陳青，段志敏，蔡莉，陳蓉，肖建宇，黃成垠，莊云龍

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江蘇地區(qū)漢族人群血小板CD36抗原缺失型表型的分析

陳青，段志敏，蔡莉，陳蓉，肖建宇，黃成垠，莊云龍

【摘要】

目的探索江蘇地區(qū)漢族人群血小板表面 CD36 抗原缺失型表型的多態(tài)性。

方法應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)江蘇地區(qū) 140 位獻(xiàn)血者血小板表面 CD36 抗原的表達(dá)，以及對(duì)血小板表面 CD36 抗原缺失的標(biāo)本，進(jìn)一步檢測(cè)其單核細(xì)胞表面 CD36 的表達(dá)。結(jié)果140 名獻(xiàn)血者中，血小板表面 CD36 抗原表達(dá)缺失的有 4 例，缺失型頻率為 2.86%，其中 I 型缺失占 0.71% （1/140），II 型缺失占 2.14%（3/140）。

結(jié)論江蘇地區(qū)漢族人群中，CD36 抗原表型具有多態(tài)性，血小板表面 CD36 抗原缺失型個(gè)體的頻率略低于亞洲其他國(guó)家人群；其中 CD36 抗原 II 型缺失比例高于 I 型缺失。【關(guān)鍵詞】 抗原，CD36；血小板輸注；流式細(xì)胞術(shù)

www.cmbp.net.cn中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2016, 11(1):38-41

作者單位：210042 南京，江蘇省血液中心（陳青、蔡莉、陳蓉、肖建宇、黃成垠）；210042 南京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所（段志敏）；250014 濟(jì)南，山東省血液中心（莊云龍）

血小板輸注治療是現(xiàn)代輸血醫(yī)學(xué)的重要內(nèi)容之一。CD36 又稱(chēng)血小板膜糖蛋白 IV（GP1V）、Naka、GPIIIb 等，是一種表達(dá)于血小板和單核細(xì)胞等細(xì)胞表面的單鏈糖蛋白，在血小板聚集、抗血管生成、腫瘤免疫等方面有重要作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，個(gè)體血小板表面 CD36 抗原缺乏可受免疫刺激產(chǎn)生抗-CD36，已證實(shí)抗-CD36 是血小板輸注無(wú)效的原因之一[2-3]，因而對(duì)獻(xiàn)血者 CD36 抗原表達(dá)檢測(cè)日益受到重視。CD36 抗原缺失的頻率在世界不同地區(qū)、種族和人群中有所不同。據(jù)報(bào)道，撒哈拉的非洲人、日本人、非洲裔美國(guó)人和白種人人群 CD36抗原缺失型頻率分別為 8%、3% ～ 11%、2.4% 和0.3%[1, 4-7]；國(guó)內(nèi)廣州漢族人群 CD36 抗原缺失型頻率為 2.81%[8]；而廣西地區(qū)漢族、壯族、瑤族人群 CD36 抗原缺失型頻率分別為 3.59%、5.76% 和 2.38%[9-10]，提示 CD36 抗原缺失型頻率不僅存在人種區(qū)別，還存在地域和民族的差異。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)江蘇地區(qū)漢族人群獻(xiàn)血者血小板表面的 CD36 抗原表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì) CD36 抗原缺失型獻(xiàn)血者進(jìn)一步分析其單核細(xì)胞 CD36 表達(dá)情況。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本來(lái)源隨機(jī)抽取 2015 年 3 月來(lái)江蘇省血液中心無(wú)償捐獻(xiàn)血小板的獻(xiàn)血者 140 人，其中男 131 例，女 9 例，年齡 19 ～ 51 歲之間，平均年齡 34.25 歲，符合國(guó)家獻(xiàn)血者健康檢查標(biāo)準(zhǔn)。抽取全血 5 ml/（人）份，與 5% EDTA 抗凝劑混勻，4 ℃ 保存?zhèn)溆谩Ａ羧尾裳“?3 ml，22 ℃ 振蕩保存。

1.1.2儀器和試劑BD FACSVerseTM流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó) BD 公司；淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自挪威Axis-Shield 公司；別藻藍(lán)蛋白（APC）標(biāo)記的抗人CD36 單克隆抗體、同型對(duì)照 APC 標(biāo)記抗小鼠IgG1 抗體、異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的抗人CD14 單克隆抗體、FITC 標(biāo)記的抗小鼠 IgG1 抗體均購(gòu)自德國(guó) Miltenyi 公司。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本處理將單采富血小板血漿轉(zhuǎn)入另一試管，1200 × g 離心 5 min。棄去上層血漿，用 PBS洗滌血小板 2 次，然后把血小板懸浮在 PBS 中，調(diào)整血小板濃度為 106個(gè)/ml。

