屠 寒，江漢美，盧金清，林 杰，許俊潔，萬麗娟，周 坤

(湖北中醫(yī)藥大學/湖北省藥用植物研發(fā)中心，武漢 430065)

瀉青丸揮發(fā)性成分分析

屠 寒，江漢美△，盧金清，林 杰，許俊潔，萬麗娟，周 坤

(湖北中醫(yī)藥大學/湖北省藥用植物研發(fā)中心，武漢 430065)

目的:分析瀉青丸揮發(fā)性成分，并從揮發(fā)性成分角度探究其治療兒童抽動穢語綜合征及相關癥狀的物質基礎。方法:分別采用頂空固相微萃取技術(HS-SPME)和水蒸汽蒸餾法(SD)收集揮發(fā)性成分，并聯(lián)合氣相色譜-質譜技術(GC-MS)分析其揮發(fā)性成分的組成和相對含量。結果:采用SD-GC-MS和HS-SPME-GC-MS分別分離出71、100個色譜峰，鑒定出其中49、65種化合物，占分離出成分的81.27%、82.76%;2種方法共鑒定出97種成分，共有成分17種，含量較高的成分為2-烯丙基-4-甲基苯酚、D-檸檬烯、萜品烯、α-蒎烯、(-)-4-萜品醇、芳樟醇等。結論:本試驗對瀉青丸揮發(fā)性成分進行了較全面的分析，能較好地體現(xiàn)復方中揮發(fā)性成分的組成，為瀉青丸揮發(fā)性成分收集及分析提供了方法學基礎，同時也為其治療兒童抽動穢語綜合征提供了理論可行性。

瀉青丸;揮發(fā)性成分;兒童抽動穢語綜合征;水蒸汽蒸餾;頂空固相微萃取;氣相色譜-質譜聯(lián)用技術

瀉青丸又名瀉肝丸，始載于《小兒藥證直訣·肝有風甚》，組方為當歸、龍膽草、川芎、山梔子仁、大黃、羌活、防風，有清瀉肝火之效，用于治療肝熱生風、眼目上視、搐搦急驚［1］。抽動穢語綜合征，亦稱多動性抽動癥，是一種多見于兒童時期的慢性神經精神障礙性疾病，表現(xiàn)出發(fā)聲與多種運動聯(lián)合抽動的障礙［2-3］。本方能有效針對抽動穢語綜合征及其相關癥狀。周麗娟［4］以瀉青丸加減方治療兒童患者，隨訪半年未再復發(fā);也有學者用此方治療小兒癲癇，且能較好改善患者癥狀［1］。瀉青丸組方含多種芳香類中藥，富含揮發(fā)性成分，而揮發(fā)性成分多具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥、抗癲癇和保護腦組織等作用［5］。目前本方尚無揮發(fā)性成分的研究報道。本實驗首次對瀉青丸揮發(fā)性成分進行了系統(tǒng)分析，旨在從揮發(fā)性成分角度探究其治療兒童抽動穢語綜合征及其相關癥狀的可行性，為更進一步研究作鋪墊。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 6890/5973型氣相-質譜-計算機聯(lián)用儀(美國Hewlett-Packard公司);手動頂空固相微萃取裝置(德國IKA公司);65 μm PDMS/DVB萃取纖維頭(美國Supelco公司);頂空瓶(5 ml)、電子調溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司);2000 ml圓底燒瓶、揮發(fā)油提取器、中藥粉碎機等。

1.2 藥材與試劑

瀉青丸由湖北省藥用植物研發(fā)中心自制，組方為當歸、龍膽草、川芎、山梔子仁、大黃、羌活、防風，原料藥材均來源于湖北金藥堂大藥房，經過湖北中醫(yī)藥大學生藥教研室陳科力教授鑒定，分別為傘形科植物當歸 Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根，龍膽科植物龍膽 Gentiana scabra Bge.的干燥根莖，傘形科植物川芎 Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖，茜草科植物梔子 Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果實，蓼科植物藥用大黃 Rheum officinale Baill.的干燥根莖，傘形科植物羌活Notopterygium incisum Ting ex H.T.Chang的干燥根莖和根、傘形科植物防風 Saposhnikovia divaricata (Turcz.)Schischk.的干燥根，符合2010年版《中華人民共和國藥典》標準，蒸餾水、無水乙醚(AR)等。

