王愛梅，耿若君，李 弋，陳亞奇，未小明，張 珊，張 廷

(南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南 南陽 473061)

旱蓮草對(duì)老年癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬神經(jīng)遞質(zhì)的影響*

王愛梅，耿若君，李 弋，陳亞奇，未小明，張 珊，張 廷

(南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南 南陽 473061)

目的:觀察旱蓮草對(duì)老年癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬神經(jīng)遞質(zhì)的影響。方法:健康成年SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、藥物低、高劑量組。皮下注射D-半乳糖聯(lián)合雙側(cè)海馬注射Aβ25-35構(gòu)建老年癡呆大鼠模型，各組給予相應(yīng)藥物灌胃治療8周。用藥結(jié)束后，觀察各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、海馬神經(jīng)元形態(tài)變化及海馬中NE、DA、5-HT的含量和ChAT、AChE的酶學(xué)活性。結(jié)果:與模型組比較，藥物高劑量組潛伏期延長，錯(cuò)誤次數(shù)降低;海馬中錐體細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，細(xì)胞脫失現(xiàn)象較少;NE、DA和5-HT含量增高，ChAT活性升高，AChE活性降低。結(jié)論:旱蓮草可改善老年癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能，其機(jī)制可能與改善海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)、減少神經(jīng)元細(xì)胞丟失、改善海馬中神經(jīng)遞質(zhì)的代謝有關(guān)。

旱蓮草;老年癡呆;學(xué)習(xí)記憶;NE;DA;5-HT;ChAT;AChE

老年性癡呆又稱阿爾茨海默病 (alzheimer’s disease，AD)，以記憶力減退、認(rèn)知功能障礙為特征，目前尚無滿意的治療藥物。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)是腦內(nèi)的重要神經(jīng)遞質(zhì)，與大腦的學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知能力有密切關(guān)系［1］。旱蓮草為菊科一年生草本植物鱧腸的全草，為中醫(yī)常用的養(yǎng)肝益腎、涼血止血藥物。有研究報(bào)道，臨床服用含有旱蓮草的復(fù)方抗衰老膠囊，可有效改善老年癡呆的臨床癥狀［2］。本實(shí)驗(yàn)以皮下注射 D-半乳糖聯(lián)合雙側(cè)海馬注射Aβ25-35方法構(gòu)建老年癡呆大鼠模型，通過觀察旱蓮草對(duì)模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)和海馬中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響，進(jìn)而探討其作用機(jī)制，為臨床治療老年癡呆提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康 SPF級(jí)成年 SD大鼠40只，體質(zhì)量(220±20)g，雌雄各半，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供 (許可證號(hào) SCXK(豫)2010-0002)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 D-半乳糖，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(批號(hào)20130812);Aβ25-35，美國Sigma試劑公司(批號(hào)A4559);旱蓮草，河南省南陽市醫(yī)藥公司;20%烏拉坦，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(批號(hào)T20130810);去甲腎上腺素測試盒、多巴胺測試盒、5-羥色胺測試盒、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶試劑盒和乙酰膽堿酯酶試劑盒(南京建成生物工程研究 所，批 號(hào) 分 別 為 RT131026、RT131123 和RT131122、20130920，20130911);考馬斯亮蘭蛋白測試盒(批號(hào)20131008)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 立體定位儀，成都儀器廠;大鼠避暗儀，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所;酶聯(lián)免疫檢測儀，美國伯樂公司;V-1200型可見分光光度計(jì)，上海棱譜儀器儀表有限公司;FSH-Ⅱ型高速電動(dòng)勻漿機(jī)，江蘇金運(yùn)市環(huán)宇科學(xué)儀器廠;SSW型微電腦電熱恒溫槽，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠; AE-100型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.1.4 旱蓮草提取物的制備 取旱蓮草500 g加自來水2500 ml煎煮30 min，四層紗布過濾，藥渣用2000 ml自來水煎煮30 min過濾，合并濾液，濃縮至1 g/ml，高壓滅菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、藥物低、高劑量組，各組10只。模型組皮下注射D-半乳糖150 mg/kg/d，連續(xù)6周，第7周雙側(cè)海馬注射4nmol/L的 Aβ25-35(用0.9%的生理鹽水溶解)1次(具體操作詳見方法1.2.2);對(duì)照組皮下注射等量生理鹽水，連續(xù)6周，第7周雙側(cè)海馬注射等量生理鹽水1次;藥物低、高劑量組皮下及雙側(cè)海馬注射與模型組相同，藥物組開始造模第1天即開始分別給予8 g/kg、24 g/kg旱蓮草水提物灌胃，均為每日1次，連續(xù)8周;對(duì)照組和模型組每天給予等劑量生理鹽水灌胃，連續(xù)8周。各組動(dòng)物每周記錄1次體質(zhì)量，調(diào)整注射劑量。

