馮鑫 施高翔 云云 吳大強(qiáng) 邵菁 汪天明 汪長中(安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所,合肥230038)

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黃芩苷聯(lián)合氟康唑通過降低c AMP抑制白念珠菌酵母-菌絲形態(tài)轉(zhuǎn)化

馮鑫 施高翔 云云 吳大強(qiáng) 邵菁 汪天明 汪長中
(安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所,合肥230038)

【摘要】目的 探討中藥有效成分黃芩苷(Baicalin,BA)聯(lián)合氟康唑(Fluconazole,FLC)對(duì)白念珠菌(Candida albicans)形態(tài)轉(zhuǎn)化的影響及機(jī)制。方法 在菌絲誘導(dǎo)培養(yǎng)基(液體和固體培養(yǎng)基)上觀察兩藥聯(lián)用對(duì)白念珠菌酵母-菌絲形態(tài)轉(zhuǎn)化的影響;ELISA法檢測(cè)兩藥聯(lián)用對(duì)胞內(nèi)c AMP含量的影響;回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證兩藥聯(lián)用對(duì)胞內(nèi)c AMP的影響;qRT-PCR檢測(cè)兩藥聯(lián)用對(duì)白念珠菌c AMP相關(guān)基因RAS1,CDC35和PDE2表達(dá)的影響。結(jié)果 黃芩苷聯(lián)合氟康唑能顯著抑制白念珠菌酵母-菌絲形態(tài)轉(zhuǎn)化,降低胞內(nèi)c AMP水平;外源性c AMP能逆轉(zhuǎn)兩藥聯(lián)用所造成的菌絲抑制;兩藥聯(lián)用使RAS1和CDC35表達(dá)分別下調(diào)35%和27%,使PDE2上調(diào)1.21倍。結(jié)論 黃芩苷協(xié)同氟康唑顯著抑制白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)化,其作用機(jī)制可能與下調(diào)胞內(nèi)c AMP有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】白念珠菌;黃芩苷;氟康唑;形態(tài)轉(zhuǎn)化;c AMP

[Chin J Mycol,2016,11(1):8-12]

近年來,隨著免疫力下降人群的不斷增加,深部真菌感染率大幅上升。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),重癥監(jiān)護(hù)室內(nèi)白念珠菌(Candida albicans,C.albicans)感染誘發(fā)的死亡率高達(dá)30%～60%[1]。白念珠菌為酵母-菌絲雙相性真菌,當(dāng)酵母相定植于黏膜組織表面后,可通過形態(tài)轉(zhuǎn)化形成菌絲,侵襲宿主細(xì)胞對(duì)其造成損害,甚至引起嚴(yán)重的深部真菌感染[2]。同時(shí),菌絲也參與白念珠菌生物膜的形成,而生物膜的形成將極大提高菌體的致病性和耐藥性。故能否抑制白念珠菌酵母-菌絲的形態(tài)轉(zhuǎn)化是防治白念珠菌感染的關(guān)鍵。目前,臨床可供選擇的抗真菌藥物有限,除了研發(fā)新藥外,新的抗真菌策略之一即是通過天然化合物(尤其是植物藥)與臨床常用抗真菌藥物聯(lián)用,達(dá)到減毒增效的功效。中藥具有資源豐富、副作用小、價(jià)格低廉、藥效綜合等特點(diǎn),在我國廣泛用于臨床疾病的治療。黃芩苷(Baicalin,BA)是從雙子葉植物黃芩的干燥根中提取的黃酮類化合物,藥理作用廣泛[3],近年來發(fā)現(xiàn)該藥本身雖有一定的抗真菌作用[4-5],當(dāng)其與氟康唑聯(lián)用時(shí)可發(fā)揮顯著的協(xié)同抗真菌效應(yīng)[6]。在此基礎(chǔ)上,本研究擬進(jìn)一步探討黃芩苷聯(lián)用氟康唑?qū)Π啄钪榫匾玖σ蜃又坏慕湍?菌絲形態(tài)轉(zhuǎn)化的影響及可能的分子機(jī)制,旨在為中西藥聯(lián)合治療由白念珠菌引起的真菌感染提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株 白念珠菌SC5314,由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院姜遠(yuǎn)英教授惠贈(zèng)。

