宗可昕，張晶，陳云雨，范卓文，司書毅

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PLK1 PBD靶向抗腫瘤抑制劑的篩選及活性研究

宗可昕*，張晶*，陳云雨，范卓文，司書毅

【摘要】

目的篩選靶向 PLK1 PBD 的抗腫瘤小分子抑制劑，對其抗腫瘤效果進(jìn)行體外評價，為抗腫瘤藥物提供先導(dǎo)化合物。方法利用熒光偏振模型初篩 PLK1 PBD 抑制劑；通過MTT 法尋找初篩陽性化合物的敏感細(xì)胞系；利用流式細(xì)胞儀檢測化合物對細(xì)胞周期和凋亡的影響；通過分子對接技術(shù)探討化合物與 PLK1 PBD 結(jié)合方式；利用劃痕實(shí)驗(yàn)測定化合物對腫瘤細(xì)胞遷移的影響。

結(jié)果從 20 000 個化合物中篩選得到活性化合物 1097C11，MTT 結(jié)果顯示其能抑制多種腫瘤細(xì)胞系的增殖；流式細(xì)胞儀檢測其能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，在 25 μmol/L 時，晚期凋亡達(dá)到 77.02%；能導(dǎo)致細(xì)胞G1/M 期阻滯，分子對接結(jié)果顯示 1097C11 與 PLK1 PBD 結(jié)構(gòu)域具有良好的親和性，細(xì)胞遷移結(jié)果顯示 1097C11 能夠抑制 HCT-116 細(xì)胞的遷移，在 20 μmol/L時，遷移率低至 33.4%。

結(jié)論化合物 1097C11 具有較好的抗腫瘤活性，并有望成為靶向 PLK1 PBD 的抗腫瘤先導(dǎo)化合物。

【關(guān)鍵詞】熒光偏振；抗腫瘤藥；保羅樣激酶 1 抑制劑

www.cmbp.net.cn中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2016, 11(1):13-20

作者單位：150040 哈爾濱，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥分教研室（宗可昕、范卓文）；100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所國家新藥（微生物）篩選實(shí)驗(yàn)室（宗可昕、張晶、陳云雨、司書毅）；130022長春，中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所（陳云雨）

*同為第一作者

近 20 年，惡性腫瘤在我國人口死因中所占的比例與日俱增，現(xiàn)今雖然有很多抗腫瘤藥物，尚存在選擇性差、毒副作用強(qiáng)、易產(chǎn)生耐藥性等缺點(diǎn)，靶向抗腫瘤小分子抑制劑可以達(dá)到高選擇性、低毒性的治療效果，從而克服傳統(tǒng)藥物的缺點(diǎn)，使抗腫瘤藥物研究進(jìn)入了一個嶄新的階段。

細(xì)胞的周期是由不同激酶調(diào)控的，其中保羅樣激酶（polo-like kinases，PLKs）是廣泛存在于真核生物中的由絲/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的 N 端和具有調(diào)節(jié) PLKs 激酶活性及亞細(xì)胞動態(tài)定位的特征性的 C 端結(jié)構(gòu)域組成的一類高度保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶[1-3]，越來越引起人們的重視。PLK 家族成員包括 PLK1、PLK2、PLK3、PLK4 和 PLK5。家族不同成員的 C 端特征性 PBD 結(jié)構(gòu)域?qū)ν坏孜锏挠H和力有很大的區(qū)別[4]。PLK1 在大部分惡性腫瘤細(xì)胞中呈過度表達(dá)并且與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)，臨床數(shù)據(jù)表明通過抑制 PLK1 能阻止體外腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散，抑制細(xì)胞增殖與促進(jìn)細(xì)胞凋亡[5-7]。PLK1 主要在細(xì)胞有絲分裂的 G2 晚期和M 期表達(dá)，在有絲分裂啟動、中心體成熟、紡錘體組裝、染色體分離及胞質(zhì)分裂等細(xì)胞有絲分裂過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[8-14]。

熒光偏振法是一種被廣泛利用在臨床和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的快速和定量分析不同分子和酶相互作用的技術(shù)[15-17]，20 世紀(jì) 90 年代中期開始應(yīng)用于藥物的高通量篩選，并且已經(jīng)成為研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA、DNA-DAN、配體-受體、抗原-抗體等相互作用的有力工具。近年來，在以蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interactions，PPIs）為靶點(diǎn)的藥物高效發(fā)現(xiàn)研究中展現(xiàn)出無可比擬的應(yīng)用前景。

