王 波，李邦印，唐仕歡

(1.中國人民解放軍309醫(yī)院，北京 100091;2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700)

益氣養(yǎng)陰中藥對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)核菌感染小鼠細(xì)胞因子的影響*

王 波1，李邦印1，唐仕歡2

(1.中國人民解放軍309醫(yī)院，北京 100091;2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700)

本項(xiàng)目收集和整理古今防治肺癆的方劑文獻(xiàn)，建立肺癆病證方劑數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用基于熵的復(fù)雜系統(tǒng)聚堆方法，快速篩選出防治肺癆的中藥核心組合，在此基礎(chǔ)上對(duì)篩選出的益氣養(yǎng)陰中藥核心組合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)證明，益氣養(yǎng)陰中藥能在一定程度上改善結(jié)核菌感染的小鼠免疫功能，影響細(xì)胞因子，從而間接說明益氣養(yǎng)陰中藥對(duì)結(jié)核病有一定療效。

益氣養(yǎng)陰;中藥;結(jié)核菌感染;細(xì)胞因子

肺結(jié)核是一種慢性傳染性疾病，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為其發(fā)病與機(jī)體免疫功能降低有關(guān)。中醫(yī)認(rèn)為，肺結(jié)核相當(dāng)于中醫(yī)學(xué)的“肺癆”，本病以陰虛為主，氣陰兩虛貫穿始終。本項(xiàng)目收集和整理古今防治肺癆的方劑文獻(xiàn)，建立肺癆病證方劑數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用基于熵的復(fù)雜系統(tǒng)聚堆方法，快速篩選出防治肺癆的中藥核心組合，并在此基礎(chǔ)上對(duì)篩選出的益氣養(yǎng)陰中藥核心組合進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1 益氣養(yǎng)陰中藥的篩選及制備

1.1 肺癆方劑數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)和建立

查閱《中醫(yī)方劑大辭典》以及當(dāng)代中醫(yī)名家經(jīng)驗(yàn)集，如《施今墨臨床經(jīng)驗(yàn)集》、《孔伯華醫(yī)集》、《中國百年百名中醫(yī)臨床家·朱良春》、《中國百年百名中醫(yī)臨床家·鄧鐵濤》、《中國百年百名中醫(yī)臨床家·任繼學(xué)》等。主要收集和整理了《中醫(yī)方劑大辭典》中以肺癆、癆瘵、尸注、鬼注等為主治的方劑，排除屬于虛勞、暑瘵等中藥方劑。以Epidata 3.1為開發(fā)平臺(tái)，編制計(jì)算機(jī)程序，使得所有方劑涉及的中藥名稱都成為二值變量。錄入者用鼠標(biāo)將某一方劑所涉及的中藥點(diǎn)擊，即把它們賦值為“1”，其他未點(diǎn)擊部分則自動(dòng)賦值為“0”。收錄治療肺癆的方劑477首，其中包括425種常用的中藥，建立肺癆方劑數(shù)據(jù)庫。

1.2 防治肺癆藥物篩選

應(yīng)用數(shù)學(xué)建模方法對(duì)肺癆方劑數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，通過數(shù)學(xué)方法計(jì)算篩選出相關(guān)性較大的治療肺癆的中藥核心組合，根據(jù)無監(jiān)督的熵層次聚類法二期分析篩選結(jié)果，得到候選藥物組合，針對(duì)得到的新組合特點(diǎn)，考慮到犀角、麝香等藥材珍稀貴重，我們選取其中3個(gè)新組合作為一期藥理活性篩選的樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并制備相應(yīng)的樣品。

1.3 候選藥物組合中飲片劑量的確定

為確定候選處方中飲片的劑量及其比例，我們參照2010版《中國藥典》規(guī)定的飲片用量用法項(xiàng)，以規(guī)定的飲片最大劑量進(jìn)行組方。

1.4 飲片購置及鑒定

候選藥物組合中的飲片均購自中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)門診部，并經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)門診部薛慶海副主任藥師鑒定確認(rèn)。

1.5 制備方法

根據(jù)中藥湯劑的常規(guī)煎煮方法，候選處方中鱉甲先煎，其他藥物先浸泡30 min后煎煮40 min，水煎2次、混勻，均濃縮至生藥量1 g/ml，待冷卻后放入－20℃冰箱保存?zhèn)溆?上述處方各取5劑煎煮濃縮，樣品1約65×5=325 ml，樣品2約63×5=315 ml，樣品3約90×5=450 ml)。

表1 用于樣品制備的防治肺癆候選方及其劑量、濃度

2 實(shí)驗(yàn)研究

培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，建立結(jié)核菌感染模型，對(duì)3個(gè)篩選藥方進(jìn)行血清藥理學(xué)檢測(cè)，通過測(cè)定TNF-α、IL-2、INF-γ水平，間接推測(cè)對(duì)治療結(jié)核的療效。