1.3 方法

取一定量瀉青丸，粉碎后過40目篩即為瀉青丸粉末，密封備用。

1.3.1 SD-GC-MS SD提取法:稱取120 g瀉青丸粉末置于2000 ml圓底燒瓶中，加入10倍量水浸泡3 h后，按照中國藥典2010版附錄XD揮發(fā)油測定法提取其揮發(fā)油。提取完畢后收集揮發(fā)油，取0.1 ml用乙醚稀釋并定容于2 ml容量瓶中密封備用。色譜條件:色譜柱為HP-5MS(30 m×0.25 mm ×0.25 μm)石英毛細管柱;載氣為高純氦氣(99.999%)，載氣流速為0.8 ml/min;進樣口溫度為230℃;升溫程序為起始溫度50℃，以10℃/min升溫至100℃并保留2 min，再以10℃/min升溫至150℃，最后以4℃/min升溫至190℃。進樣量為2 μL，分流比20∶1，溶劑延遲時間為3 min。質譜條件:離子源為EI源，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，電子能量70 eV，倍增管電壓1.2 kV，接口溫度250℃，工作模式為全掃描，質量范圍 35～550 m/z。

1.3.2 HS-SPME-GC-MS HS-SPME萃取法:稱取0.3 g瀉青丸粉末于5 ml頂空瓶中密封，插入裝有65 μm PDMS/DVB纖維頭的手動進樣器，于75℃下預平衡15 min，萃取20 min，隨后將萃取裝置取出立即插入氣相色譜儀進樣口中解吸3 min;色譜條件:色譜柱為HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)石英毛細管柱;載氣為高純氦氣(99.999%)，載氣流速為0.8 ml/min;進樣口溫度為230℃;程序升溫為起始溫度70℃，以10℃/min升溫至80℃并保留10 min，再以4℃/min升溫至190℃;質譜條件同上。

2 結果

表1顯示，按照設定條件進行試驗，經化學工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)及用面積歸一化法從其總離子流圖中計算各組分的百分含量，所測的質譜圖經質譜數(shù)據(jù)庫NIST檢索。采用SD-GC-MS法共分離出71個色譜峰，鑒定出其中的49種化合物，占分離出成分的81.27%;采用HS-SPME-GC-MS法共分離出100個色譜峰，鑒定出其中的65種化合物，占分離出成分的82.76%。

表1 SD-GC-MS和HS-SPME-GC-MS分析瀉青丸揮發(fā)性化學成分Tab.1 Volatile components from Xieqing pill by SD-GC-MS and HS-SPME-GC-MS