本研究通過對中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所國家新藥微生物篩選中心樣品庫中篩選出來的編號為 1097C11 的化合物的抗腫瘤分子機(jī)制進(jìn)行初步發(fā)掘，探討其輔助治療惡性腫瘤的可能性。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1化合物和細(xì)胞20 000 個待篩化合物購自北京百靈威科技有限公司；人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞HT-29 用 DMEM/F12 + 5% FBS + NEAA（1:100）培養(yǎng)基培養(yǎng)；乳腺癌細(xì)胞 MCF-7、人宮頸癌細(xì)胞

HeLa、人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞 HCT-116 和人正常肝細(xì)胞系 L02 均用含 10% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)；人成骨肉瘤細(xì)胞 MG-63 和人肝癌細(xì)胞 HepG2用含 10% FBS 的 MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)；人前列腺癌細(xì)胞 PC3 用含 10% FBS 的 F12k 培養(yǎng)基培養(yǎng)；人肺癌細(xì)胞 A549 用含 10% FBS 的 F12 培養(yǎng)基培養(yǎng)，以上細(xì)胞均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2試劑FITC 標(biāo)記多肽由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司合成；重組蛋白PLK1 PBD 由陳云雨博士提供；NaCl、Tris-HCl、EDTA、RNaseA、碘化丙啶（PI）、噻唑藍(lán)（MTT）、DMSO 均購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC/PI 雙染試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司。

1.1.3儀器Envision 2014 multilabel reader 酶標(biāo)儀為美國 PerkinElmer 公司產(chǎn)品；FACS caliur 型流式細(xì)胞儀為美國 Beckman Coulter 公司產(chǎn)品；WD-9405B 型水平搖床為北京市六一儀器廠產(chǎn)品；DFC450C 型活細(xì)胞顯微觀察及圖像采集儀為德國Leica 公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1化合物初篩利用熒光偏振模型對 1 mg/ml的化合物庫進(jìn)行初步篩選。將400 nmol/L PLK1 PBD 溶液以 30 μl/孔依次加入到 384 孔板中，再將供篩選的化合物以 0.3 μl/孔依次加入，以加入0.3 μl DMSO 孔作為陰性對照，不加 PLK1 PBD的為陽性對照，將其混勻后室溫避光 140 r/min 振搖，孵育 60 min 后加入 30 μl/孔 60 nmol/L 的FITC-Probe，繼續(xù)避光孵育 15 min，以多功能微孔板檢測儀進(jìn)行樣品的偏振值檢測并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析?；衔镆种坡拾慈缦鹿接?jì)算：

抑制率（%）=（1 – OD受試藥組– OD空白組）× 100% OD正常組– OD空白組

1.2.2小分子抑制劑的量效關(guān)系分析將初篩陽性化合物 1097C11 溶于 DMSO 中，配置成10 mmol/L 的母液。母液倍比稀釋，按照初篩的方法在 FITC 的模型上檢測，以濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，利用 Graphpad prism5 軟件分析計(jì)算 IC50值[18-19]。

1.2.3MTT 比色法測定化合物在細(xì)胞上的殺傷作用復(fù)蘇細(xì)胞，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，接種于 96 孔板中，控制每孔的細(xì)胞量為 2 × 104個/ml。24 h 后，棄掉培養(yǎng)基，將化合物倍比稀釋后，以 100 μl/孔加入 96 孔板中，3 個復(fù)孔，不加化合物組為空白對照組，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h。每孔加入終濃度為 0.5 mg/ml 的 MTT 避光孵育 4 h 后棄掉培養(yǎng)基，加入 150 μl DMSO 避光振蕩 15 min，酶標(biāo)儀 570 nm檢測[20]。數(shù)據(jù)處理方法同 1.2.2。計(jì)算 IC50值。抑制率計(jì)算方式如下：