2.1 含藥血清的制備

BALB-C雌性小鼠50只，體質(zhì)量19～21 g。正常飼養(yǎng)3 d后，觀察有無異狀，分為對(duì)照組和3個(gè)藥方組各10只，10只備用。分組后小鼠禁食1夜然后灌胃給藥。給藥分為3個(gè)藥方，給藥劑量為25 g/ kg體質(zhì)量。第2天灌藥2次，間隔4 h，每次進(jìn)藥量0.5 ml/鼠左右。灌藥6 h后，摘取眼球取血(不抗凝)，取血清。血樣品可直接取用或者－20℃保存。

2.2 腹腔巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)［1］

在超凈工作臺(tái)操作。消毒脫頸椎處死BABC雌性小鼠，腹部局部消毒，在無菌條件下注射入2 ml RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液，輕柔10次，解剖腹部，用無菌針管吸取腹腔液混勻，并置于離心管中。常溫狀態(tài)下離心15 min棄上清液。將沉淀用RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液或者PBS充分懸浮再離心，方法同上。棄上清液用培養(yǎng)液懸浮，洗1次，離心收集細(xì)胞沉淀。

用含10%胎牛血清的 lRPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液將沉淀于管底的細(xì)胞充分懸浮，并吹打均勻，取100 ul稀釋 50倍，以含血清培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為109/ml在顯微鏡下計(jì)數(shù)。將上述細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞板，每孔加入200 ul，置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱溫育。培養(yǎng)3 d后，觀察細(xì)胞巨噬細(xì)胞貼壁情況換液，然后繼續(xù)培養(yǎng)2 d后可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

2.3 不同藥方刺激小鼠巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的鑒定

BACB小鼠50只，均為雌性(購自北京華阜康生物科技股份有限公司);卡介苗(Bacillus Calmette Guerin，BCG，50 mg/支，約5×106個(gè)活菌/mg;凍干粉針劑;熱穩(wěn)定性 62%，上海生物制品研究所)。TNF-α、IL-2及 INF-γ ELISA 試劑盒均由美國eBioscience公司生產(chǎn)。

參照普通結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)方法［2］，在強(qiáng)毒室中培養(yǎng) BCG，至對(duì)數(shù)期生長狀態(tài)，取菌即用于感染模型試驗(yàn)。使用前將50 mg BCG經(jīng)10 ml無菌、無熱原的生理鹽水稀釋為2.5×107個(gè)活菌/ml的 BCG懸液。含藥血清及巨噬細(xì)胞感染模型的使用參照韓儉［3］、Skinner［4］等學(xué)者的方法。

表2～4顯示，試驗(yàn)方法:分正常對(duì)照組、BCG模型組及不同藥方組。正常對(duì)照組在無菌操作過程中提取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，離心后計(jì)數(shù)，按每孔加入1×105細(xì)胞進(jìn)行接種，每孔加入等量 BCG，以沒有加BCG的細(xì)胞孔為正常對(duì)照組。簡(jiǎn)單培養(yǎng)后，加入3種不同藥方的血清。加入 BCG沒有進(jìn)行藥物處理的為BCG模型組，同時(shí)加入BCG和藥物的為不同藥方組。每種藥物的劑量分別為1、5、20 ul。每種劑量做5個(gè)平行孔。培養(yǎng)10 h后，取上清液進(jìn)行不同細(xì)胞因子的ELISA測(cè)定，操作方法嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

表2 藥方1對(duì) sIL-2R、TNF-α及INF-γ的影響

表3 藥方2對(duì)sIL-2R、TNF-α及INF-γ的影響

表4 藥方3對(duì)sIL-2R、TNF-α及INF-γ的影響

3 討論

可溶性白介素-2受體 (sIL-2R)是由活化的淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞產(chǎn)生的多肽，是活化淋巴細(xì)胞膜IL-2Rα鏈成分，由細(xì)胞膜脫落進(jìn)入血液循環(huán)中，其增高會(huì)使白介素-2(IL-2)對(duì)人體的保護(hù)作用減弱。sIL-2R影響體內(nèi)IL-2的機(jī)制有2種，一是sIL-2R從細(xì)胞膜脫落后降低細(xì)胞膜表面的膜白介素-2受體(mIL-2R)數(shù)量，使IL-2發(fā)揮作用的目標(biāo)細(xì)胞減少，從而間接調(diào)節(jié) IL-2的功能;二是 sIL-2R和 mIL-2R競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 IL-2，使 IL-2廓清加速，減輕機(jī)體的自分泌效應(yīng)，從而抑制 T細(xì)胞的增殖，減弱 IL-2依賴的免疫應(yīng)答反應(yīng)，使IL-2的效應(yīng)器細(xì)胞-NK細(xì)胞難以保持其自然殺傷活性，故sIL-2R是重要的免疫抑制物質(zhì)。

