樊建峰 林碧雯 李恒進(解放軍總醫(yī)院皮膚科,北京100853)

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盧立康唑醇質體體外抗真菌活性研究

樊建峰 林碧雯 李恒進
(解放軍總醫(yī)院皮膚科,北京100853)

【摘要】目的 檢測盧立康唑醇質體體外抗菌活性。方法 采用微量液基稀釋法檢測盧立康唑醇質體、脂質體、45%水醇溶液對皮膚癬菌、念珠菌的體外抗菌活性。結果 盧立康唑醇質體對皮膚癬菌及念珠菌的MIC值低于脂質體及水醇溶液,且對毛癬菌屬較念珠菌屬的MIC值更低。結論 盧立康唑醇質體的體外抗菌性能優(yōu)于脂質體及水醇溶液。

【關鍵詞】盧立康唑醇質體;皮膚癬菌;念珠菌;藥物敏感性

[Chin J Mycol,2016,11(1):13-15]

盧立康唑醇質體具有較好的滲透性及透皮率,為檢測盧立康唑醇質體、脂質體及醇溶液的體外抗真菌活性,本試驗采用美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)[1-2]所推薦的微量液基稀釋法來測定上述制劑的MIC值,用目測法觀察結果。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

紅色毛癬菌臨床株(5株)、須癬毛癬菌臨床株(5株)、近平滑念珠菌標準株ATCC22019、白念珠菌標準株ATCC90028、白念珠菌臨床株(4 株)、近平滑念珠菌臨床株(4株)、克柔念珠菌臨床株(5株)、光滑念珠菌臨床株(5株),均來自本院微生物科。

1.2 實驗儀器與試劑

U型底96孔細胞培養(yǎng)板(浙江拱東醫(yī)用塑料廠)、麥氏比濁管(法國梅里埃公司)、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)、超凈工作臺(蘇錦集團安泰公司)、分析天平(上海民橋醫(yī)療器械有限公司)。

沙氏培養(yǎng)基(SDA)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA本院微生物科),氟康唑(上海三維制藥)、盧立康唑醇質體、脂質體、45%乙醇水溶液(試驗中自制)。

1.3 實驗方法

藥物濃度配制 ①用無菌注射用水稀釋盧立康唑的各種劑型(盧立康唑醇質體、盧立康唑脂質體、45%盧立康唑乙醇水溶液),使其終質量濃度為1 600μg/m L,置于-20℃冰箱中備用。②取1 600 μg/m L藥液用RMPI-1640培養(yǎng)基50倍稀釋,配第1管濃度為32μg/m L。

皮膚癬菌菌懸液配制 ①取1 m L無菌的0. 85%鹽水加入無菌試管中,挑取一定量的菌落,用巴氏吸管輕輕抽吸,制成菌懸液。②將菌懸液吸至無菌試管中,靜置3～5 min后,取上部勻質液體(含孢子或菌絲片段),在振蕩器上震蕩15 s。③用無菌0.85%鹽水調節(jié)菌懸液濃度,使其麥氏濁度值調整至0.5,將此菌懸液用RPMI-1640稀釋50倍得出2倍所需終濃度(0.4×104～5×104CFU/ m L)的菌懸液。

念珠菌菌懸液配制 用RPMI-1640稀釋2 000倍得出終濃度(0.5×103～2.5×103CFU/ m L)的菌懸液。

接種和培養(yǎng) 在96孔板的每孔加入100μL的菌懸液,每次實驗均包括標準株ATCC90028和ATCC6258。念珠菌藥敏板于35℃培養(yǎng),皮膚癬菌藥敏板于28℃培養(yǎng)。

質控設置 采用ATCC22019為念珠菌質控菌株,ATCC90028為皮膚癬菌質控菌株,每次實驗同時做其氟康唑抑菌藥敏。只有當氟康唑對ATCC22019的MIC介于1～4μg/m L,對ATCC90028的MIC≤0.125～0.5μg/m L方認為實驗準確可靠。

MIC值判定及結果 MIC值為肉眼直接觀察到的真菌生長完全被抑制時的抗真菌藥物濃度,由于唑類藥物終點不易判定,皮膚癬菌7 d讀結果, 以50%生長抑制為MIC終點濃度。念珠菌2 d讀結果,以80%生長抑制為MIC終點濃度。

目測觀察各實驗孔的菌生長量 ①清晰(100%被抑制生長)。②略模糊(80%被抑制生長)。③濁度顯著減低(50%被抑制生長)。④濁度輕度減低(20%被抑制生長)。⑤濁度未減低(0%被抑制生長)。

2 結 果

盧立康唑醇質體及其對照制劑的MIC結果見圖1、表1。

盧立康唑醇質體與脂質體對上述各菌的MIC值低于盧立康唑水醇溶液(P＜0.01),盧立康唑醇質體與脂質體對上述各菌MIC值比較均無統(tǒng)計學意義,考慮與樣本量低有關。參照圖1盧立康唑不同劑型對念珠菌菌株MIC值:醇質體＜脂質體＜水醇溶液;盧立康唑不同劑型對紅色毛癬菌及須癬毛癬菌菌株MIC值:醇質體/脂質體＜水醇溶液。另外,盧立康唑對毛癬菌屬較念珠菌屬相比MIC值低,更敏感。

3 討 論

盧立康唑是新型抗真菌藥物,有抗菌活性強、起效快等優(yōu)點,且中國市場并未使用,目前也無醇質體制劑。因此我們選取其為主藥,進行醇質體抗菌性研究。目的在于加強主藥的抗菌能力,使其發(fā)揮更大的抗菌作用。盧立康唑脂質體體外實驗中, Koga等[3]用肉湯微量稀釋法比較了盧立康唑與其他9種藥物(特比萘芬、利拉萘酯、布替萘芬、阿莫羅芬、酮康唑、克霉唑、奈康唑、咪康唑和聯(lián)苯芐唑)的抗菌活性,顯示盧立康唑對毛癬菌屬有較強的抗菌活性。

