錢雯，馬波，黃永坤，陳敏，王麗麗，張益麗，楊晨，徐道俊，劉馨

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臨床樣品中不同蝕斑表型單克隆輪狀病毒VP8基因序列分析

錢雯，馬波，黃永坤，陳敏，王麗麗，張益麗，楊晨，徐道俊，劉馨

作者單位：650106 昆明，云南沃森生物技術(shù)股份有限公司（錢雯、馬波、陳敏、王麗麗、張益麗、楊晨、徐道俊、劉馨）；650032 昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院（黃永坤）

輪狀病毒屬于呼腸孤病毒屬，為沒(méi)有包膜的雙鏈 RNA病毒，人畜禽共患，其感染每年引起約 50 萬(wàn)嬰幼兒死亡[1]。

宿主細(xì)胞表面的寡糖分子是一個(gè)重要的因子，它們與輪狀病毒和細(xì)胞的相互識(shí)別及吸附有關(guān)，同時(shí)還影響了病毒的宿主特異性[2]。研究表明，輪狀病毒外殼蛋白 VP4 的糖類結(jié)合區(qū)域位于 VP4 的亞基 VP8，其與細(xì)胞表面寡糖分子的相互作用使病毒識(shí)別并吸附到細(xì)胞表面。輪狀病毒對(duì)細(xì)胞的感染是通過(guò) VP8 與細(xì)胞表面多糖，尤其是與內(nèi)部唾液酸（N-acetyl- and N-glycolylneuraminic acids，Sia）的結(jié)合完成的[3]。人株、猴株以及豬輪狀病毒 VP8 基因序列在識(shí)別細(xì)胞表面唾液酸或其衍生物甲基-α 二氮乙酰神經(jīng)氨酸的位點(diǎn)有顯著的差異[1]，影響病毒在細(xì)胞培養(yǎng)上的敏感性和適應(yīng)性。

研究發(fā)現(xiàn)，分離自豬糞便的輪狀病毒在 157 位呈現(xiàn)出Pro 或者 Ser 的多態(tài)性；牛輪狀病毒株 NCDV 隨細(xì)胞培養(yǎng)的適應(yīng)，VP8 基因 157 位由 Pro 突變?yōu)?Ser，從而產(chǎn)生了NCDV Cody 和 NCDV Lincoln 兩個(gè)衍生亞株，這是在VP8 氨基酸 64 ～ 224 區(qū)域內(nèi)發(fā)生的唯一的氨基酸突變[4]。分離自人糞便樣品輪狀病毒的 VP8 基因是否存在上述位點(diǎn)的多態(tài)性？

輪狀病毒感染細(xì)胞后可形成蝕斑，在凝膠的固定下，病毒顆粒不能自由地移動(dòng)，在一個(gè)病毒顆粒進(jìn)入細(xì)胞并產(chǎn)生子代病毒的過(guò)程中，細(xì)胞死亡并形成蝕斑，一個(gè)蝕斑代表了一個(gè)單克隆的病毒分子。蝕斑的表型，即蝕斑的大小與病毒感染后產(chǎn)生細(xì)胞致病作用（cytopathogenic effect，CPE）的時(shí)間和程度有關(guān)，蝕斑較大的病毒克隆產(chǎn)生 CPE 的時(shí)間較快，也較為劇烈。VP8 基因序列的差異與空斑的大小即蝕斑表型、病毒分子的感染性之間存在怎樣的關(guān)系？

為了回答上述問(wèn)題，本文研究了分離自一份臨床糞便樣品的輪狀病毒單克隆的 VP8 基因序列，并分析了序列差異與病毒蝕斑表型之間可能存在的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床樣品及病毒臨床糞便樣品來(lái)自昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科秋冬季腹瀉患兒，經(jīng)病毒核酸電泳或電鏡觀察確證為輪狀病毒感染。