化合物數(shù) 化合物中文名 化合物英文名 化學式 相對百分含量(%) SD SPME 28 冰片 Borneol C10H18O 0.44 1.10 29 1，3，3-三甲基二氮環(huán)甲烷 1，3，3-Trimethyldiaziridine C4H10N2 0.58 —30 小茴香醇 2-Fenchanol C10H18O 0.18 31 (-)-4-萜品醇 (-)-4-Terpineol C10H18O 4.63 4.12 32 對甲基苯異丙醇 2-(4-Methylphenyl)propan-2-ol C10H14O — 0.70 33 α-松油醇 α-Terpineol C10H18O 1.73 1.33 34 辛酸乙酯 Ethyl octanoate C10H20O2 — 1.20 35 辛酸 Octanoic acid C8H16O2 — 1.29 36 馬芐烯酮 2-Pinen-4-one C10H14O — 0.28 37 反-松香芹醇 trans-Pinocarveol C10H16O 0.40 —38 1-(1，4-二甲基-3-環(huán)己烯-1-基)乙酮 1-(1，4-dimethyl-3-cyclohexen-1-yl)-ethanon C10H16O 0.14 —39 優(yōu)香芹酮 Eucarvone C10H14O — 1.07 40 (Z)-葛縷醇 (Z)-Carveol C10H16O — 0.77 41 甲基百里香酚醚 Methyl thymol ether C11H16O 2.25 5.48 42 異百里香酚甲基醚 Isothymol methyl ether C11H16O — 1.13 43 2-乙酰基-3，5-二甲基吡嗪 2-Acetyl-3，5-dimethylpyrazine C8H10N2O 0.84 —44 反式-2-癸烯醛 trans-2-Decenal C10H18O — 0.55 45 乙酸龍腦酯 Acetic acid，1，7，7-trimethyl- C12H20O2 — 3.91 46 正十三烷 n-Tridecane C13H28 — 0.72 47 香芹酚 Carvacrol C10H14O — 0.52 48 1，8-二甲基螺［5.5］十一烷 1，8-Dimethylspiro［5，5］undecane C13H20 0.55 —49 二環(huán)［2.2.1］庚-2-醇-1，7，7-三甲基-2-乙酸酯Bicyclo［2.2.1］heptan-2-ol，1，7，7-trimethyl-，2-acetate C12H20O2 1.64 —50 順-2-甲基-5-(1-甲基乙烯基)-2-環(huán)己烯-1-醇乙酸酯cis-2-methyl-5-(1-methylvinyl) cyclohex-2-en-1-yl C12H18O2 — 0.11 51 α-畢澄茄烯 α-Cubebene C15H24 — 0.52 52 苯戊酮 Valerophenone C11H14O — 0.17 53 猛殺威 Carbamult C12H17NO2 0.29 —54 5-丁香油粉 5-Allylguaiacol C10H12O2 — 0.36 55 α-古巴烯 α-copaene C15H24 — 0.63 56 β-欖香烯 β-Elemene C15H24 — 1.41 57 1-環(huán)戊基環(huán)戊烷 1，1'-Bicyclopentyl C10H18 — 0.93 58 反式-2，4-癸二烯醛 (E，E)-2，4-Decadien-1-al C10H16O 1.23 —59 丁香酚 Eugenol C10H12O2 1.38 —60 正十四烷 Tetradecane C14H30 — 0.39 61 β-石竹烯 β-Caryophyllene C15H24 — 3.31 62 Z-3-癸烯-1-醇乙酸酯 3-Decen-1-ol，acetate，(Z)- C12H22O2 1.05 —63 氧化石竹烯 Caryophyllene oxide C15H24O 0.55 —64 對二乙基苯 p-Diethylbenzene C10H14 0.60 —65 羅漢柏烯 Thujopsene C15H24 — 0.35 66 α-石竹烯 α-Caryophyllene C15H24 — 0.50 67 (E)-β-金合歡烯 (E)-β-Farnesene C15H24 — 1.29 68 β-柏木烯 β-cedrene C15H24 — 0.19 69 G-芹子烯 G-selinene C15H24 1.07 0.85 70 吉馬烯 Germacrene D C15H24 — 0.63 71 α-芹子烯 α-selinene C15H24 1.10 4.86 72 L-β-紅沒藥烯 l-β-Bisabolene C15H24 1.53 —73 正十五烷 n-Pentadecane C15H32 — 0.88 74 甜沒藥烯 l-β-Bisabolene C15H24 — 1.22 75 (-)-G-杜松烯 (-)-G-Cadinene C15H24 — 0.83 76 D-杜松烯 D-Cadinene C15H24 — 0.79 77 (+)-α-長葉蒎烯 (+)-α-Longipinene C15H24 — 0.28 78 (2)-香橙烯氧化物 Aromadendrene oxide-(2) C15H24O 0.36 —79 (-)-愈創(chuàng)木醇 Guaiol C15H26O 1.17 —80 柏木腦 Cedrol C15H26O 0.61 —81 桉油烯醇 Spathulenol C15H24O 1.15 0.29

化合物數(shù) 化合物中文名 化合物英文名 化學式 相對百分含量(%) SD SPME 82 鄰苯二甲酸二乙酯 Diethyl phthalate C12H14O4 —0.42 83 馬兜鈴烯 Aristolene C15H24 1.17 —84 (+)-香橙烯 (+)-Aromadendrene C15H24 — 0.09 85 (-)-g-蓽澄茄烯 (-)-g-Cubebene C15H24 — 0.35 86 2-氯-1-(2，4-二甲基苯基)-2-甲基-1-丙酮2-Chloro-1-(2，4-dimethylphenyl)-2-methyl-1-propanone C12H15ClO — 0.45 87 3-丁烯基苯酞 3-Butylidenephthalide C12H12O2 4.51 0.33 88 α-紅沒藥醇 α-Bisabolol C15H26O 0.94 —89 1-乙烯基-2-己烯基環(huán)丙烷 Cyclopropane，1-ethenyl-2-hexenyl-， C11H18 0.96 —90 1-苯基-1，2-丁二醇 1-phenyl-1，2-butanediol C10H14O2 — 0.42 91 2-苯基-1，3-氧硫雜環(huán)戊烷-5-酮 1，3-Oxathiolan-5-one，2-phenyl- C9H8O2S 2.15 —92 環(huán)己烷-二乙酸-1，2-二甲酯 Cyclohexane-1，2-dimethanol，diacetate C14H20O4 1.00 —93 2-烯丙基-4-甲基苯酚 2-Allyl-4-methylphenol C10H12O 18.06 2.67 94 蒽醌-2-羧酸 2-Carboxyanthraquinone C15H8O4 0.53 —95 L-去氫白菖烯 L-Calamenene C15H22 0.76 —96 2-去氧山梨醇五乙酸酯 2-Deoxysorbitol pentaacetate C15H24O10 0.47 —97 1-環(huán)十二烷基乙酮 Ethanone，1-cyclododecyl- C14H26O 0.16—

