牟迪，夏偉，朱子健，張宇輝，朱慶虎

（1.哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，黑龍江哈爾濱150001；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院，北京海淀100193）

豬病防制與保健

輪狀病毒疫苗研究進展

牟迪1，夏偉1，朱子健2，張宇輝1，朱慶虎1

（1.哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，黑龍江哈爾濱150001；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院，北京海淀100193）

輪狀病毒（Rotavirus,RV）是引起多種幼齡動物以及嬰幼兒腹瀉的重要病原體。輪狀病毒最早是Mebus在1969年從犢牛糞便中發(fā)現(xiàn)的，1973年澳大利亞科學(xué)家Bishop等在患有嚴重腹瀉嬰兒的十二指腸黏膜及糞便中發(fā)現(xiàn)了一種新的病毒粒子[1]。在非洲和亞洲的撒哈拉以南地區(qū)，據(jù)調(diào)查超過三分之一的嬰幼兒腹瀉及胃腸炎疾病由輪狀病毒引起，每年導(dǎo)致50萬～60萬嬰幼兒死亡[2-3]。歐洲和美國預(yù)防和治療該類疾病的直接和間接醫(yī)療費用高達數(shù)10億美元[4]。自從1974年英國Woode和Bridge首次從豬體分離出輪狀病毒后，緊接著輪狀病毒引起的仔豬腹瀉相繼被澳大利亞、北愛爾蘭、美國、法國等國家報道，輪狀病毒在豬中的傳播開始被世界各國重視。我國首次出現(xiàn)豬輪狀病毒（Porcine Rotavirus, PRV），是1982年闕玲玲于中國臺灣發(fā)現(xiàn)，之后江蘇、山東等地也陸續(xù)報道[5]。不同地區(qū)感染輪狀病毒的普遍性說明，單純靠提高衛(wèi)生水平對輪狀病毒的感染率和發(fā)病率影響不大。此外，雖然輪狀病毒感染引起的臨床癥狀可用一些藥物來緩解，但暫時還沒有研制出用于治療輪狀病毒感染的特效藥物[6]。因而，加強對輪狀病毒感染機制的研究，為預(yù)防輪狀病毒感染開發(fā)安全有效的疫苗具有必要性。

1 輪狀病毒的病原學(xué)特征和血清型

輪狀病毒（Rotavirus,RV）屬呼腸病毒科，輪狀病毒屬，病毒無囊膜，呈二十面體對稱，直徑為65～75 nm。在電子顯微鏡下觀察，輪狀病毒是帶有短纖突且外緣光滑近似輪狀的粒子。由外層衣殼（VP7和VP4）、中間衣殼（VP6）和內(nèi)層衣殼（VP2）3部分組成病毒粒子。通常只有包裹3層衣殼蛋白的粒子才具有傳染性[7]。中央為一個致密的六角形核心，直徑37～40 nm，即芯髓。被內(nèi)層衣殼、RNA依賴性RNA聚合酶（VP1）及修飾酶（VP3）包裹的病毒基因組，由11個不連續(xù)的dsRNA組成，編碼6個結(jié)構(gòu)蛋白（VP1～VP4/VP6/VP7）和6個非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP1～NSP6），除第11個節(jié)段含有兩個開放閱讀框并編碼NSP5和NSP6外，其他每節(jié)段分別編碼一種蛋白[8]。不同的輪狀病毒毒株在宿主體內(nèi)共感染，可能會造成11個基因節(jié)段發(fā)生重配，導(dǎo)致新的輪狀病毒變異株的產(chǎn)生。

輪狀病毒編碼的VP6蛋白位于中間衣殼，因其具有高度保守性，常稱之為群抗原或診斷抗原，根據(jù)其抗原性的不同可以將輪狀病毒分為A～G 7個種群，感染人的輪狀病毒大多屬于A群，根據(jù)結(jié)構(gòu)蛋白VP4和VP7可以把RV分成G、P兩個血清型，包括24個G血清型和33個P血清型[9]，G血清型分型取決于VP7中和抗原，而P血清型分型取決于VP4血凝素抗原。目前，G1P[8]、G2P[4]、G3P[8]、G4P[8]和G9P[8] 5種血清型的輪狀病毒是危害人類健康最為重要的毒株[10]，其中G1P[8]和G3P[8]型在我國最為常見。