1.2.2 雙側(cè)海馬注射方法 10%水合氯醛麻醉大鼠后，將其固定于腦立體定位儀上，頭頂皮膚剪毛，碘伏消毒。手術(shù)刀正中矢狀劃開頭皮，剝離骨膜，暴露前囪點(diǎn)(Bergam點(diǎn))，以Bergam點(diǎn)為坐標(biāo)原點(diǎn)，參照Paxinos大鼠腦立體定位圖譜［3］，由 Bergam點(diǎn)向后3.2 mm，中線旁2.2 mm，骨鉆鉆透雙側(cè)顱骨，腦立體定位儀引導(dǎo)下，微量注射器將總量為4 μl的藥物緩慢注入雙側(cè)海馬內(nèi) (每側(cè)2 μl)，深度為4 mm，速度為0.2 μl/min，注射完成后留針5 min。術(shù)畢顱骨上的注射孔用骨蠟封閉、縫合皮膚并給予抗生素處理。

1.2.3 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力測定(避暗實(shí)驗(yàn))

避暗箱內(nèi)有一圓形洞口連接明、暗兩室，暗室底部由銅柵構(gòu)成，通36 V交流電。實(shí)驗(yàn)前，先將大鼠放入避暗箱中適應(yīng)環(huán)境3 min，然后接通銅柵電源，將大鼠放入明室(背對(duì)洞口)，因天生具有嗜暗習(xí)性大鼠會(huì)穿過圓孔進(jìn)入暗室，在暗室遭到電擊后返回明室，從而獲得暗室遭受電擊記憶，如此反復(fù)訓(xùn)練幾次。24 h后開始測試，記錄潛伏期(從大鼠放入明室至第1次進(jìn)入暗室遇到電擊所需時(shí)間)和錯(cuò)誤次數(shù)(5 min內(nèi)大鼠受到電擊的次數(shù))。如果5 min內(nèi)大鼠未進(jìn)入暗室，則潛伏期記為300 s，錯(cuò)誤次數(shù)記為0次［4］。

1.2.4 大鼠海馬病理形態(tài)觀察 大鼠斷頭處死后，在冰凍手術(shù)臺(tái)上迅速取腦，取出一側(cè)海馬組織，40 g/L的多聚甲醛固定 2～5 d。常規(guī)石蠟切片，厚約5 μm，HE染色，觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化。

1.2.5 大鼠海馬中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)的檢測 將取出的另一側(cè)海馬組織放在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血漬，濾紙拭干、稱重，加入9倍體積生理鹽水，用組織勻漿機(jī)把海馬組織進(jìn)一步粉碎，離心機(jī)(3500 r/min)離心15 min，取上清液，即得10%組織勻漿。按照試劑盒說明書，采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量，酶聯(lián)免疫吸附法測定去甲 腎 上 腺 素 (norepinephrine，NE)、多 巴 胺(dopamine，DA)和5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)含量，化學(xué)比色法測定膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(choline acetyl-transferase，ChAT) 和 乙 酰 膽 堿 酯 酶(acetylcholin esterase，AChE)活力。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較用方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，(P＜0.05)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(P＞0.05)為差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 旱蓮草對(duì)老年癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響(避暗實(shí)驗(yàn))

表1顯示，與對(duì)照組比較，模型組的潛伏期明顯縮短，錯(cuò)誤次數(shù)增加(P＜0.01);與模型組比較，藥物低、高劑量組潛伏期明顯延長(P＜0.01)，高劑量組錯(cuò)誤次數(shù)顯著降低(P＜0.01)。

表1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較(±s)

表1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較(±s)