1.1.2細(xì)胞及質(zhì)粒羅猴腎細(xì)胞系 MA104 購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCC 編號(hào)為 GDC041；pGEM-T easy載體為美國(guó) Promega 公司產(chǎn)品。

1.1.3試劑與儀器小量液體樣品 RNA 抽提試劑盒、聚丙烯酰胺、硝酸銀、中性紅購(gòu)自上海華舜生物技術(shù)有限公司；RT-PCR 試劑盒、ExTaq 酶購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；小型垂直電泳槽購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad 公司；MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；胰酶購(gòu)自美國(guó) BBI 公司；二乙氨乙基葡聚糖（DEAE-dextron）購(gòu)自美國(guó) GE 公司。

1.2方法

1.2.1臨床樣品中輪狀病毒的分離及 PAGE 鑒定具體方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[5]。

1.2.2病毒的培養(yǎng)及蝕斑純化過(guò)濾后的病毒上清接種24 孔板 MA104 細(xì)胞，擴(kuò)增 6 ～ 7 代后，做病毒蝕斑實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行 3 輪純化，具體的方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[6]。

1.2.3VP8 基因的克隆及測(cè)序根據(jù) Genbank 數(shù)據(jù)庫(kù)序列，選取人常見(jiàn) P 血清型 VP8 的保守區(qū)域，設(shè)計(jì)引物如下：克隆引物 5' cttctcactaattcatattc 3'（34 ～ 53 bp），5' tatttc agaccatttataacc 3'（859 ～ 879 bp），測(cè)序引物 5' tcccaagaatc taaatgtaa 3'（sense）或 5' ttacatttagattcttggga 3'（antisense）（628 ～ –647 bp），使用抽提的輪狀病毒 RNA 為模板，做RT-PCR，將 PCR 產(chǎn)物克隆至 pGEM-T easy 載體后測(cè)序，測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成。

2　結(jié)果

2.1臨床樣品中輪狀病毒的基因型

對(duì) 30 份臨床糞便樣品編號(hào) 1 ～ 30，并進(jìn)行輪狀病毒的分離，選取分離結(jié)果較好的 5 份樣品分別為 1、4、5、6、7 號(hào)進(jìn)行培養(yǎng)。輪狀病毒基因組為分 11 節(jié)段的雙鏈 RNA，不同血清型的輪狀病毒 RNA 基因組在 PAGE 電泳時(shí)呈現(xiàn)不同的電泳特征（圖1），A 群輪狀病毒的 4 個(gè)區(qū)段中，各帶的排列位置為 4:2:3:2，根據(jù)前 4 條 RNA 的排列特征又可以進(jìn)一步區(qū)分同屬 A 群但不同血清型的病毒株，Wa株（血清型為 P[8]G1）的前 4 條排列為 1-2-1，因此，初步判定 5 號(hào)、7 號(hào)樣品為 P[8]G1 型。

2.2分離輪狀病毒培養(yǎng)后的滴度及蝕斑表型

按前述方法在 MA104 細(xì)胞上進(jìn)行連續(xù)擴(kuò)增，臨床樣品 5 號(hào)病毒滴度最高，可達(dá) 106TCID50/ml，其 RNA 電泳條帶與 Wa 株一致，血清型對(duì)應(yīng)為 P[8]G1，以 10-5稀釋度做蝕斑實(shí)驗(yàn)，出現(xiàn)了兩種表型，一種是較大的，直徑大于5 mm，一種是較小的，直徑小于 3 mm。選取不同蝕斑表型的輪狀病毒克隆進(jìn)行 3 輪純化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蝕斑表型即蝕斑的大小與母代病毒保持一致（圖2）。

圖1　臨床糞便樣品中的輪狀病毒 RNA 電泳帶型

2.3不同蝕斑表型病毒克隆 VP8 基因測(cè)序結(jié)果分析

VP8 的 64 ～ 224 位氨基酸是與唾液酸結(jié)合的區(qū)域[7]，而兩個(gè)主要的位點(diǎn) 157、187 是主要的糖鏈結(jié)合點(diǎn)[2]。對(duì)大小蝕斑的 VP8 編碼區(qū)（869 bp）進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，結(jié)果顯示，兩者 VP8 序列的主要差異集中在 aa 64 ～ 224 區(qū)域，