2 輪狀病毒感染的病理變化

RV感染后主要侵犯空腸的微絨毛上皮細胞，使其凋亡。病變細胞脫落，微絨毛變短、變鈍。原位于隱窩底部擁有分泌功能的細胞取而代之。小腸功能喪失源于以上病變，水與電解質(zhì)分泌增加，吸收減少，引起分解。另外小腸微絨毛上皮細胞功能出現(xiàn)障礙，降低雙糖酶分泌，乳糖起不到被消化吸收的作用，在腸道內(nèi)積聚從而誘發(fā)滲透性腹瀉。仔豬感染輪狀病毒的病變主要限于消化道，胃弛緩，內(nèi)充滿凝乳塊和乳汁，小腸壁變薄，呈半透明狀，腸內(nèi)容物呈漿性或水樣，灰白或灰黑色，腸系膜淋巴結(jié)水腫，膽囊腫大，腸絨毛萎縮。

起初認為，嬰幼兒及動物感染輪狀病毒僅限于胃腸道內(nèi)，但隨著深入研究得出，輪狀病毒感染后不僅破壞腸道黏膜系統(tǒng)，同時全身多個器官可以被侵犯源于感染引發(fā)的病毒血癥，更可導(dǎo)致感染幼齡動物死亡的后果。RV易感的腸外器官與組織主要有支氣管與肺泡、心、肝、腎、胰、膽等。Gilger等研究表明，嬰兒時期的肝臟損害與輪狀病毒感染有緊密關(guān)聯(lián)。此外，感染輪狀病毒后，根據(jù)肝組織內(nèi)RV-RNA強陽性染色較密集的分布，結(jié)合肝細胞濁腫及明顯脂肪病變等病理改變，提示輪狀病毒擁有嗜肝組織的能力。姚英民等在一例RV感染患兒的腦脊液、腹水和肺組織中均檢出RV，病理改變除典型RV胃腸炎外，以肺腦病理改變?yōu)橹Q，可見水腫、瘀血、出血、大量組織和淋巴細胞浸潤[11]。任小梅等報道276例患兒中69例患兒在腹瀉的同時合并有呼吸道感染，其中上呼吸道感染、支氣管炎和支氣管肺炎均有發(fā)生，通過胸片檢查可以看出肺紋理增粗，小斑片或條索狀陰影[12]。

3 輪狀病毒檢測方法

3.1 抗原檢測

分離培養(yǎng)是輪狀病毒病原檢測的經(jīng)典方法。1980年Wyatt等建立了人輪狀病毒W(wǎng)a株分離培養(yǎng)技術(shù)檢測方法，將毒株在無菌仔豬中連續(xù)傳代11代后轉(zhuǎn)接到非洲獼猴腎細胞中培養(yǎng)獲得成功[13]。2012年庫旭鋼等采集腹瀉仔豬糞便后接種于MA-104細胞，分離鑒定后判定為RV[14]。由于分離病毒對培養(yǎng)條件要求高，分離時間較長，且操作過程繁瑣，耗費較多，不適于在基層推廣應(yīng)用。免疫熒光技術(shù)檢測輪狀病毒是把發(fā)病早期的空腸或內(nèi)容物制成壓片，用輪狀病毒熒光抗體染色，可通過鏡下觀察腸絨毛上皮的胞漿區(qū)域是否檢測到熒光。

在分子生物學(xué)檢測方法中，RT-PCR是目前應(yīng)用最多的快速診斷方法，具有操作簡單、診斷快速、敏感性和特異性高等特點。2006年Song等應(yīng)用多重RT-PCR方法檢測157份仔豬臨床腹瀉病料，其中RV的陽性率為13.2%[15]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，熒光定量RT-PCR技術(shù)在RV的診斷上也得到了應(yīng)用。通過與普通RT-PCR方法進行對比分析后發(fā)現(xiàn)，熒光定量RT-PCR的靈敏度比普通的RT-PCR敏感性要高100倍。熒光定量RT-PCR檢測技術(shù)靈敏度與特異性都比較高，可對樣品進行快速、大量檢測。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)能在60～65℃情況下，經(jīng)過具備鏈置換特征的Bst DNA聚合酶實現(xiàn)靶序列的擴增，只需要固定溫度條件就能擴增出目的核酸片段，經(jīng)過Screen GreenⅠ染色或者離心沉淀觀測結(jié)果，與常規(guī)RT-PCR相比，可以省略模板的熱變性、溫度的循環(huán)、電泳條帶及紫外線燈觀測等一系列過程。基于核酸序列的擴增技術(shù)（Nucleic acid sequence-based amplification,NASBA）是RNA體外擴增技術(shù)的一種，可以理解為RNA-PCR。寇曉霞等研究顯示，NASBA能檢出最高核酸水平為50 pg，RT-PCR能檢測出最高核酸水平為100 pg[16]。若標本中含有靶細菌和病毒時，NASBA-ELISA系統(tǒng)就會產(chǎn)生非特異性信號。經(jīng)過研究進一步證實，利用該系統(tǒng)檢測快速、簡便，具有靈敏度高、特異性強的優(yōu)點。