注:與對(duì)照組比較:aP＜0.01;與模型組比較:bP＜0.01;與低劑量組比較:cP＜0.01

組 別 鼠數(shù) 潛伏期(s) 錯(cuò)誤次數(shù)(次) 10 212.16± 8.66 1.60±0.52模 型 組 10 155.85±12.98a 2.60±0.70a低 劑 量 組 10 178.79±13.56b 2.10±0.57高 劑 量 組 10 198.55±12.13bc 1.80±0.79對(duì)照組b

2.2 旱蓮草對(duì)老年癡呆模型大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的影響

圖1顯示，光鏡下觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)如下:對(duì)照組錐體細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，大小一致;與對(duì)照組比較，模型組錐體細(xì)胞排列紊亂，結(jié)構(gòu)不清晰，細(xì)胞脫失明顯;與模型組比較，低劑量組錐體細(xì)胞排列不整齊，細(xì)胞有脫失，高劑量組錐體細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，細(xì)胞脫失較少。

2.3 旱蓮草對(duì)老年癡呆模型大鼠海馬 NE、DA、5-HT含量和ChAT、AChE活性的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬中NE、DA、5-HT含量明顯降低(P＜0.01);ChAT活性明顯下降，AChE活性明顯增加(P＜0.01)。與模型組比較，藥物高劑量組大鼠海馬中NE、DA、5-HT含量明顯增加(P＜0.01)，ChAT活性明顯升高，AChE活性明顯降低(P＜0.01)。藥物低劑量組和模型組之間上述指標(biāo)無明顯改變(P ＞0.05)。

表2 各組大鼠海馬NE、DA、5-HT含量和ChAT、AChE活性檢測結(jié)果(±s)

表2 各組大鼠海馬NE、DA、5-HT含量和ChAT、AChE活性檢測結(jié)果(±s)

注:與對(duì)照組比較:aP＜0.01;與模型組比較:bP＜0.01;與低劑量組比較:cP＜0.01

組 別 NE(μg/g) DA(μg/g) 5-HT(μg/g) ChAT(U/g) AChE(U/mgprot)對(duì) 照 組 0.607±0.096 0.827±0.078 0.700±0.066 131.350±16.257 0.694±0.092模 型 組 0.426±0.074a 0.639±0.084a 0.533±0.094a 89.352± 5.970a 0.936±0.163a低 劑 量 組 0.455±0.112 0.685±0.054 0.580±0.111 91.252± 5.522 0.898±0.115高 劑 量 組 0.536±0.069b 0.754±0.110b 0.650±0.090b 113.950±10.946bc 0.740±0.095bc

圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)改變(HE染色 10×40)

3 討論

中醫(yī)理論認(rèn)為，AD的發(fā)生是由于“腎虛精虧、瘀血阻絡(luò)”。旱蓮草入肝、腎經(jīng)，具有滋陰補(bǔ)腎、涼血止血之功效［5］，符合 AD的治療理論。學(xué)習(xí)記憶水平是AD診斷和治療評(píng)價(jià)中最重要的指標(biāo)［6］。避暗試驗(yàn)最早在1967年由 Jarvik和 Kopp創(chuàng)建，是用來檢測大小鼠被動(dòng)回避學(xué)習(xí)記憶能力的經(jīng)典行為學(xué)方法［7-8］，即潛伏期越長，錯(cuò)誤次數(shù)越少，表明大鼠學(xué)習(xí)記憶能力越好。本實(shí)驗(yàn)中避暗實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，旱蓮草低、高劑量治療組大鼠潛伏期明顯延長，高劑量治療組錯(cuò)誤次數(shù)明顯降低，說明旱蓮草對(duì)老年癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降有一定的治療作用，且采用高劑量治療療效更好。