抑制率（%）=（1 –1 – OD受試藥組）× 100% OD空白組平均值

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡利用 Annexin V-FITC/PI 雙染法測定細(xì)胞凋亡，將培養(yǎng)至對數(shù)期的 HCT-116 細(xì)胞以每孔 1 × 105個/ml 接種于六孔板中[21]，待 24 h 進(jìn)入對數(shù)生長期后加入濃度為0、5、15、25 μmol/L 的 1097C11 作用 24 h，取出上述細(xì)胞培養(yǎng)板，以 PBS 小心漂洗 1 次，再以0.25% 胰酶消化細(xì)胞，1000 r/min 離心 5 min，收集細(xì)胞。將上述消化的 HCT-116 細(xì)胞以 4 ℃ 預(yù)冷的 PBS 洗滌 2 次，用 250 μl 1 × 結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為 5 × 106個/ml。再加入 5 μl Annexin V-Alexa Fluor488，室溫避光孵育 30 min，再加入 5 μl PI，室溫避光孵育 5 ～ 10 min。將上述細(xì)胞懸液過濾到 BD 流式管中，補(bǔ)加 400 μl PBS并做好對應(yīng)的標(biāo)記，以流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5細(xì)胞同步化及 FACS 分析化合物對周期的影響將生長到對數(shù)生長期的 HCT-116 細(xì)胞以2 × 105個/ml 接種于六孔板中，待細(xì)胞貼壁后加入濃度為 0.1 mol/L 的胸腺嘧啶 40 μl 培養(yǎng) 8 ～ 12 h后，用 PBS 洗 3 次，換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h 后，再次加入 0.1 mol/L 的胸腺嘧啶 40 μl 培養(yǎng) 8 ～ 12 h，PBS 洗過 3 次后加入濃度為 0、5、15、25 μmol/L 的化合物 1097C11。作用 18 h 后，取出上述細(xì)胞培養(yǎng)板，以 PBS 小心漂洗 1 次，再以 0.25% 胰酶消化細(xì)胞，1000 r/min 離心 5 min，收集細(xì)胞，用 PBS 洗凈，用 70% 冰乙醇 4 ℃ 固定 1 h 以上（通常過夜），PBS 洗凈乙醇，加入終濃度為 100 μg/ml 的 RNaseA 和終濃度為 50 μg/ml 的 PI，再補(bǔ)加 PBS 至 500 μl 體系，于 37 ℃ 水浴鍋中避光孵育 30 min。1 h 內(nèi)過濾，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6化合物 1097C11 和 PLK1 蛋白的 PBD結(jié)構(gòu)域的對接采用 Discovery Studio4.0 軟件進(jìn)行分子對接。從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（protein data bank，PDB）中下載 PLK1 PBD 的 PDB（4H71）文件，進(jìn)行預(yù)處理，去水，加氫，處理蛋白，確定活性位點(diǎn)，將 1097C11 與活性位點(diǎn)對接。

1.2.7細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)先用記號筆在六孔板背面均勻劃得橫線，大約每隔 0.5 ～ 1 cm 橫穿過孔，每孔至少穿過三條線，以便獲得不同視野。以 5 × 105個/ml 接種 HCT-116 細(xì)胞于六孔板中。第 2 天用無菌槍頭比著直尺，盡量垂直于背面的橫線劃痕。用 PBS 洗細(xì)胞 3 次，除去劃線下的細(xì)胞，加入含 5、15、20 μmol/L 的 1097C11。放入 37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng) 48 h 后取樣，拍照。按照以上方法用 20 μmol/L 的 1097C11 作用于HCT-116 細(xì)胞不同時間取樣拍照。

2　結(jié)果

2.1化合物初次篩選結(jié)果

利用熒光偏振的方法對化合物庫中的 20 000 個化合物進(jìn)行篩選，最終得到活性化合物1097C11，對 PLK1 PBD 的抑制率較高，達(dá)到 90% 以上，經(jīng)過 ChemDraw ISIS查詢到化合物結(jié)構(gòu)（圖1）。

圖1　化合物 1097C11 的結(jié)構(gòu)式Figure 1　The structure of compound 1097C11

2.2陽性化合物 1097C11 在 PLK1 PBD 上的活性

從國際經(jīng)驗(yàn)看，市場化定價是成品油市場最普遍采用的模式。韓國的成品油價格市場化進(jìn)程經(jīng)歷了由政府定價過渡為與國際市場接軌再到價格完全市場化三個階段，最終形成了既能夠反映國際市場變化，又能體現(xiàn)國內(nèi)市場實(shí)際供需情況的價格體系。明確合理的價格運(yùn)行機(jī)制，不僅能夠提高成品油市場運(yùn)行效率，也有利于保障國家能源供應(yīng)安全，提升國內(nèi)石油企業(yè)競爭力。