腫瘤壞死因子 α(TNF-α)為前炎細(xì)胞因子，由單核巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，TNF-α可上調(diào)黏附分子表達(dá)，增加同型和異型細(xì)胞間黏附作用;促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化，增強(qiáng)其吞噬作用;參與肉芽腫形成，從而在結(jié)核桿菌感染中起保護(hù)作用，然而TNF-α也可導(dǎo)致組織壞死和空洞形成。

γ-干擾素(INF-γ)是由 Th1細(xì)胞分泌的免疫調(diào)節(jié)因子，它能激活單核細(xì)胞，使單核細(xì)胞在病灶周圍積聚，控制感染擴(kuò)散，有助于接合肉芽腫形成，同時(shí)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的殺菌作用，在抗結(jié)核免疫中起著重要作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，結(jié)核病患者的血 INF-γ比健康人明顯降低。

本研究 TNF-α的測(cè)定中，模型組與正?？瞻捉M之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但藥方3大劑量組與模型組有可比性。藥方1、3均能有效降低血清 IL-2R的水平(P＜0.05)，提高 IL-2對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用。藥方 3亦能顯著降低血清中的 TNF-α(P＜0.05)，藥方3大劑量組能提高 INF-γ的水平，但與模型組無明顯區(qū)別，其余方藥對(duì)INF-γ影響不大。

肺結(jié)核是一種慢性傳染性疾病，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為其發(fā)病與機(jī)體免疫功能降低有關(guān)。中醫(yī)認(rèn)為，肺結(jié)核相當(dāng)于中醫(yī)學(xué)的“肺癆”，本病以陰虛為主，氣陰兩虛貫穿始終。處方3由黃芪、人參、五味子、山藥、熟地組成，組方原則兼顧益氣養(yǎng)陰，能夠明顯降低細(xì)胞因子 IL-2R水平，降低 TNF-α，從而提高免疫功能，側(cè)面說明抗結(jié)核的作用;而處方1以養(yǎng)陰作用為主，處方2以滋陰潛陽為主，其組方中未充分考慮肺癆氣虛的病機(jī)，對(duì)細(xì)胞因子的作用影響偏小，因而對(duì)免疫功能影響不大。本研究對(duì)藥物的篩選采用了無監(jiān)督的熵層次聚類法，從而也為治療其他疾病選取藥物提供了方法學(xué)的依據(jù)。

［1］高鵬，石磊，張潤玲.小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的提取與鑒別方法探討［J］.中國醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，2004，10(5):400-402.

［2］謝建平，李瑤，樂軍，等.結(jié)核桿菌誘導(dǎo)人巨噬細(xì)胞腫瘤壞死因子受體相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)元件的表達(dá)譜［J］.中華傳染病雜志，2003，21(4):256-259.

［3］韓儉，于紅娟，吳勇杰，等.中藥血清藥理學(xué)方法學(xué)研究—抗菌試驗(yàn)含藥血清處理方案的研究［J］.中國藥理與臨床，2002，18(1):47-48.

［4］Skinner PS，F(xiàn)umey SK，Jacobs MR，et al.A Bone marrowderived murine macrophage model for evaluating efficacy of antimycobacterial drugs under relevant physiological conditions［J］.antimicrob Agents Chenother，1994，38(11):2557-2563.

Effect of Traditional Chinese Medicine of Supplementing Qi and Nourishing Yin on Cytokines in Mice Infected with Experimental Mycobacterium Tuberculosis

WANG Bo1，LI Bang-yin1，TANG Shi-huan2
(1.The 309th Hospital of PLA，Beijing 100091，China;2 Institute of Chinese Materia Medicine，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China)

Both the traditional and modern prescriptions of preventing and curing lung-asthenia are cited as typical examples in the project，and the research aims at developing a new mode to invent some new traditional Chinese medicine to prevent and cure tuberculosis.with the method of the assembly of complicated system based on entropy，the nuclear combination of variey of traditional Chinese medicine is swifly screened out and tested。The test shows that the traditional Chinese medicine(benefiting vital energy and nourishing yin)would to some extent improve the immune capability of the mouses who have infected the tuberculosis acteria and affect some cytokine.Therefore it demonstrates indirectly that it has some curative effect to tuberculosis.

Benefiting Qi and nourishing yin;Chinese medicine;Tuberculosis infection;Cytokine

R285.5

:B

:1006-3250(2016)03-0339-03

2015-07-19

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30873465)-抗癆中藥篩選新模式的研究

王 波(1971-)，男，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病及結(jié)核病的中西醫(yī)結(jié)合臨床與研究。