林 靜，盧 群，楊澤民△

(1.廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院，廣州 510006;2.嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，廣東 梅州 514031)

采用唾液淀粉酶活性指標(biāo)對(duì)脾虛模型大鼠唾液采集方法的評(píng)價(jià)研究*

林 靜1，2，盧 群1，楊澤民1△

(1.廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院，廣州 510006;2.嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，廣東 梅州 514031)

目的:評(píng)價(jià)脾虛模型大鼠唾液采集方法的可行性。方法:采集利血平所致脾虛組大鼠和正常組大鼠各24例酸刺激前后的唾液，其中刺激后的唾液以0.4 mol/l 0.50 cm×0.50 cm檸檬酸濾紙，每隔2.5 min刺激大鼠舌尖30 s，獲得刺激后0～5 min、6～10 min和11～15 min的唾液。Bernfeld法測(cè)定唾液淀粉酶(sAA)活性，計(jì)算sAA活性比值。結(jié)果:脾虛組衰竭明顯，體質(zhì)量比正常組顯著降低;正常組與分組前所有大鼠刺激前和刺激后sAA活性及其活性比值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;脾虛組酸刺激前的sAA活性與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，酸刺激后3個(gè)時(shí)間段的sAA活性和活性比值均比正常組顯著降低。結(jié)論:建立唾液采集方法經(jīng)sAA活性分析，表現(xiàn)出與人較為一致的趨勢(shì)，可以用于脾虛大鼠sAA相關(guān)研究。

唾液淀粉酶;酸刺激;脾虛大鼠;唾液采集

中醫(yī)認(rèn)為“脾開(kāi)竅于口”、“脾主涎”、“脾在液為涎”等，涎為口腔津液，是唾液中較清稀的部分，具有潤(rùn)澤口腔、保護(hù)口腔黏膜的作用，在受到刺激如進(jìn)食時(shí)分泌量增多，以助食物吞咽和消化吸收，脾胃調(diào)和時(shí)唾液分泌適量。在論述脾的病理時(shí)，把“多流涎”作為脾虛證重要的證候之一。另外，從臨床辨證、治療等方面均發(fā)現(xiàn)，脾與唾液關(guān)系密切。唾液淀粉酶(sAA)作為唾液中最為豐富的蛋白［1］，常被用來(lái)作為考察唾液蛋白分泌的主要指標(biāo)。臨床研究顯示，檸檬酸刺激后健康人和脾虛患者sAA活性均增加，但脾虛患者 sAA活性比值比健康人顯著下降，這一結(jié)果作為脾虛證臨床辨證的一項(xiàng)重要參考指標(biāo)，已被廣泛認(rèn)可和驗(yàn)證［2-7］。然而動(dòng)物研究結(jié)果卻顯示，脾虛大鼠和正常大鼠酸刺激后sAA活性均下降，脾虛大鼠 sAA活性比值比正常大鼠顯著降低［8-10］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床結(jié)果存在較大差異的原因，可能與唾液的采集方式和唾液的來(lái)源有關(guān)。臨床常采用自然流出的方式獲得全唾液，而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以采用注射針頭抽取腮腺唾液為主要方法。本研究參考課題組前期建立的人唾液采集方法［11］，采集正常大鼠和脾虛大鼠酸刺激前后的全唾液，比較兩者sAA活性，對(duì)復(fù)制的脾虛大鼠模型和唾液采集方法進(jìn)行評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量230～250 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)SCXK(粵)2013-0020，質(zhì)量合格證號(hào)44005900001102)。

1.2 試劑與儀器

利血平注射劑(廣東邦民制藥有限公司，批號(hào)121112);1%戊巴比妥鈉:稱(chēng)取戊巴比妥鈉(北京化學(xué)試劑公司，德國(guó)進(jìn)口分裝，批號(hào)020402，Q/H82-F158-2002)1.0 g，用蒸餾水溶解定容至100 ml，配制成1%戊巴比妥鈉溶液，室溫保存;檸檬酸(廣東汕頭市西隴化工廠，批號(hào)0601112);可溶淀粉(天津市大茂化學(xué)試劑廠);sAA活性測(cè)定試劑包括磷酸鹽緩沖液、底物溶液、麥芽糖溶液、顯色劑溶液均按參考文獻(xiàn)配制［12］;高速冷凍離心機(jī)(KDC-220HR，中佳ZONKIA)。