將化合物 1097C11 由 10 μg/ml 二倍稀釋 8 個濃度，利用軟件 Graphpad prism5 擬合曲線，可看到隨著 1097C11 濃度的增高，對 PLK1 PBD 活性的抑制率逐漸增強(qiáng)，最終趨于平穩(wěn)，具有明顯的劑量依賴性。如圖2 所示，1097C11 對 PLK1 PBD 的 IC50約為 1.78 μmol/L。

2.3化合物 1097C11 對細(xì)胞增殖的抑制作用

將化合物 1097C11 從 100 μmol/L 二倍稀釋至1.56 μmol/L，作用于以下幾種細(xì)胞系，經(jīng)過 Graphpad prism5 軟件分析計(jì)算，IC50見表1。從表1 中我們可以發(fā)現(xiàn)，1097C11 對 HCT-116 的增殖抑制作用最強(qiáng)，IC50值為 8.43 μmol/L（圖3）。而在正常肝細(xì)胞 L02 上的 IC50值為 10.15 μmol/L，在體外對腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞毒性相差不大，選擇性較差。而根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，PLK1 PBD 在 HCT-116 中的蛋白表達(dá)量較高[22]，所以選擇 HCT-116 用來做后續(xù)試驗(yàn)。

圖2　1097C11 對體外純化 PLK1 PBD 的抑制率Figure 2　Inhibition ratio of 1097C11 against purified PBD in vitro

表1　1097C11 對不同細(xì)胞株的毒性Table 1　Cytotoxicity of 1097C11 to different cells

圖3　1097C11 在 HCT-116 細(xì)胞中的抑制率Figure 3　Inhibition ratio of 1097C11 for HCT-116 cell

2.4化合物 1097C11 對細(xì)胞凋亡的影響

在 AnnexinⅤ/PI 雙染實(shí)驗(yàn)中，0、5、15、25 μmol/L 的小分子抑制劑1097C11 作用 HCT-116細(xì)胞 24 h 后，通過 FACS 檢測，與 DMSO 對照組相比，隨著 1097C11 劑量的不斷增加，HCT-116細(xì)胞的凋亡率逐漸升高，晚期凋亡細(xì)胞數(shù)目隨著劑量的不斷增加而增多并有早期凋亡，在濃度達(dá)到 25 μmol/L 時晚期凋亡細(xì)胞數(shù)達(dá)到總細(xì)胞數(shù)的77.02%，如圖4、圖5 所示。

圖4　1097C11 對 HCT-116 細(xì)胞的促凋亡作用Figure 4　Effect of compound 1097C11 on apoptosis in HCT-116 cells

2.5化合物 1097C11 對細(xì)胞周期的阻滯作用

結(jié)果表明，1097C11 可以明顯地使周期同步化的 HCT-116 細(xì)胞發(fā)生 G2/M 期阻滯，延緩細(xì)胞周期的進(jìn)程。利用細(xì)胞周期同步化的技術(shù)獲得周期一致性的細(xì)胞，提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。當(dāng) 5、15、25 μmol/L 的 1097C11 作用于周期同步化的HCT-116 細(xì)胞 24 h 時，與對照組相比，隨著劑量的不斷增加，HCT-116 細(xì)胞的 G2/M 期比率逐漸升高，有很強(qiáng)的劑量依賴性。對照組 G2/M 期比率為 9.84%，當(dāng)劑量達(dá)到 25 μmol/L 時，G2/M 期比率達(dá)到 44.03%（圖6）。

PBD 由 PB1 和 PB2 通過構(gòu)象的轉(zhuǎn)變在空間上形成二聚體，依靠氫鍵、范德華力及疏水鍵形成一個“拉鏈”式結(jié)構(gòu)，磷酸肽底物的結(jié)合區(qū)域恰好位于 PB1 和 PB2 之間的“狹窄溝槽”內(nèi)。分子對接中，我們發(fā)現(xiàn)小分子抑制劑 1097C11 與水化His538、ASN533 和 Lys540 的側(cè)鏈形成較為牢固的氫鍵；同時與 Arg557 形成疊加的 π 鍵，進(jìn)而使 1097C11/PBD 復(fù)合物更加穩(wěn)定（圖7）。表明小分子抑制劑 1097C11 與 PLK1 PBD 的非共價鍵的競爭結(jié)合方式，但是這種過于“緊密”的結(jié)合模式的精確解析還有待其結(jié)構(gòu)生物學(xué)的深入研究。