3.2 抗體檢測

ELISA檢測方法的優(yōu)點在于它的操作過程比較簡單、便捷，重復(fù)性比較高，高通量、價格低等。1985年，ELISA被WHO（世界衛(wèi)生組織）推薦為人類輪狀病毒（HRV）的檢測方法。目前，廣泛應(yīng)用于RV檢測的是雙抗體夾心ELISA法，可根據(jù)檢測目的的不同設(shè)計包被抗體與檢測抗體。相對于過去采用的高效價抗血清和多克隆抗體，單克隆抗體技術(shù)不僅克服了體外培養(yǎng)病毒的限制，減少了對高效價免疫血清的需求，提高了特異性及靈敏度，還可以進行血清分型和毒株鑒別，適用于臨床大規(guī)模檢測和流行病學(xué)調(diào)查。Zhu等以原核表達的RV VP7蛋白作為診斷抗原，建立了檢測RV抗體的間接ELISA方法[17]。Barman等對位于印度Assam地區(qū)的528份豬血清樣品進行了間接ELISA檢測，其中RV陽性率占51.1%，高于豬傳染性胃腸炎病毒（39.4%）和豬流行性腹瀉病毒（21.2%），約13.6%的豬只血清樣品中含有以上3種病毒的抗體[18]。

乳膠凝集試驗檢測輪狀病毒具備很多優(yōu)點，如操作簡便、檢測時間短、對試驗儀器要求不高等。對檢測結(jié)果的判定只需2～3 min，可進行快速篩查，是適合應(yīng)用于基層檢疫部門的檢測方法，但如果采集了含有較多油脂或其他懸浮物的腹瀉樣品，不能徹底離心，就會形成影響檢測的非特異性凝集物，造成結(jié)果不準確。有國外的試驗顯示，乳膠凝集試驗檢測糞便樣品的靈敏度為87%，特異性為73%～80%[19]。膠體金免疫技術(shù)無需特殊儀器，無污染，價格低廉，結(jié)果直觀，是目前檢測輪狀病毒最簡便、最快速的方法。研究顯示，將膠體金顆粒用輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP6單克隆抗體標記，選用RV多克隆抗體作為檢測線，羊抗鼠IgG作為質(zhì)控線，成功地制備了檢測輪狀病毒的膠體金試紙條[20]。

4 輪狀病毒疫苗的研究進展

4.1 人輪狀病毒疫苗

作為威脅人類和動物健康的第二大腹瀉疾病，輪狀病毒成為引起全世界人類和動物嚴重腹瀉和脫水的主要誘因。發(fā)展中國家與發(fā)達國家在輪狀病毒感染方面具有類似情況，輪狀病毒腹瀉的發(fā)病率不會隨著公共衛(wèi)生條件的改善而減少。營養(yǎng)狀況對發(fā)病危險的重要性也遠低于細菌性腹瀉。另外，流行病學(xué)的研究表明自然感染輪狀病毒后，隨后感染的發(fā)病率和嚴重程度呈下降趨勢。因此，預(yù)防輪狀病毒感染行之有效的方法是疫苗。

目前，人輪狀病毒疫苗主要以口服活疫苗為主?？诜钜呙缭谟行У卣T導(dǎo)局部黏膜免疫后，能產(chǎn)生抗體和細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，具有同天然感染作用途徑相一致的特點。不同國家和地區(qū)單價疫苗的保護性不同，表明輪狀病毒各血清型之間交叉保護性差。通過使用多價疫苗或各國各地區(qū)根據(jù)本地流行株研制的有針對性的疫苗可以預(yù)防輪狀病毒。1998年美國正式批準了一種由人-恒河猴輪狀病毒重配的四價疫苗（Rota shield）上市，雖然該疫苗在各地區(qū)的保護率達50%以上，但是后來流行病學(xué)協(xié)會發(fā)現(xiàn)該疫苗能增加部分兒童出現(xiàn)腸套疊的幾率，從而導(dǎo)致該疫苗在1999年6月被停用[21]。近年來，正是傳統(tǒng)疫苗自身存在的缺陷，使得人輪狀病毒基因工程疫苗也展開研究。被看作第3代疫苗的DNA疫苗，從1992年開始作為一種新型疫苗迅速發(fā)展。國內(nèi)外對輪狀病毒DNA疫苗的研究都有報道。周旭等將輪狀病毒G1型Wa株的VP7基因克隆到真核表達載體pCDNA3 1（+）中，經(jīng)Sepharose CL4B柱層析，獲得純化的質(zhì)粒，通過肌肉注射和皮下注射，免疫BALB/c及F1小鼠后，產(chǎn)生了抗輪狀病毒W(wǎng)a抗體。其中F1小鼠的抗體應(yīng)答高于BALB/c小鼠，肌肉注射優(yōu)于皮下注射[22]。