研究表明［9-10］，學(xué)習(xí)記憶功能減退與海馬的質(zhì)量減輕、神經(jīng)元數(shù)目減少及神經(jīng)元突觸的可塑性改變有關(guān)。AD患者海馬的病變往往早于大腦皮質(zhì)的改變，且隨著病程的延長，病變有加重趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組海馬輪廓模糊，細(xì)胞間界限不清，神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目減少;藥物高劑量組中海馬結(jié)構(gòu)明顯改善，輪廓清晰，錐體細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，細(xì)胞脫失減少，說明旱蓮草對(duì)受到損傷的海馬神經(jīng)元細(xì)胞具有保護(hù)作用，可通過減少神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡起到治療AD的作用。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)是腦內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，對(duì)學(xué)習(xí)記憶有重要的調(diào)節(jié)作用。NE通過軸突聯(lián)系廣泛投射到大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)大腦皮質(zhì)的興奮狀態(tài)，對(duì)覺醒、情緒、認(rèn)知功能和運(yùn)動(dòng)有著廣泛影響［11］。DA具有多種生物學(xué)效應(yīng)，如抑制脂質(zhì)過氧化，減少氧化應(yīng)激損傷，增加腦部血流供應(yīng)，改善腦部神經(jīng)元利用葡萄糖等，與NE一起協(xié)同調(diào)節(jié)機(jī)體的興奮狀態(tài)［12］。5-HT通過調(diào)節(jié)乙酰膽堿(acetyl choline，ACh)在腦組織中的釋放，從而調(diào)節(jié)中樞膽堿能神經(jīng)活動(dòng)，是維持智力的重要神經(jīng)遞質(zhì)［13］。ACh含量的減少程度與 AD的臨床癥狀嚴(yán)重程度密切相關(guān)。ChAT是合成 ACh的關(guān)鍵酶，AChE是降解ACh的關(guān)鍵酶，ChAT和AChE的活性與腦內(nèi)ACh的含量密切相關(guān)，兩者共同維持ACh含量的動(dòng)態(tài)平衡。臨床研究結(jié)果顯示，老年人體內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)的減少直接導(dǎo)致老年性癡呆的形成［11-13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，藥物高劑量組大鼠海馬中NE、DA和5-HT含量均明顯增加，ChAT活性明顯升高，AChE活性明顯降低，說明ACh含量明顯增加。這表明旱蓮草可以改善海馬中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)的代謝，增加海馬中NE、DA、5-HT和ACh的含量，在改善學(xué)習(xí)記憶功能方面發(fā)揮一定的作用。

綜上所述，旱蓮草對(duì)老年癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能有改善作用，其機(jī)制可能與改善AD模型大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)、減少神經(jīng)元細(xì)胞的丟失，改善海馬中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)的代謝、增加海馬中NE、DA、5-HT和ACh的含量有關(guān)。

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Effect of Eclipta on Learning and Memory and Hippocampal Neurotransmitters in the Senile Dementia Model Rats

WANG Ai-mei，GENG Ruo-jun，LI Yi，CHEN Ya-qi，WEI Xiao-ming，ZHANG Shan，ZHANG Ting
(Nanyang Medical College，Henan Nanyang 473061，China)

Objective:To study the effect of Eclipta alba on learning and memory and hippocampal neurotransmitters in Alzheimer’s disease model rats.Methods:Healthy adult SD rats were randomly divided into 4 groups:control group，model group，low dosage group and high dosage group.The model of Alzheimer’s disease was established with subcutaneous injection of D-galactose and microinjection Aβ25-35on bilateral hippocampus.All rats were treated with different drug lasting 8 weeks.Then，the learning and memory ability of rats were determined.The pathomorphological changes of hippocampal neuron were observed.The contents of norepinephrine(NE)、dopamine(DA)、5-hydroxytryptamine (5-HT)and the activities of choline acetyl-transferase(ChAT)、acetylcholin esterase(AChE)on hippocampus were measured.Results:Compared with the model group，the incubation period prolonged and the error times decreased remarkably in high dosage group;the pyramidal cells decreased insignificantly with the basic restoration of cell morphology in high dosage group;the content of NE、DA and 5-HT increased significantly;the ChAT activity increased significantly，the AChE activity decreased significantly in high dosage group.Conclusion:Eclipta alba could raise the learning and memory function of AD rats by the mechanism of improving the hippocampus nerve cells’morph and structure，improving the metabolism of neurotransmitters on hippocampus.

Eclipta alba;Alzheimer’s disease;Learning and memory;NE;DA;5-HT;ChAT;AChE

R285.5

:B

:1006-3250(2016)03-0332-04

2015-07-16

河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(132102310263)

王愛梅(1973-)，女，副教授，從事生理學(xué)教學(xué)與研究。