2.71097C11 對 HCT-116 細(xì)胞遷移的影響

HCT-116 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，加藥組 HCT-116 細(xì)胞的遷移能力顯著減弱，尤其是在 20 μmol/L 時，加藥組的細(xì)胞遷移能力和對照組比有明顯差異，表明該化合物能夠抑制HCT-116 細(xì)胞的遷移，并且可以看出隨著 1097C11濃度的增加，這種劑量依賴關(guān)系也顯著增加。而20 μmol/L 的 1097C11 在不同作用時間表現(xiàn)出不同的遷移狀態(tài)，與對照組相比隨著時間的延長，加藥組的遷移抑制作用 48 h 比 12 h 時遷移減弱的最明顯，表現(xiàn)出一定的時間依賴趨勢（圖8 和圖9）。

圖5　1097C11 對 HCT-116 細(xì)胞的促凋亡作用Figure 5　Effect of compound 1097C11 on apoptosis in HCT-116 cells

圖6　1097C11 對 HCT-116 細(xì)胞的周期阻滯作用Figure 6　Effect of compound 1097C11 on cell cycle in HCT-116 cells

圖7　1097C11 與 PBD1 活性區(qū)域的虛擬對接（A：小分子蛋白相互作用二維平面圖；B：蛋白小分子相互作用圖；C：蛋白與小分子空間位置示意圖）Figure 7　Virtual docking of 1097C11 with PBD1 domain (A: 2D floor plan of the interaction of the protein and small molecule; B: Interaction diagrams of the protein and small molecule; C: Spatial location schematic diagram of the protein and small molecule)

圖8　1097C11 對 HCT-116 的遷移影響Figure 8　Effect of 1097C11 on migration ability in HCT-116 cells

圖9　1097C11 不同作用時間對 HCT-116 的遷移影響Figure 9　Effects of 1097C11 on migration ability at different time intervals in HCT-116 cells

3　討論

臨床前期試驗(yàn)顯示，PLK1 是多種腫瘤治療的有效靶點(diǎn)，PLK1 蛋白表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的增殖有關(guān)，通過不同途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的啟動[23]，而以PLK1 為靶點(diǎn)的藥物較傳統(tǒng)微管蛋白活性抑制劑（如紫杉醇、長春堿、長春瑞賓）具有良好的臨床優(yōu)勢，故對于 PLK1 PBD 靶點(diǎn)的小分子抑制劑的研究是很有臨床意義的。

熒光偏振方法 1926 年由 Perrin 提出，其原理在于：熒光團(tuán)的極化程度是與分子旋轉(zhuǎn)速度逆相關(guān)的，當(dāng)小的熒光分子在平面極化光的激發(fā)下，在熒光壽命內(nèi)（激發(fā)與發(fā)射之間的時差）小分子在溶液中的旋轉(zhuǎn)速度快，所形成的發(fā)射光大部分是去極化的，偏振值較低；但是，當(dāng)熒光分子結(jié)合到大分子后，它的有效體積增大，旋轉(zhuǎn)減慢，偏振值較高。從而提供了直接檢測熒光分子結(jié)合到受體比值的方法[24-26]。該法不僅價格低廉而且速度快、效率高、操作簡單。本研究利用熒光偏振模型對中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所國家新藥微生物篩選中心樣品庫的 20 000 個化合物進(jìn)行篩選，最終選出活性較好的化合物 1097C11，經(jīng)查詢，該化合物是個新型結(jié)構(gòu)的抗腫瘤化合物。通過熒光偏振模型得到小分子抑制劑 1097C11 的 MTT 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1097C11 對結(jié)腸癌細(xì)胞 HCT-116 作用較為明顯，這可能與靶蛋白在不同細(xì)胞中的表達(dá)量有關(guān)。其在正常肝細(xì)胞中選擇性不高，但有報(bào)道證實(shí)，腫瘤組織 PLK1 蛋白表達(dá)明顯高于正常肝組織中的PLK1 蛋白表達(dá)量，人類多數(shù)疾病并不是由單一基因或靶點(diǎn)導(dǎo)致的疾病，化合物靶標(biāo)并不是疾病所獨(dú)有的，多數(shù)具有多重生物功能，或者與其他功能蛋白相互影響也會導(dǎo)致選擇性低，同時多靶點(diǎn)抗癌藥物不僅可以提高治療效果，而且有可能避免多種藥物聯(lián)合用藥而導(dǎo)致的藥物相互作用，降低副作用，在癌癥治療中具有重要的意義[27-29]。