1.2.2外周血單個(gè)核細(xì)胞分離取外周血標(biāo)本5 ml，用 PBS 以 1:1 比例稀釋?zhuān)瑧?yīng)用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。取 5 ml 淋巴細(xì)胞分離液加入 15 ml 的離心管中，緩緩加入 5 ml 的稀釋的外周血，室溫條件下，2200 × g 離心 22 min，小心吸取分界面的白膜層細(xì)胞，用 PBS 洗滌 2 次，然后懸浮在 PBS 中，調(diào)整細(xì)胞濃度為 106個(gè)/ml。1.2.3血小板 CD36 表型的篩查取 100 μl 血小板懸液加入 10 μl APC 標(biāo)記的抗人 CD36 單克隆抗體，APC 標(biāo)記抗小鼠 IgG1 抗體作為同型對(duì)照，混勻，4 ℃ 避光孵育 10 min。1800 × g 離心5 min，洗滌 3 次，振蕩混勻，懸浮在 200 μl PBS中，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，通過(guò) FSC/SSC 設(shè)血小板門(mén)，以 Flow Jo 7.6.2. 軟件分析血小板表面的平均熒光強(qiáng)度（mean fluorescence intensity，MFI）。

1.2.4血小板 CD36 缺失型的表型分型血小板CD36 抗原缺失型樣本的 PBMCs 同時(shí)用 APC標(biāo)記的抗人 CD36 單克隆抗體和 FITC 標(biāo)記的抗人 CD14 單克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記，取 100 μl 單個(gè)核細(xì)胞分別加入 10 μl APC 標(biāo)記的抗人 CD36 單克隆抗體及 10 μl FITC 標(biāo)記的抗人 CD14 單克隆抗體，在對(duì)照管中加入相應(yīng)的同型對(duì)照抗體，混勻，4 ℃ 避光孵育 10 min，260 × g 離心 5 min，以PBS 洗滌 3 次，振蕩混勻，懸浮在 200 μl PBS 中，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，通過(guò) FSC/SSC 設(shè)單核細(xì)胞門(mén)，用 Flow Jo 7.6.2. 軟件分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 Flow Jo 7.6.2. 分析軟件中的平均熒光強(qiáng)度（MFI）計(jì)算血小板和單核細(xì)胞表面 CD36 抗原的表達(dá)量，數(shù)據(jù)以x±s表示，用 t 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P < 0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1血小板表面 CD36 抗原表達(dá)的檢測(cè)

140 位無(wú)償獻(xiàn)血者中，共篩選出 4 名血小板表面 CD36 抗原缺失的個(gè)體（表1），代表性標(biāo)本的流式細(xì)胞圖如圖1A 所示，CD36 抗原缺失型頻率為 2.86%（4/140）。

2.2單核細(xì)胞上 CD36 抗原的表達(dá)與 CD36 抗原缺失型的表型分析

對(duì)篩選出的 4 位血小板表面 CD36 抗原缺失型個(gè)體，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其單核細(xì)胞上 CD36 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn) 1 人為 I 型 CD36 抗原缺失，3 人為II 型 CD36 抗原缺失（表2），所占比例分別為0.71% 和 2.14%。代表性標(biāo)本的流式細(xì)胞圖見(jiàn)圖1B。

表1　血小板表面 CD36 抗原的表達(dá)檢測(cè)Table 1　Analysis of CD36 antigen expression on PLTs

圖1　典型檢測(cè)血小板（A）和單核細(xì)胞 CD36 抗原表達(dá)（B）的流式圖（a：正常個(gè)體同型對(duì)照；b：正常個(gè)體；c：I 型 CD36缺失個(gè)體；d：II 型 CD36 缺失個(gè)體；x 軸表示 APC的 MFI，y 軸在 A 中表示血小板計(jì)數(shù)，y 軸在 B 中表示單核細(xì)胞中 FITC 的 MFI）Figure 1　Representative pictures of flow cytometry analysis of CD36 expression on PLTs (A) and monocytes (B), respectively (a: Isotype control; b: Normal control; c: Type I CD36 deficiency; d: Type II CD36 deficiency; x axis showed the MFI of APC, and y coordinate showed counts of PLTs in A and showed the monocytes MFI of FITC in B)

表2　單核細(xì)胞 CD36 抗原的表達(dá)檢測(cè)Table 2　Analysis of CD36 antigen expression on monocytes

3　討論

CD36 抗原缺失分為兩型，I 型缺失是指在血小板和單核細(xì)胞上均不表達(dá) CD36，而 II 型缺失是指僅在血小板上不表達(dá) CD36。CD36 抗原缺失分布存在人種上的差異，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，江蘇地區(qū)獻(xiàn)血人群中的 CD36 缺失頻率和國(guó)內(nèi)報(bào)道的廣州地區(qū)及南寧地區(qū)的相似[8-9]，略低于日本人，但遠(yuǎn)高于白種人[7]。但值得注意的是：廣州地區(qū)漢族人群 CD36 抗原缺失均為 II 型缺失（2.81%），沒(méi)有發(fā)現(xiàn) I 型缺失[8]；廣西地區(qū)漢族人群中發(fā)現(xiàn) II 型缺失型頻率約為 2.18%，I 型缺失型頻率約為1.41%[10]；深圳地區(qū)漢族人群中發(fā)現(xiàn) II 型缺失型頻率約為 2.75%，I 型缺失型頻率約為 0.31%[11]；而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) II 型缺失型頻率約為 2.14%，I 型缺失型頻率為 0.71%。這些數(shù)據(jù)表明漢族人群 CD36抗原 II 型缺失型頻率可能分布在 1.50% ～ 2.81%，I 型缺失型頻率可能分布在 0 ～ 1.41%。Yamamoto 等[12]報(bào)道 CD36 抗原缺失 II 型在日本人群中約占 4.0%，I 型約占 0.56%，提示日本人群 CD36 缺失頻率高于中國(guó)人群，主要體現(xiàn)在 II 型缺失上。