4.2 動物輪狀病毒疫苗

滅活疫苗不存在毒力返強的危險，使用相對安全，方便運輸和儲存，但是由于不能保證足夠的抗原含量，通常導(dǎo)致免疫效果不佳。史月明利用我國豬輪狀病毒分離毒株JL94株制備油乳劑滅活疫苗[23]。2008年姜英等將G1、G2、G3、G4四價輪狀病毒滅活疫苗免疫小鼠，能刺激機體產(chǎn)生針對輪狀病毒的特異性IgG抗體，但IgA應(yīng)答較弱，表明該四價輪狀病毒滅活疫苗具備很好的免疫原性[24]。張儉偉等將牛輪狀病毒（CHLY株）進行甲醛滅活，并分別制備油乳佐劑疫苗和鋁膠佐劑疫苗，免疫小鼠和家兔，結(jié)果表明在小鼠和家兔體內(nèi)均檢測到高水平的特異性血清抗體，并且在母兔初乳仍可檢測到抗體的存在[25]。

弱毒疫苗在預(yù)防豬RV感染上受到世界各國的廣泛應(yīng)用，輪狀病毒（RV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）是引起仔豬病毒性腹瀉的主要病原，往往不單由其中一種引起發(fā)病，混合感染的情況很常見，故為了達到更好預(yù)防仔豬腹瀉的效果，通常與TGEV、PEDV其中1種或2種病毒一起制成聯(lián)合弱毒苗。國外疫苗有美國RV弱毒苗、RV-TGEV二聯(lián)弱毒苗和俄羅斯的三聯(lián)弱毒苗。由哈爾濱獸醫(yī)研究所研制的豬傳染性胃腸炎、豬輪狀病毒二聯(lián)凍干苗，經(jīng)過多年的現(xiàn)地實踐證明，此苗用于兩種豬病毒性腹瀉的預(yù)防，安全有效。此外，哈爾濱獸醫(yī)研究所研制的豬流行性腹瀉、豬傳染性胃腸炎和豬輪狀病毒三聯(lián)活疫苗于2015年3月問世，填補了我國豬用RV疫苗的空白。主動免疫接種后7 d產(chǎn)生免疫力，免疫期為6個月。妊娠母豬于產(chǎn)仔前40 d后海穴位（即尾根與肛門中間凹陷的小窩部位）接種，20 d后二免，仔豬被動免疫的免疫期至斷奶后7 d。

對于亞單位疫苗的研究，現(xiàn)在已經(jīng)在大腸桿菌等表達系統(tǒng)中成功的表達了輪狀病毒不同的結(jié)構(gòu)蛋白，使得不同結(jié)構(gòu)蛋白的作用以及亞單位疫苗的研制成為可能。亞單位疫苗具有儲存、運輸?shù)冗^程當中效價很穩(wěn)定、無副作用等多種優(yōu)點。而核酸疫苗由于兼具亞單位疫苗的安全性，以及弱毒疫苗的有效性，能同時誘導(dǎo)機體產(chǎn)生體液和細胞免疫應(yīng)答，能發(fā)揮一種疫苗預(yù)防多種傳染病的作用，目前還尚在研究階段，應(yīng)用于防制傳染病的實踐還需更深入研究。在轉(zhuǎn)基因疫苗的研究中，已經(jīng)有許多人類和動物蛋白基因轉(zhuǎn)入到植物中表達蛋白，來獲得抗原。張二芹等成功地將豬輪狀病毒內(nèi)殼蛋白VP6基因轉(zhuǎn)化到煙草中，從而奠定制備新型豬輪狀病毒轉(zhuǎn)基因植物疫苗的基礎(chǔ)[26]。

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（編輯：柳青）

S858.285.3

A

1002-1957(2016)04-0089-03

2016-06-04

牟迪（1988-），男，吉林伊通人，碩士，主要從事畜用疫苗技術(shù)服務(wù)工作.E-mail：281032446@qq.com