1.3 動(dòng)物分組與造模

SD大鼠飼養(yǎng)環(huán)境為 SPF級(jí)隔離環(huán)境(許可證號(hào)SYXK(粵)2012-0125，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證號(hào)00066406)，飼養(yǎng)動(dòng)物房溫度控制在21℃，濕度58%左右。4只一籠分開(kāi)飼養(yǎng)，自由供水與飼料。分組前對(duì) SD大鼠48例進(jìn)行酸刺激前后取樣。取樣后將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為脾虛組和正常組各24只。脾虛組按0.4 mg·kg－1·d－1連續(xù)10 d皮下注射利血平，正常組按每只0.2 ml·d－1皮下注射生理鹽水。第11天采集刺激前后的大鼠唾液樣本，用以檢測(cè)sAA活性。從脾虛組中隨機(jī)選取大鼠10只，第11天繼續(xù)注射利血平至第14天，觀察利血平致大鼠衰竭情況。

1.4 檸檬酸濾紙的制作

0.4 mol/L 0.50 cm×0.50 cm的檸檬酸濾紙制作:配制預(yù)定濃度的檸檬酸溶液，待溶液穩(wěn)定后倒入培養(yǎng)皿中，再將預(yù)定大小的濾紙放入培養(yǎng)皿中，浸泡10 min后取出，50℃烘干或室溫晾干備用。

1.5 唾液樣本的采集與保存

采樣前大鼠禁食不禁水12 h，取樣時(shí)間為7∶30～11∶30 am。所有大鼠稱(chēng)重，1%戊巴比妥鈉溶液按30 mg·kg－1劑量腹腔注射麻醉，平臥固定。

1.5.1 刺激前唾液樣本采集 在大鼠半麻醉狀態(tài)下，用橡皮筋撐開(kāi)大鼠上下顎，將移液槍伸到大鼠舌下，慢慢抽吸舌下腔內(nèi)來(lái)自各唾液腺體的全唾液，采集約100 μL唾液樣本并記錄采樣時(shí)間。

1.5.2 酸刺激后唾液樣本的采集 用備好的檸檬酸濾紙刺激大鼠舌尖30 s，采集酸刺激后分泌的全唾液，間隔2.5 min后再次刺激30 s，將2次采集的唾液放于同一個(gè) EP管中，即獲得刺激后0～5 min的唾液;再用相同的方法分別獲得刺激后6～10 min以及11～15 min的唾液，分別記錄3個(gè)EP管內(nèi)的唾液量。

1.5.3 唾液樣本的保存 將采集的酸刺激前后唾液樣本4℃、10000 rpm/min，離心5 min去掉黏蛋白，將上清轉(zhuǎn)移至另一干凈的 EP管，－20℃保存待測(cè)活性。

1.6 Bernfeld法測(cè)定大鼠唾液sAA活性

參照文獻(xiàn)［12］方法稍加調(diào)整，取 50倍稀釋的唾液樣本0.5 ml加至含1 ml淀粉溶液中，37℃水浴3 min，加入 1 ml 3，5-二硝基水楊酸顯色 3 min，再100℃水浴5 min后用流水冷卻，加9.0 ml蒸餾水稀釋。用S22可見(jiàn)光分光光度計(jì)(上海棱光)測(cè)定各管波長(zhǎng)540 nm下的吸光度值，通過(guò)麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)以及各管的吸光度值，計(jì)算出各管的 sAA酶活性(U/ml)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以酸刺激前后的 sAA活性計(jì)算兩者的比值，sAA活性比值=酸刺激后sAA活性/酸刺激前sAA活性。采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，酸刺激前后比較采用配對(duì) t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;組間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體質(zhì)量情況

圖1顯示，皮下連續(xù)注射10 d后，脾虛組大鼠體質(zhì)量明顯下降，正常組大鼠體質(zhì)量則平緩上升，分組前2組大鼠體質(zhì)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，10 d后脾虛組大鼠體質(zhì)量顯著降低(P＜0.01)。

2.2 大鼠一般情況

脾虛組大鼠在利血平注射的第2天，部分大鼠出現(xiàn)眼瞼下垂、瞳孔縮小;第3天部分大鼠大便溏稀，胃腸道活動(dòng)明顯加快。連續(xù)注射11 d后，脾虛組大鼠扎堆、弓背、活動(dòng)減少、雙目懶睜、大便溏軟、毛色不澤、食量下降，正常組大鼠毛色光澤、活動(dòng)和進(jìn)食均無(wú)異常。