藥物 氟康唑(Fluconazole,FLC,批號(hào)100314-201204)購自中國食品藥品檢定研究院;黃芩苷(純度＞98%,批號(hào)XC20140301),購于西安小草植物科技有限公司。

試劑 PBS緩沖液(p H7.0±2.0,實(shí)驗(yàn)室配制);25%戊二醛溶液(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);DMSO(博美生物科技有限公司);Total RNA提取試劑(TOYOBO);PCR試劑(TOYOBO); RPMI-1640培養(yǎng)基(Life technologies公司)。

儀器 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Nunclon丹麥公司);恒溫培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)公司);電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);Spectra Max M2e多功能酶標(biāo)儀(美谷分子儀器有限公司);CX21型光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS);7700型熒光定量PCR 儀(美國ABI公司)。

1.2 方法

菌懸液的配制 實(shí)驗(yàn)前,從4℃保存的沙氏培養(yǎng)平板上用接種環(huán)挑取單菌落C.albicans SC5314,接種至酵母蛋白胨培養(yǎng)液,37℃活化過夜,使其處于指數(shù)生長期,以RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度至2×103CFU/m L和2×106CFU/ m L備用。

分組 本實(shí)驗(yàn)各指標(biāo)檢測(cè)均為4個(gè)組別:空白對(duì)照組、黃芩苷單用組(62.5μg/m L)、氟康唑單用組(0.125μg/m L),兩藥聯(lián)用組(黃芩苷62.5μg/ m L+氟康唑0.125μg/m L)。

液體培養(yǎng)基中的白念珠菌酵母-菌絲轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)[7-8]將過夜活化的C.albicans SC5314菌懸液以含血清YPD液體培養(yǎng)基調(diào)整濃度至2×105CFU/m L,加入新的96孔板中,分別加入黃芩苷、氟康唑以及黃芩苷+氟康唑,并設(shè)空白對(duì)照組。37℃靜置培養(yǎng)3、6、9 h,以倒置顯微鏡觀察菌體形態(tài)并拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

固體平板中的白念珠菌酵母-菌絲轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)將過夜活化的C.albicans SC5314菌懸液濃度調(diào)整至2×103CFU/m L,取50μL菌液,分別均勻涂抹于含黃芩苷、氟康唑以及黃芩苷+氟康唑的含血清YPD瓊脂平板上,并設(shè)空白對(duì)照組。置于37℃條件下培養(yǎng),5～7 d后以顯微鏡觀察長出的菌落并拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

胞內(nèi)c AMP含量測(cè)定 將C.albicans SC5314菌濃度調(diào)整至2×105CFU/m L,接種于RPMI-1640培養(yǎng)基中,分別加入黃芩苷、氟康唑以及黃芩苷+氟康唑,并設(shè)空白對(duì)照組。37℃培養(yǎng)8 h后,離心收集細(xì)胞。c AMP的提取方法:復(fù)融冷凍的細(xì)胞,用冰冷的水清洗1遍并復(fù)融,一半的懸液用來干燥并稱重,另一半轉(zhuǎn)移至2 m L離心管中,4℃低溫條件下進(jìn)行破碎,10 min后低溫10 000 r/min離心15 min。上清以水飽和醚中和五次,待檢測(cè)時(shí)以500μL c AMP檢測(cè)試劑重懸,按c AMP ELISA試劑盒說明對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。