圖1 盧立康唑不同劑型最低抑菌濃度Fig.1 The MICs of luliconazole ethosome,liposome and hydroalcoholic solution

真菌感染一般分為淺部真菌感染和深部真菌感染。在我國,毛癬菌屬中的紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、紫色毛癬菌是體股癬、手足癬的常見致病菌[4-5]。因此本實驗主要選取白念珠菌、紅色毛癬菌、須癬毛癬菌等作為研究菌株,檢測盧立康唑醇質體及各種對照劑型MIC值,初步評價其體外抗真菌活性。

由于皮膚角質層屏障的存在,一般經(jīng)皮外用藥難以攜帶大量藥物進入皮膚深層,達到理想的抗菌效果。劉利萍等[6]制備的克霉唑醇質體,體外抗菌活性實驗結果顯示,對白念珠菌的最低抑菌濃度值是克霉唑脂質體的50%,是游離克霉唑乙醇水溶液的12.5%,最低殺菌濃度的變化趨勢與最低抑菌濃度類似,醇質體組殺菌所需克霉唑劑量明顯低于脂質體組。另外,在殺菌起效方面,克霉唑醇質體明顯優(yōu)于脂質體和乙醇水溶液。最低抑菌濃度、最低殺菌濃度和抗菌-時效實驗結果從另一方面也證明了醇質體比脂質體具有更快的透過速率、更高的滲透能力和更短的時滯,從而使藥物能夠更快和更好的發(fā)揮抗菌作用,有助于深層真菌感染的治療。鹽酸阿莫羅芬醇質體經(jīng)共聚焦激光掃描顯微鏡實驗表明,醇質體與脂質體及乙醇溶液相比,可更有效增加藥物的透皮量和穿透深度,增加藥物在皮膚中的滯留量[7]。

表1 盧立康唑不同劑型最低抑菌濃度Tab.1 The MICs of luliconazole ethosome,liposome and hydroalcoholic solution

本試驗中盧立康唑醇質體對七種菌株的MIC值均低于盧立康唑其他對比劑型(脂質體、水醇溶液),考慮可能與醇質體穿透機制中細胞內傳遞有關。它可攜帶藥物直接透過細胞膜將藥物釋放到細胞內發(fā)揮作用。盧立康唑軟膏不能溶于水,無法均勻分散在水中,因此未選取其作為對照。對白念珠菌及其他四種念珠菌的MIC值均低于脂質體及水醇溶液,對紅色毛癬菌及須癬毛癬菌的MIC值也低于水醇溶液。與其他研究中克霉唑和阿莫羅芬的醇質體制劑的體外抗真菌活性較脂質體和水醇溶液強是一致的。但因選取菌株較少,樣本量低,造成抑菌濃度范圍接近,且無統(tǒng)計學差異,所以在下一步盧立康唑醇質體對豚鼠真菌模型上的療效觀察之前,應收集大量菌株,重復體外抑菌實驗。同時我們發(fā)現(xiàn)盧立康唑對紅色毛癬菌、須癬毛癬菌較念珠菌敏感程度高,這與國外文獻報道一致。

參考文獻

[1]Clinical and Laboratory Standards Institute/National Committee for Clinical Laboratory Standards.M27-A3.Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeast.Approved Standard,3rd ed[S].Wayne,PA:Clinical and Laboratory Standards Institute,2009.

[2]Clinical and Laboratory Standards Institute/National Committee for Clinical Laboratory Standards.M38-A2.Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeast.Approved Standard,3rd ed[S].Wayne,PA:Clinical and Laboratory Standards Institute,2008.

[3]Koga H,Nanjob Y,Makimura K,et al.In vitro antifungal activities of luliconazole,a new topical imidazole[J].Med Mycol,2009,47(6):640-647.

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[6]劉利萍,毛威,安原初.克霉唑醇質體和脂質體的體外經(jīng)皮滲透性及抗菌性的對比研究[J].中國藥學雜志,2009,44(4): 278-282.

[7]王慧,魏玉輝,劉文靜,等.鹽酸阿莫羅芬乙醇脂質體的制備及評價[J].中國新藥雜志,2010,19(13):1175-1179.

[本文編輯]施 慧

·論著·

The antifungal susceptibility test in vitro of luliconazole ethosomes

FAN Jian-feng,Lin Bi-wei,Li Heng-jin
(PLA General Hospital Department of Dermatology,Beijing 100853,China)

【Abstract】Objective To study antifungal susceptibility of luliconazole ethosomes in vitro.Methods In vitro,antifungal activity of luliconazole ethosome,liposome,hydroalcoholic solution:MICs were determined using the micro-broth dilution assay.Results The MIC of the luliconazole ethosome was lower than that of liposome form or hydroalcoholic solution form.The MIC of luliconazole ethosome to Trichophyton spp.was lower than the sensitive degree to Candida spp.Conclusions In vitro,the antifungal effect of luliconazole ethosome is better than luliconazole liposome or its hydroalcoholic solution.

【Key words】luliconazole ethosomes;dermatophytes;Candida;antifungal succeptibility

[收稿日期]2014-12-10

通訊作者:李恒進,E-mail:lhengjin@163.com

作者簡介:樊建峰,男(漢族),碩士,副主任醫(yī)師.E-mail:fanjianfeng1@tom.com

【中圖分類號】R 978.5

【文獻標識碼】A

【文章編號】1673-3827(2016)11-0013-03