3 討論

2種方法共鑒定出97種化合物，主要為烯烴類、醛酮類、酯類等，含量較高的共有成分為2-烯丙基-4-甲基苯酚、D-檸檬烯、(-)-4-萜品醇、α-蒎烯、α-芹子烯、芳樟醇等;其中活性成分如D-檸檬烯、α-芹子烯、芳樟醇等能有效針對兒童抽動穢語綜合癥相關癥狀，如D-檸檬烯有鎮(zhèn)靜神經中樞、減輕應激、消除疲勞和祛痰平喘的作用［6］;α-芹子烯有利于人腦中樞神經的安定和抗痙攣作用［7］;芳樟醇對中樞神經系統(tǒng)作用較強，有鎮(zhèn)靜、抗驚厥、降體溫和利于睡眠的功效，對神經也有良好的保護作用［8-9］;冰片有鎮(zhèn)靜、抗驚厥和醒腦開竅之效，能雙向調節(jié)中樞神經系統(tǒng)，改善血腦屏障通透性、活動能力和認知能力［10-12］;欖香烯則能改善和提高機體的免疫功能，對免疫系統(tǒng)具有保護和促進作用［13］。分析結果表明，瀉青丸多種揮發(fā)性成分能有效針對兒童抽動穢語綜合癥相關癥狀，也從側面反映出瀉青丸揮發(fā)性成分部位可能對兒童抽動穢語綜合癥的治療有較大幫助，并揭示其進行藥理藥效研究的必要性。

本試驗采用SD-GC-MS和HS-SPME-GC-MS 2種方法分析瀉青丸揮發(fā)性成分，結果發(fā)現(xiàn)共同鑒定出的成分有17種。盡管SD法與HS-SPME法都能用于揮發(fā)性成分的收集，但二者側重不同，因此最終分析出的成分差異較大。如 SD法提取時間長、溫度較高，主要針對一些高沸點的揮發(fā)性或半揮發(fā)性脂肪酸、醇類及大分子物質等成分;而HS-SPME法條件較溫和，對一些低沸點萜類及低極性的烴類化合物有較高的選擇性。2種分析方法各有其優(yōu)勢，因此將2種方法結合起來共同分析瀉青丸揮發(fā)性成分能更大程度地反映其揮發(fā)性成分組成，有利于其揮發(fā)性成分的深入研究。本研究對闡明瀉青丸有效成分可能有積極意義，為探究某些中藥復方制劑中揮發(fā)性成分的藥效物質基礎提供了方法學借鑒和研究思路。

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Analysis of the Volatile Constituents of Xieqing Pill

TU Han，JIANG Han-mei△，LU Jin-qing，LIN Jie，XU Jun-jie，WAN Li-juan，ZHOU Kun
(Hubei University of Chinese Medicine/Research and Development Center of Medicinal Plant in Hubei Province，Wuhan 430065，China)

Objective:To analyze the volatile components of Xieqing Pill and to explore the material basis that treats children with Tourette's syndrome and its related symptoms from the perspective of the volatile components.Methods:The volatile constituents were extracted with steam distillation(SD)and headspace solid phase micro extraction(HS-SPME)，and the compositions and relative content were confirmed by GC-MS.Results:71 compounds were separated from Xieqing Pill by SD-GC-MS，and 49 of them were identified.The later made up 81.27%of the total amount.And 100 compounds were separated by HS-SPME-GC-MS，and 65 of them were identified.The later made up 82.76%of the total amount.97 volatile components that include 17 common components were identified by the two methods，and the components of higher content are 2-Allyl-4-methylphenol，D-limonene，g-Terpinene，α-Pinene，(－)-4-Terpineol，Linalool，et al.Conclusion: The volatile components from Xieqing Pill are analyzed comprehensively，and the result can reflect the volatile components in Xieqing Pill.The research provides a methodological basis for the collection and analysis of volatile components from Xieqing Pill，and it also provides the theoretical feasibility for treating children with Tourette's syndrome.

Xieqing Pill;Volatile components;Children with Tourette's syndrome;SD;HS-SPME;GC-MS

R289.5

:B

:1006-3250(2016)07-0973-04

2015-12-20

屠 寒(1991-)，男，醫(yī)學碩士，從事中藥及其天然產物活性成分研究。

△通訊作者:江漢美(1964-)，女，武漢人，教授，碩士研究生導師，從事中藥及其天然產物活性成分研究，Tel:027-68890138，E-mail:jianghm_666@163.com。