CD36 抗原缺失的患者可產(chǎn)生抗 CD36 的同種抗體，從而造成血小板輸注無(wú)效、新生兒免疫性血小板減少癥等疾病，輸血后紫癜以及妊娠婦女流產(chǎn)和死胎的現(xiàn)象[2, 13]。Saw 等[2]報(bào)道 2 例 CD36抗原缺失的白血病患者輸注 HLA 配型相合的單采血小板后均發(fā)生輸注無(wú)效，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果表明該患者為 CD36 缺失型，并且 CD36 抗體檢測(cè)為陽(yáng)性。隨后在為該患者輸注 CD36 抗原陰性的獻(xiàn)血員單采血小板后，CCI 指數(shù)明顯上升。Ohto 等[13]報(bào)道了 CD36 抗原缺失的妊娠婦女產(chǎn)生 CD36 抗體從而引起胎兒/新生兒溶血病或死胎流產(chǎn)現(xiàn)象。

目前，血小板輸注無(wú)效已成為國(guó)內(nèi)外臨床極棘手的問(wèn)題，血小板輸注無(wú)效患者中 CD36 抗原缺失的頻率在國(guó)內(nèi)偶有報(bào)道[3]，還沒(méi)有引起足夠的重視。但有證據(jù)表明血小板和（或）單核細(xì)胞上 CD36 抗原的缺失所產(chǎn)生的抗 CD36 的同種抗體與基因突變有關(guān)。下一步我們將繼續(xù)擴(kuò)大篩查規(guī)模，積累更多的 CD36 缺失型供者，并深入研究 CD36 基因突變與抗原缺失的關(guān)系，這將有助于對(duì)血小板輸注無(wú)效及其他臨床疾病患者做個(gè)性化的治療，對(duì)提高輸血安全有重要的臨床意義。

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Author Affiliation: Jiangsu Province Blood Center, Nanjing 210042, China (CHEN Qing, CAI Li, CHEN Rong, XIAO Jian-yu, HUANG Cheng-yin); Institute of Dermatology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Nanjing 210042, China (DUAN Zhi-min); Blood Center of Shandong Province, Jinan 250014, China (ZHUANG Yun-long)

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol, 2016, 11(1):38-41

·協(xié)會(huì)之窗·

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Analysis of CD36 antigen deficiency phenotypes on the platelets in Jiangsu Han population

CHEN Qing, DUAN Zhi-min, CAI Li, CHEN Rong, XIAO Jian-yu, HUANG Cheng-yin, ZHUANG Yun-long

【Abstract】

ObjectiveTo explore the polymorphisms of CD36 antigen deficiency on the platelets (PLTs) surface of the Han population in Jiangsu region.

MethodsFlow cytometry was used to detect the CD36 antigen expression on PLTs in 140 blood donors in Jiangsu region. Donors without CD36 antigen expression on their PLTs surface were further to be determined the expression of CD36 antigen on their peripheral blood monocyte cells.

ResultsOf the 140 healthy blood donors analyzed, 4 individuals failed to express CD36 antigen on PLTs and the rate of CD36 deficiency was 2.86%; One of them without CD36 on PLTS expressed no CD36 antigen on his PBMCs either. The rates of Type I and Type II CD36 deficiency among the study population were 0.71% (1/140) and 2.14% (3/140), respectively.

ConclusionThe CD36 antigen phenotype is polymorphic in the Jiangsu Han population, and the rate of the Type II CD36 deficiency was higher than that in Type I. The study findings indicated that the frequency of CD36 deficiency in the Chinese population is slightly lower than that in other Asian countries.

【Key words】Antigen, CD36;Platelet transfusion;Flow cytometry

Corresponding Author:ZHUANG Yun-long, Email: yunlongzhuang@gmail.com

收稿日期：2015-09-28

通信作者：莊云龍，Email：yunlongzhuang@gmail.com

基金項(xiàng)目：江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（社會(huì)發(fā)展）項(xiàng)目（BE2015717）；江蘇省“十二五”期間“科教興衛(wèi)工程”醫(yī)學(xué)重點(diǎn)人才項(xiàng)目（RC2011088）；江蘇省第十批“六大人才高峰”項(xiàng)目（2013-WSW-039）；江蘇省第四期“333 高層次人才培養(yǎng)工程”；2010，2014 年度江蘇省衛(wèi)生國(guó)際交流支撐計(jì)劃項(xiàng)目；山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2013WS0170）

DOI:10.3969/j.issn.1673-713X.2016.01.008