分具有誘導BMSCs成骨細胞分化、促進骨再生修復骨缺損的作用[17-21]，還能夠誘導BMSCs向血管內皮細胞、胰島樣細胞分化。富血小板血漿內不同的生長因子具有不同的作用機制，轉化生長因子β和成骨細胞相互作用，轉化生長因子β可以增強BMSCs轉化成成骨細胞的活性并增加其數(shù)量，通過自分泌和旁分泌刺激骨細胞形成，成骨細胞則可分泌轉化生長因子β[22]。表皮生長因子既可單獨作用于BMSCs，又能夠與轉化生長因子協(xié)同作用來刺激BMSCs的增殖和向成骨細胞分化[23]。血小板源性生長因子則通過絲裂作用促進BMSCs的增殖分化，該因子是間充質起源細胞的絲裂原，最先出現(xiàn)在骨折愈合過程中，可以通過刺激BMSCs的有絲分裂來增加成骨細胞的數(shù)量，促進其分泌形成胞外基[23]。近來，張巧鳳等[24]利用胰島素樣生長因子-I明膠微球(IGF-I-GMs)通過緩慢釋放IGF-I來促進BMSCs向成骨細胞分化，比單用IGF-I促進BMSCs向成骨細胞分化具有更好的效果。另外，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2尚有誘導BMSCs成骨和促進成骨因子VEGF表達的作用[25]，而血管內皮生長因子既是一種主要的血管形成因子，又是一種重要的骨生長因子。作為一種不可或缺的骨生長因子，其在成骨細胞、破骨細胞的增殖、分化及功能活性方面發(fā)揮著重要的作用，對骨質疏松的發(fā)生發(fā)展有重大影響。調控VEGF的表達可能是骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2參與骨代謝的機制之一。

3.3.2 血管緊張素轉換酶抑制劑(angiotension converting enzyme inhibitors,ACEI) ACEI通過對血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的干預來間接促進BMSCs向成骨細胞分化[26]。VEGF在血管生成和成骨細胞分化過程中均發(fā)揮重大作用[27-29]。報道[30-32]證實：在BMSCs向成骨細胞誘導后，VEGF的表達量顯著升高，VEGF維持種子細胞的成骨表型，增加成骨細胞的數(shù)量，在促進骨組織形成的同時減少骨的吸收。ACEI通過對VEGF的干預來間接促進BMSCs向成骨細胞分化，而VEGF又能夠促進BMSCs向血管內皮細胞的分化，對血管的修復與再生有一定的作用，因此應用ACEI誘導BMSCs成骨和VEGF誘導BMSCs成血管內皮細胞進行血管修復與再生或許可以解決臨床缺血性骨壞死這一難題[33-34]。

3.4 基因修飾誘導BMSCs成骨

3.4.1 腺病毒和逆轉錄載體 除了人工基因重組方法獲取bFGF、TGF-β、BMP-2、BMP-7 等生長因子外，還可以利用病毒和非病毒載體途徑將這些生長因子進行體外轉移，再導入BMSCs內，形成生長因子-BMSCs 復合物，對復合物進行定向誘導可以形成目標細胞來修復目標組織，如修復骨缺損。國外研究者在十幾年前就做過此項實驗，以腺病毒體外轉移途徑將BMP-2 基因導入BMSCs內，并與脫礦骨基質結合形成復合物，再將復合物植入有骨缺損的小鼠體內，2個月后觀察24處骨缺損中有 22 處達到了骨性愈合[35]。國外研究者把用端粒酶逆轉錄酶(telomerase reverse transcrip tase,TERT)基因修飾的BMSCs進行體外連續(xù)傳代培養(yǎng)，通過觀察發(fā)現(xiàn)在3年后BMSCs仍保持良好的自我更新和多向分化潛能[36]。研究者[37]發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2真核表達載體在體外可以異位成骨，并能進一步促進兔橈骨缺損的修復。有學者把腺病毒途徑和逆轉錄病毒、脂質體載體途徑進行修復骨缺損效果對比，發(fā)現(xiàn)腺病毒途徑對轉hBMP-2基因小鼠BMSCs修復顱骨缺損效果最突出，而脂質體載體途徑療效最差。

3.4.2 基因轉染技術 基因轉染技術是通過編碼特定功能因子基因并轉移到種子細胞或生物活性基質材料里，轉染細胞可表達目的基因及產物，進一步在體內增殖、分化，如粟謀等[38]通過PCR方法構建重組質粒pcDNA3-hNGF并轉染至大鼠BMSCs中，促進BMSCs向軟骨細胞或骨細胞增殖、分化來達到骨折基因治療的目的。研究已證實多種細胞生長因子通過基因轉染可以有效促進BMSCs的成骨活性，如國內研究表明bFGF、BMP基因的轉染能夠極明顯促進BMSCs的增殖，利用VEGF基因轉染技術同樣可在很大程度促進BMSCs的增殖。筆者還通過ALP活性分析、骨鈣素含量測定等方法比較bFGF、BMP-2、VEGF三種生長因子對BMSCs增殖的不同影響，結果BMP-2轉染組ALP活性和骨鈣素的含量升高最為明顯[40]。TGF-β1基因轉染同樣可增加BMSCs的成骨活性，有研究表明將TGF-β1基因的復制缺陷型病毒轉入成骨細胞后，可使細胞內的I型膠原含量明顯增加。成骨細胞經TGF-β1 轉染后在人體內的活性升高，新生骨的數(shù)量明顯增加[41]。近期，國內研究者[42]把成纖維細胞生長因子l型受體(fibroblast growth factor receptors 1，F(xiàn)GFR 1)通過顯性負性作用(dominant negative strategy，DN) 轉染BMSCs，發(fā)現(xiàn)成骨細胞ALP活性顯著提高，并說明BMSCs經歷了由骨祖細胞到成骨前體細胞再到成骨細胞，最終凋亡(或是骨細胞、骨襯細胞)的過程。