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，1097C11 能夠很明顯地促進(jìn)細(xì)胞凋亡，在 25 μmol/L 濃度下，晚期凋亡達(dá)到 77.02% 左右，而在細(xì)胞周期中，1097C11對于 G1/M 期的阻滯作用也有一定的量效關(guān)系，這也與之前的報(bào)道相符合[30]，表明小分子抑制劑1097C11 對 PLK1 PBD 有著較為明顯的抑制作用。分子對接是分子模擬的重要方法之一，其本質(zhì)是兩個或多個分子之間的識別過程，其過程涉及分子之間的空間匹配和能量匹配[31-33]，通過蛋白和小分子結(jié)合的位點(diǎn)判斷小分子抑制劑和蛋白的結(jié)合能力。經(jīng)過分子對接進(jìn)一步證實(shí)了小分子抑制劑1097C11 與 PBD 結(jié)合，進(jìn)而起到抑制作用，因而證明 1097C11 是以 PBD 為作用靶點(diǎn)發(fā)揮抗腫瘤作用。同時細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果也表明，1097C11可以抑制 HCT-116 細(xì)胞的遷移，并呈現(xiàn)一定的時間和濃度依賴關(guān)系。

綜上所述，本研究表明小分子抑制劑 1097C11有較好的 PBD 靶向抗腫瘤活性，這為以后開發(fā)安全、高效的 PLK1 PBD 小分子抑制劑奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。隨著基礎(chǔ)研究及臨床研究的不斷深入，以 PLK1 PBD 為靶點(diǎn)的小分子抑制劑必將成為腫瘤靶向治療和個體化治療策略的新突破口。

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Author Affiliations:College of Pharmacy, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China (ZONG Ke-xin，F(xiàn)AN Zhuo-wen); National Laboratory for Screening New (Microbial) Drugs, Institute of Medicinal Biotechnology, Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China (ZONG Ke-xin, ZHANG Jing, CHEN Yun-yu, SI Shu-yi); Changchun Institute of Applied Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Changchun 130022, China (CHEN Yun-yu)

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Screening and anti-tumor activity of PLK1 PBD targeted inhibitors

ZONG Ke-xin, ZHANG Jing, CHEN Yun-yu, FAN Zhuo-wen, SI Shu-yi

【Abstract】

ObjectiveIn order to find lead compound which is capable, at least in vitro, of inhibiting tumor cells' growth by restraining PLK1 PBD's activity.

MethodsWe used fluorescence polarization model to screen positive compounds targeting PLK1 PBD. MTT assay was utilized to find the most sensitive cell lines of 1097C11. Effects of the positive compound on cell cycle and apoptosis were all tested by flow cytometry (FCM). The combination of compound with PLK1 PBD was determined by molecular docking. Compound's effect on cell movement was determined by cell migration experiment.

ResultsThe hit 1097C11 was found from 20 000 compounds. It could suppress the proliferation of HCT-116 cells. 1097C11 induced apoptosis, with apoptosis ratio reaching as high as 77.02% at 25 μmol/L concentration, and also led to G1/M phase arrest. Molecular docking showed that 1097C11 had good affinity with the PBD1 domain. Cell migration results showed that 1097C11 inhibited the migration of HCT-116 cells and the migration rate was as low as 33.4% in 20 μmol/L.

Conclusion1097C11 has good antitumor activity and is expected to be a lead compound targeting PLK1 relevant tumor.

【Key words】Fluorescence polarization;Antineoplastic agents;Polo-like kinase 1inhibitor

Corresponding Authors: FAN Zhuo-wen, Email:1282776014@qq.com; SI Shu-yi, Email: sisyimb@hotmail.com

收稿日期：2015-10-12

通信作者：范卓文，Email：1282776014@qq.com；司書毅，Email：sisyimb@hotmail.com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81370087）

DOI:10.3969/j.issn.1673-713X.2016.01.004