外源c AMP回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)[9]將白念珠菌SC5314濃度調(diào)整至2×105CFU/m L,分為2組,一組加入黃芩苷(62.5μg/m L)+氟康唑(0.125μg/m L),一組加入黃芩苷(62.5μg/m L)+氟康唑(0.125 μg/m L)+5 mmol/L二丁酰環(huán)腺苷酸(dibutyrylc AMP,dbc AMP),以加入相同體積的溶劑作為空白對(duì)照或者終濃度為5 mmol/L dbc AMP作為陰性對(duì)照。37℃培養(yǎng)24 h后用顯微鏡觀察不同處理組中白念珠菌的菌體形態(tài)變化。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR[10]①總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄:黃芩苷與氟康唑聯(lián)合作用C.albicans SC5314后,離心收集菌體后進(jìn)行總RNA提取。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:6μL RNA預(yù)變性(65℃5 min, 4℃1 min),加入2μL的DNA Master(含gDNA Remover),5RT-Master Mix II(2μL),混勻后按如下條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄:50℃5 min→98℃5 min→4℃1 min。②引物設(shè)計(jì)與合成:從NCBI基因庫中查得所需基因序列,并用Oligo 7.0軟件設(shè)計(jì)所需引物,委托上海生工公司合成引物,各引物情況詳見表1。③配制q RT-PCR反應(yīng)體系如下:2×SYBRGreen Master Mix 12.5μL,上下游引物各1μL, c DNA 0.5μL,補(bǔ)加蒸餾水至總體系25μL。95℃預(yù)變性后,反應(yīng)條件為:變性(95℃15 s)→退火(55℃15 s)→延伸(72℃45 s),共40循環(huán)。采用qRT-PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。定量分析:以ACT1作為內(nèi)參基因,分別測(cè)定每個(gè)樣品目的基因Ct值。結(jié)果應(yīng)用軟件Graphpad Prism 5.0進(jìn)行分析,基因表達(dá)水平用2-ΔΔCt法來計(jì)算倍數(shù)變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

表1 白念珠菌c AMP相關(guān)基因引物序列表Tab.1 PCR primers for c AMP-related genes of Candida albicans

2 結(jié) 果

2.1 黃芩苷聯(lián)合氟康唑?qū)Π啄钪榫湍?菌絲形態(tài)轉(zhuǎn)化的影響

如圖1所示,白念珠菌在含血清YPD液體培養(yǎng)基中生長3 h時(shí),空白對(duì)照組、黃芩苷組(62.5 μg/m L)、氟康唑組(0.125μg/m L)以及兩藥聯(lián)用組均為酵母相細(xì)胞;在6 h時(shí),空白對(duì)照組形成大量菌絲,而黃芩苷組、氟康唑組菌絲較短,兩藥聯(lián)用組可見酵母相細(xì)胞出芽但尚未形成菌絲;在9 h 時(shí),空白對(duì)照組可見大量菌絲交織,黃芩苷組和氟康唑組可見較短菌絲的形成,而兩藥聯(lián)用組則只有酵母相細(xì)胞,未見菌絲形成。

同時(shí)觀察了含血清YPD固體培養(yǎng)基中兩藥聯(lián)合對(duì)白念珠菌菌落邊緣菌絲的影響。如圖2所示,空白組白念珠菌菌落邊緣形成濃密的長菌絲,而黃芩苷組、氟康唑組的菌絲則形成的較稀疏,且較短。而當(dāng)兩藥聯(lián)用時(shí),白念珠菌菌落邊緣光滑,菌絲消失。

2.2 黃芩苷聯(lián)合氟康唑?qū)Π啄钪榫麅?nèi)c AMP含量的影響以及回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證

c AMP是調(diào)節(jié)白念珠菌菌絲發(fā)育的一個(gè)重要成分。因此,我們進(jìn)一步檢測(cè)黃芩苷聯(lián)合氟康唑干預(yù)后菌體內(nèi)c AMP的含量變化。結(jié)果如圖3所示,黃芩苷組和氟康唑組均不能降低胞內(nèi)c AMP的含量(P＞0.05),而兩藥聯(lián)用能顯著降低胞內(nèi)c AMP的含量(P＜0.05)。

同時(shí),回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在含血清YPD液體或固體培養(yǎng)基中,兩藥聯(lián)用明顯抑制生長。而當(dāng)加入外源性c AMP(5 mmol/L)后,則菌絲生長的抑制現(xiàn)象被逆轉(zhuǎn),即菌絲又重新生長,提示兩藥聯(lián)合對(duì)菌絲形成的抑制作用與胞內(nèi)c AMP的含量密切相關(guān)(見圖4)。

2.3 黃芩苷聯(lián)合氟康唑?qū)Π啄钪榫鷆 AMP相關(guān)基因表達(dá)的影響

為了揭示黃芩苷聯(lián)合氟康唑抑制C.albicans SC5314的具體作用機(jī)制,我們采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了調(diào)控c AMP產(chǎn)生進(jìn)而影響菌絲發(fā)育的相關(guān)基因RAS1、CDC35和PDE2表達(dá)變化。結(jié)果如圖5所示,黃芩苷聯(lián)合氟康唑使RAS1和CDC35表達(dá)下調(diào)35%和27%,PDE2表達(dá)上調(diào)1. 21倍。