3.5 仿生支架材料誘導

隨著組織工程技術和再生醫(yī)學的發(fā)展，如何獲取組織工程骨修復骨缺損的研究不斷深入。通常認為組織工程的三要素是種子細胞、生長因子、支架材料，在種子細胞、生長因子研究方面取得重大進步的同時，支架材料也得到迅速發(fā)展，各種支架材料應運而生，使細胞培養(yǎng)實現(xiàn)了從單懸細胞培養(yǎng)、多層細胞培養(yǎng)、三維立體細胞培養(yǎng)的過程。生物支架材料的功能在于為細胞提供一個三維空間，為細胞的營養(yǎng)獲取和生長代謝提供一個良好的環(huán)境。細胞-生物支架復合物植入機體受損的組織和器官后，隨著細胞的不斷增值、分化，最終形成靶器官和組織，支架慢慢降解、吸收，從而達到組織修復與再生重建的目的。張開剛等[42]將小腸黏膜下層制備的支架材料與經成骨誘導劑培養(yǎng)的第3 代BMSCs結合，形成支架-材料復合物，并將復合物植入沒有胸腺結構的裸鼠皮下繼續(xù)進行培養(yǎng)，電鏡下見有大量骨組織形成，免疫組化檢測有成骨細胞生成，該細胞可以分泌特異性骨鈣蛋白。許宇霞等[43]取分離培養(yǎng)的第3代人BMSCs接種于納米羥基磷灰石表面，并加入含濃度為50 mg/L維生素C、10 mmol/L β甘油磷酸鈉、1 mmol/L地塞米松培養(yǎng)基進行誘導分化培養(yǎng)，電鏡掃描可觀察到材料孔隙內有細胞長入。王桂芳等[44]應用TiO2納米管負載聚六亞甲基胍在一定濃度下促進大鼠BMSCs的成骨性分化，并能顯著提高種植體鈦表面的促成骨分化能力。王闖建等[45]把I型膠原和PLGA/13-TCP復合支架組合成新的包芯結構骨支架，并在骨支架上移植、培養(yǎng)BMSCs，促進其向成骨細胞分化來修復兔橈骨缺損，該新支架結構顯著提高了支架表面親水性，基于I型膠原凝膠具有的半固體、半液態(tài)特點，既有效解決了接種時細胞大量丟失的問題，又實現(xiàn)了細胞在支架孔隙中均勻的分布。國內研究者[46]近期還利用多聚賴氨酸表面修飾的脫鈣骨基質富集材料來促進人BMSCs的黏附、增殖與基質分泌等來探索臨床骨修復所面臨的干細胞密度低、容易流失問題，該材料與BMSCs具有良好的生物相容性、低細胞毒性，是一種簡便的物理吸附方法，不影響成骨誘導后BMSCs的生長及成骨活性，有望成為臨床應用自體紅骨髓聯(lián)合選擇性細胞滯留技術治療骨缺損、骨不連所需的優(yōu)先選擇富集材料之一。尉曉蔚等[47]應用國產多孔玻璃碳作骨組織工程的支架載體材料促進BMSCs的黏附和增殖，該材料無細胞毒性，打破了多孔鉭金屬醫(yī)用材料所面臨的國外壟斷、造價昂貴問題，為進一步制造出國產多孔鉭金屬奠定前期的實驗基礎。

除了上述支架材料外，尚有凍干骨基質(fdDBM)、磷酸三鈣(TCP)、孔徑分別為200 μM及500 μM的珊瑚羥磷灰石(CH200、CH500)等，面對支架材料的多樣性，組織工程應考慮：生物相容性、無細胞毒性；具有一定強度的生物力學特性，在局部環(huán)境給予種子細胞提供結構上的支持作用；生物可降解性以及吸收速率的可調性；易塑性和臨床應用；合適的孔隙率和孔徑大小。

3.6 其他誘導

近來，明磊國等[48]通過實驗發(fā)現(xiàn)一定濃度的8-異戊烯基柑橘素對BMSCs向成骨分化有促進作用，但其作用機制尚不明確。Christoffel等[49]研究表明，8-異戊烯基柑橘素能夠抑制骨質疏松模型大鼠的骨密度下降。Sehmisch等[50]比較研究8-異戊烯基柑橘素、6-異戊烯基柑橘素、6,8-異戊烯基柑橘素的抗骨質疏松的活性，發(fā)現(xiàn)8-異戊烯基柑橘素的活性最強。

4 展望

BMSCs是熱門的種子細胞，不僅可向成骨細胞分化，還可向血管內皮細胞、軟骨細胞等細胞分化，基于其多向分化的特性，為骨科獲取復合組織工程骨提供了可能，各種原因引起的關節(jié)軟骨缺損、骨缺損、缺血性骨壞死是骨科所面臨的一大難題，倘若能找到一種或多種誘導條件共作用于BMSCs，誘導其同時向成骨細胞、軟骨細胞、血管內皮細胞分化，骨缺損或缺血性骨壞死的臨床治療會出現(xiàn)另一個嶄新的前景，有待進一步研究。

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10.3969/j.issn.1674-2257.2016.06.027

四川省衛(wèi)生廳科研基金資助項目(No:120483)

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△通信作者：林炎水，E-mail：lys0596@163.com