脾虛組中隨機(jī)選取10只大鼠，在連續(xù)注射利血平的第13天死亡2只，第14天死亡4只，第14天停止注射，第15天繼續(xù)死亡2只，僅存活2只。死亡大鼠過(guò)度衰竭，皮肉快速腐爛。

2.3 各組刺激前后sAA活性和活性比值比較

表1顯示，正常組大鼠與分組前全體大鼠酸刺激前后sAA活性組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，并呈現(xiàn)一致的變化趨勢(shì)，即酸刺激后3個(gè)時(shí)間段的sAA活性比刺激前顯著增加，而刺激后3個(gè)時(shí)間段的 sAA活性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);脾虛組大鼠刺激前 sAA與前2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，刺激后3個(gè)時(shí)間段的sAA活性比刺激前雖有升高趨勢(shì)但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，并比前2組顯著降低(P＜0.05)。

圖2顯示，正常組大鼠與分組前全體大鼠刺激后3個(gè)時(shí)間段的sAA活性比值組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，并呈現(xiàn)一致的變化趨勢(shì)，即數(shù)值都在3～4之間，且刺激后3個(gè)時(shí)間段的 sAA活性比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。然而脾虛組大鼠刺激后3個(gè)時(shí)間段的 sAA活性比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，都在1.2～1.3之間，但都顯著低于前2組(P＜0.05)。

表1 各組大鼠酸刺激前后sAA活性(±s，U/ml)

表1 各組大鼠酸刺激前后sAA活性(±s，U/ml)

注:與本組刺激前比較:＊＊P＜0.01;與脾虛組同一采集時(shí)期比較:#P＜0.05，##P＜0.01

組11～15 min sAA分 組 前 全 體 大 鼠 48 34.63±4.15 73.31±7.05＊＊# 86.17±7.71＊＊## 87.26±7.72＊＊##別 鼠數(shù) 刺激前sAA 刺激后0～5 min sAA 刺激后6～10 min sAA 刺激后脾 虛 組 24 40.15±6.21 46.42±5.87 50.54±8.39 50.69±9.70正 常 組 24 27.00±3.75 70.79±8.47＊＊# 78.31±8.93＊＊# 80.12±9.81＊＊#

圖2 分組前全體大鼠、脾虛組和正常組的sAA活性比值

3 討論

利血平致脾虛模型是脾氣虛證的常用造模方法。利血平屬于外周交感神經(jīng)阻滯藥，能夠耗竭動(dòng)物體內(nèi)的兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)，使動(dòng)物出現(xiàn)交感神經(jīng)功能低下，副交感神經(jīng)功能相對(duì)亢進(jìn)，引發(fā)機(jī)體代謝功能下降，如體質(zhì)量減輕、腹瀉、耐寒力差等［13］，動(dòng)物所表現(xiàn)的這一系列癥狀和體征與中醫(yī)脾氣虛證患者有相似之處。本研究選擇6～7周齡、體質(zhì)量250 g左右大鼠，按0.4 mg·kg－1·d－1的利血平濃度皮下連續(xù)注射10 d成功復(fù)制出脾虛大鼠模型。部分文獻(xiàn)［8-10］建議選擇(300 g±20)g大鼠，但這種大鼠飼養(yǎng)時(shí)間超過(guò)10周，可能已經(jīng)趨于老齡化，代謝速度減慢且個(gè)體差異大，會(huì)影響唾液和 sAA的分泌;對(duì)于藥物濃度過(guò)低會(huì)延長(zhǎng)成模時(shí)間［14］，過(guò)高雖然可以縮短成模時(shí)間，但會(huì)導(dǎo)致大鼠過(guò)早死亡［15］。本研究選擇了一個(gè)適中的藥物濃度，獲得了較好的效果，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)即使是一個(gè)適中的藥物濃度，注射時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的大量死亡。

脾虛證患者檸檬酸刺激前后的 sAA活性比值較正常人顯著下降，這一結(jié)果已被廣泛認(rèn)可并驗(yàn)證。本研究結(jié)果顯示，正常組大鼠酸刺激后sAA活性顯著增加，而脾虛組大鼠增加并不明顯，且脾虛組大鼠刺激前后的sAA活性比值比正常組大鼠顯著降低。該結(jié)果與脾虛證患者存在一致的趨勢(shì)。