圖2　臨床樣品 5 號(hào)分離輪狀病毒經(jīng) 3 輪蝕斑純化后的表型（A：直徑大于 5 mm 的大蝕斑表型；B：直徑小于 3 mm 的小蝕斑表型；C：陰性對(duì)照）

主要差異見(jiàn)表1。在識(shí)別多糖受體的關(guān)鍵位點(diǎn) 157 位，直徑較大的蝕斑為 Pro，而直徑較小的為 Ser；187 位均為Ser，但 189 位發(fā)生了 Ser 到 Asn 的變化。VP8 基因的同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該株病毒 VP8 基因與人 Wa株（血清型為P[8]G1）最為相近，相似度為 95%。

表1　臨床樣品 5 號(hào)大小蝕斑 VP8 氨基酸差異

3　討論

感染人的輪狀病毒主要是 A 群，血清組合常見(jiàn)的有P[8]G1、P[4]G2、P[6]G3 等，且病毒 RNA 電泳的核酸帶型有顯著的差異排布。VP4 血清型即 P 血清型特異的區(qū)域位于 VP4 的亞基 VP8，VP4 氨基酸同源性達(dá) 89% 或者更高的可判定屬于同一個(gè) VP4 血清型[7-8]。

不同血清型的輪狀病毒感染細(xì)胞后，一般可以形成裂解性感染，產(chǎn)生典型的 CPE，但病毒的滴度和產(chǎn)生 CPE 的強(qiáng)度因病毒的來(lái)源和血清型不同有較大差異。這與病毒是否可以有效地結(jié)合于細(xì)胞表面并進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部完成復(fù)制有關(guān)，即病毒對(duì)細(xì)胞表面受體的識(shí)別和進(jìn)入細(xì)胞的進(jìn)程影響了病毒的繁殖周期和滴度水平。

輪狀病毒入侵人體并導(dǎo)致感染的病毒粒子和宿主細(xì)胞之間確切的相互作用特異性機(jī)制尚未闡明[1]。最近的研究顯示，輪狀病毒的外殼蛋白 VP4 經(jīng)胰蛋白酶裂解后的產(chǎn)物VP8 對(duì)于病毒感染來(lái)說(shuō)是必需的，VP8 介導(dǎo)了病毒與細(xì)胞膜的融合[2, 9-10]。

本研究中，發(fā)現(xiàn)分離自臨床糞便樣品的輪狀病毒 5 號(hào)，在蝕斑純化時(shí)呈現(xiàn)出兩種不同的表型，即大蝕斑和小蝕斑，通過(guò)對(duì)其 VP8 基因序列的分析發(fā)現(xiàn)，直徑較大的蝕斑在157 位氨基酸為 Pro，而直徑較小的蝕斑在 157 位氨基酸為 Ser，Pro 到 Ser 的突變減弱了輪狀病毒與受體的親和力[11]，從而導(dǎo)致病毒的感染性下降，蝕斑表型變小。但這個(gè)序列的代表性還需要進(jìn)一步分析其他臨床樣本，選取多個(gè)蝕斑純化病毒進(jìn)行比較確證。

本文的研究同時(shí)提示，作為存在基因重排和變異較高的RNA 雙鏈病毒，輪狀病毒疫苗株的篩選，需要對(duì)來(lái)自臨床樣品的母代病毒進(jìn)行多輪的蝕斑純化，得到基因遺傳穩(wěn)定，純凈的單克隆病毒。

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·讀者·作者·編者·

收稿日期：2015-11-10

通信作者：劉馨，Email：fluidstar@126.com

DOI:10.3969/j.issn.1673-713X.2016.01.015