3 討 論

在白念珠菌形態(tài)發(fā)生過程中,酵母相細(xì)胞出芽形成芽管,芽管進(jìn)一步延伸發(fā)育成菌絲,菌絲相有助于其對(duì)宿主細(xì)胞的黏附和侵襲,還能逃逸免疫細(xì)胞的攻擊,因此菌絲是構(gòu)成白念珠菌的重要的毒力因子。

p H、溫度、營養(yǎng)、藥物等環(huán)境因素通過一定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響白念珠菌菌絲的發(fā)育,其中Ras-c AMP途徑近年來受到高度關(guān)注。研究表明,在白念珠菌菌絲發(fā)育早期階段,菌絲誘導(dǎo)因子如血清,葡萄糖等激活Ras1G蛋白,后者作用于腺苷酸環(huán)化酶(AC)的Ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域,促進(jìn)c AMP的產(chǎn)生,c AMP再活化c AMP反應(yīng)性PKA,繼而促進(jìn)菌絲相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,若c AMP的合成受到抑制即可阻斷酵母相向菌絲相的轉(zhuǎn)化[11]。為探討該途徑尤其是c AMP是否參與了黃芩苷聯(lián)合氟康唑?qū)Π啄钪榫z的抑制作用,我們通過菌絲誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含血清YPD液體或固體培養(yǎng)基)觀察了黃芩苷聯(lián)合氟康唑?qū)Π啄钪榫z的抑制作用。結(jié)果表明,與單用黃芩苷、氟康唑相比,兩藥聯(lián)用對(duì)白念珠菌在液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基中的菌絲形成均能發(fā)揮顯著抑制作用,而且發(fā)現(xiàn)兩藥聯(lián)用可明顯抑制白念珠菌胞內(nèi)c AMP含量,當(dāng)加入外源性c AMP之后,兩藥聯(lián)合對(duì)白念珠菌造成的不能生成菌絲的缺陷可被逆轉(zhuǎn)。由此說明,兩藥聯(lián)合抑制菌絲形成的機(jī)制與降低胞內(nèi)c AMP密切相關(guān)。

圖1 黃芩苷聯(lián)合氟康唑在含血清YPD液體培養(yǎng)基中對(duì)白念珠菌3 h、6 h、9 h菌絲形成的影響(BA:黃芩苷62.5μg/m L;FLC:氟康唑0. 125μg/m L;BA+FLC:黃芩苷62.5μg/m L+氟康唑0.125μg/m L) 圖2 黃芩苷聯(lián)合氟康唑在含血清YPD瓊脂中對(duì)白念珠菌菌絲形成的影響(BA:黃芩苷62.5μg/m L;FLC:氟康唑0.125μg/m L;BA+FLC:黃芩苷62.5μg/m L+氟康唑0.125μg/m L) 圖3 黃芩苷聯(lián)合氟康唑?qū).albicans SC5314胞內(nèi)c AMP含量的影響(BA:黃芩苷62.5μg/m L;FLC:氟康唑0.125μg/m L;BA+FLC:黃芩苷62.5μg/m L+氟康唑0.125μg/m L,與空白對(duì)照組相比**P＜0.01) 圖4 外源性c AMP(5 m M)能恢復(fù)黃芩苷聯(lián)合氟康唑?qū)z的抑制作用(BA:黃芩苷62.5μg/m L;FLC:氟康唑0.125μg/m L;BA+FLC:黃芩苷62.5μg/m L+氟康唑0.125μg/m L) 圖5 黃芩苷聯(lián)合氟康唑?qū)Π啄钪榫鷆 AMP相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.1 Effects of baicalin in combination with fluconazole on hypal formation in YPD liquid medium(containing serum)at 3,6,9 h(BA:baicalin 62.5μg/m L;FLC:fluconazole 0.125μg/m L;BA+FLC:baicalin 62.5μg/m L+fluconazole 0.125μg/m L) Fig.2 Effects of baicalin in combination with fluconazole on hypal formation in YPD agar medium(containing serum)(BA:baicalin 62.5μg/m L;FLC:fluconazole 0.125 μg/m L;BA+FLC:baicalin 62.5μg/m L+fluconazole 0.125μg/m L) Fig.3 Reduced intracellular c AMP level by baicalin in combination with fluconazole(BA:baicalin 62.5μg/m L;FLC:fluconazole 0.125μg/m L;BA+FLC:baicalin 62.5μg/m L+fluconazole 0.125μg/m L.Compared with control group,**P＜0.01) Fig.4 Exogenous c AMP(5 m M)reverts the morphological transition defect of C.albicans caused by baicalin in combination with fluconazole(BA:baicalin 62.5μg/m L;FLC:fluconazole 0.125μg/m L;BA+FLC:baicalin 62.5μg/m L+fluconazole 0.125μg/m L) Fig.5 Effects of baicalin in combination with fluconazole on the expression of C.albicans c AMP-related genes