Ekstr?m通過(guò)外科解剖將導(dǎo)管插入腮腺腺管口研究大鼠sAA對(duì)味覺(jué)刺激的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)大鼠接受抗壞血酸刺激后其腮腺 sAA活性顯著增加。但是本研究結(jié)果與李燦［8］、林傳權(quán)等［9-10］報(bào)道的結(jié)果不一致。他們通過(guò)直接從唾液腺的開(kāi)口處采集腮腺分泌唾液的方式，研究10%的醋酸刺激對(duì)大鼠唾液分泌的影響，結(jié)果顯示脾虛大鼠酸刺激前后唾液sAA活性比值比正常組大鼠顯著降低，而2組大鼠酸刺激后sAA活性都顯著降低。對(duì)于大鼠 sAA活性對(duì)刺激物的反應(yīng)存在差異的原因，可能與刺激物的種類(lèi)、唾液來(lái)源、采集方式以及大鼠的周齡選擇等有關(guān)。本研究參考臨床脾虛證患者唾液采集方法，選擇成年250 g左右大鼠采用適合大鼠舌頭大小的 0.4 mol/L 0.50 cm×0.50 cm的檸檬酸濾紙，間隔2.5 min刺激大鼠舌尖30 s，以5 min作為一個(gè)時(shí)間段，采集刺激后3個(gè)時(shí)間段的全唾液標(biāo)本，酸刺激前后sAA活性及其比值分析結(jié)果與臨床脾虛證患者的sAA活性結(jié)果呈現(xiàn)一致的變化趨勢(shì)。因此，本研究的唾液采集方法能夠很好地反映大鼠對(duì)酸刺激的應(yīng)激水平，具有簡(jiǎn)便、無(wú)損傷、結(jié)果可靠等特點(diǎn)，非常適合用于以sAA活性作為觀測(cè)指標(biāo)的脾虛模型動(dòng)物的相關(guān)研究。

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Evaluation of Saliva Collection Method in Rat Model of Spleen-deficiency by Using Salivary Alpha-amylase Activity Index

LIN Jing2，LU Qun1，YANG Ze-min1△
(1.School of Basic Courses，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China; 2.Medical College of Jiaying University，Guangdong Meizhou 514031，China)

Objective To evaluate the feasibility of saliva collection method in rats with spleen-deficiency.Method Salivary samples from spleen-deficiency rats(n=24)induced by reserpine and normal rats(n=24)were collected before and after acid stimulation.Stimulated saliva of 0-5 min，6-10 min and 11-15 min were collected by putting 0.4 mol/l 0.50 ×0.50 cm of citric acid filter paper at the tongue tip 30 s every 2.5 min.Salivary alpha-amylase(sAA)activity was determined by the Bernfeld method，and sAA activity ratio was calculated.Result:Spleen-deficiency rats collapsed severely and their weight showed significantly lower than the normal rats.The sAA activity and sAA activity ratios had no significant difference between normal rats and all rats before be grouped.There was no significant difference in unstimulated sAA activity between spleen-deficiency and normal rats，while spleen-deficiency rats had lower sAA activity and sAA activity ratio in stimulated saliva of three time periods than normal rats.Conclusion Saliva collection method established by the present study，by which sAA activity and sAA activity ratio in rat showed similar trend with that of human，could be used in the research of spleen-deficiency rats related with sAA.

Salivary alpha-amylase;Acid stimulation;Spleen-deficiency rats;Saliva collection

R285.5

:B

:1006-3250(2016)07-0909-03

2015-11-21

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81102703)-基于AMY1基因拷貝數(shù)變異、N-糖基化和β-腎上腺素能受體介導(dǎo)的脾虛證唾液淀粉酶活性改變機(jī)制的研究;廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013A032500005)-脾-物質(zhì)代謝關(guān)聯(lián)”新假說(shuō)的miRNA物質(zhì)基礎(chǔ)及“從脾論治“代謝性疾病的分子機(jī)制研究”;廣東藥學(xué)院科技處-附屬第一 醫(yī) 院 聯(lián) 合 自 然 科 學(xué) 培 育 基 金 項(xiàng) 目 (GYFYLH201303，GYFLH201313)

林 靜(1989-)，女，廣東人，醫(yī)學(xué)碩士，從事生物化學(xué)和分子生物學(xué)的研究。

△通訊作者:楊澤民(1979-)，男，湖南人，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，醫(yī)學(xué)博士，從事中西醫(yī)結(jié)合疾病機(jī)制研究，Tel:020-39352192，E-mail:yzm310200@gmail.com。