c AMP是Ras-c AMP途徑中的一個(gè)環(huán)節(jié),該途徑還涉及Ras1、Cdc35、Pde2等組分。其中,Ras1是該途徑中與外界因素發(fā)生作用的上游組分,Cdc35是合成c AMP的腺苷酸環(huán)化酶,Pde2則是降解c AMP的磷酸二酯酶,為該途徑的負(fù)調(diào)控組分[11]。我們利用qRT-PCR檢測(cè)了這條通路中上述組分的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)RAS1和CDC35基因表達(dá)分別下調(diào)35%和27%,編碼磷酸二酯酶的基因PDE2表達(dá)上調(diào)1.21倍。僅從表達(dá)量結(jié)果來看,無顯著性差異。由于Ras1、Cdc35、Pde2等是調(diào)控c AMP的上游組分,因此不排除兩藥聯(lián)用后對(duì)上游其他組份(如Srv2,Gpa2等)的下調(diào)作用,但具體是哪些組分尚有待進(jìn)一步驗(yàn)證。另外。c AMP水平降低是否影響到c AMP反應(yīng)性PKA活化等環(huán)節(jié)也是下一步的研究?jī)?nèi)容。

綜上所述,黃芩苷聯(lián)合氟康唑顯著抑制白念珠菌酵母-菌絲形態(tài)轉(zhuǎn)化,其作用機(jī)制推測(cè)可能與Ras-c AMP信號(hào)通路中c AMP的下調(diào)有關(guān)。

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[本文編輯]衛(wèi)鳳蓮

·消息·

Effect of baicalin in combination with fluconazole against Candida albicans morphological transition from yeast to hyphae via inhibiting c AMP

FENG Xin,SHI Gao-xiang,YUN Yun,WU Da-qiang,SHAO Jing,WANG Tian-ming,WANG Chang-zhong
(School of Integrated Traditional and Western Medicine,Anhui University of Chinese Medicine,Institute of Integrated Traditional and Western Medicine,Anhui Academy of Chinese Medicine,Hefei 230038)

【Abstract】Objective This study aimed to investigate the antifungal activity of baicalin in combination with fluconazole against Candida albicans morphological transition from yeast to hyphae and to explore the mechanism.Methods The hyphainducing liquid and solid media were uesd to observe the effect of baicalin alone or in combination with fluconazole on yeasthapal transformation in C.albicans;The intracellular c AMP level and c AMP rescue was measured by ELISA Kit;Quantitative real time PCR(q RT-PCR)was performed to measure the expression of c AMP-related genes.Results Baicalin in combination with fluconazole could inhibit hyphae formation and intracellular c AMP level obviously;exogenous c AMP could convert hypha-inhibiting effect;And expression of RAS1 and CDC35 were downregulated by 35%and 27%respectively,while the expression of PDE2 was upregulated by 121%.Conclusion Mechanism of baicalin in combination with fluconazole inhibiting C. albicans morphological transition was probabaly via down-regulating the intracellular c AMP.

【Key words】C.albicans;baicalin;fluconazole;morphological transition;c AMP

[收稿日期]2016-01-15

通訊作者:汪長中,E-mail:ahwcz63@sina.com

作者簡(jiǎn)介:馮鑫,男(回族),碩士,講師.E-mail:fx74@163.com

基金項(xiàng)目:安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1408085MH165, 1508085MH163)

【中圖分類號(hào)】R 379.4

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1673-3827(2016)11-0008-05