張燕燕 許慕慧 馬玲璇 劉桂香 徐成康 李 璽

羊膜干細(xì)胞用于修復(fù)損傷子宮內(nèi)膜的動物實驗研究

張燕燕 許慕慧 馬玲璇 劉桂香 徐成康 李 璽

目的通過使用羊膜干細(xì)胞修復(fù)損傷的小鼠子宮內(nèi)膜實驗，了解羊膜干細(xì)胞是否有助于子宮內(nèi)膜的修復(fù)，為將來進一步應(yīng)用于臨床提供依據(jù)。方法參照人羊膜干細(xì)胞方法先制備小鼠羊膜干細(xì)胞，再建立小鼠子宮內(nèi)膜損傷模型，然后根據(jù)方法不同分為3組(造模組50只，假手術(shù)組20只，對照組20只)。造模術(shù)后10 d取造模組10只，假手術(shù)組10只，對照組10只處死，肉眼觀察宮腔改變，取出各組小鼠子宮置入中性甲醛固定，HE及Masson染色，對其進行纖維化半定量評分。各組再取10只小鼠與雄性小鼠合籠飼養(yǎng)，妊娠10 d開腹記數(shù)著床胚胎數(shù)作為評價生育能力指標(biāo)。另外30只造模組行粘連分離后分別給予宮腔內(nèi)注射羊膜干細(xì)胞、口服雌激素及空白。結(jié)果模型組在造模后宮腔纖維化面積比例增加，腺體數(shù)量減少，妊娠能力明顯下降，而假手術(shù)組及對照組無明顯變化，造模組與假手術(shù)組及對照組相比，3項指標(biāo)都有顯著性差異(P＜0.05)，對造模成功組采用不同治療方案，結(jié)果顯示，干細(xì)胞宮腔內(nèi)注射可以改善宮腔纖維化面積及腺體數(shù)量，而雌激素?zé)o明顯作用，3組治療相比，干細(xì)胞組比其他組作用更明顯，差異有顯著性((P＜0.05)。結(jié)論宮腔粘連分離后注入羊膜干細(xì)胞有利于子宮內(nèi)膜的修復(fù)。

羊膜干細(xì)胞;子宮腔粘連;內(nèi)膜修復(fù)

【Author's address】 Dafeng hospital in Chaoyang of Santou，Santou，515154，China

根據(jù)以往研究認(rèn)為子宮內(nèi)膜的再生來源于干細(xì)胞以及羊膜含有豐富干細(xì)胞的結(jié)果，本研究采用羊膜干細(xì)胞進行內(nèi)膜修復(fù)實驗。了解羊膜干細(xì)胞宮腔內(nèi)注射治療是否有利于內(nèi)膜修復(fù)。為臨床上使用羊膜干細(xì)胞治療因內(nèi)膜損傷引起的嚴(yán)重宮腔粘連提供依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 小鼠羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的制備與分離

①小鼠羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(mAMCs)分離方法［1］:用0.075%胰蛋白酶消化新鮮小鼠羊膜4次，每次10min，每次之間在4℃低溫下離心5min，1800 r/min，去上清，加入新鮮的消化液，最后應(yīng)用0.075%膠原酶消化90min，用10%FBS液洗滌，可以得到上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞混合的單細(xì)胞懸液。將mAMCs懸浮于含10%FBS的DMEM液中，調(diào)整為1.5×104/mL接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，附壁生長。②細(xì)胞收集:在37℃，通氣(95%O2和5%CO2)的條件下，用0.01%胰酶及0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化貼壁的細(xì)胞8～10min。在倒置顯微鏡下觀察，待80%以上的細(xì)胞開始變圓時加入適量的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液終止消化，并將消化后的細(xì)胞收集至離心管中，以1500 r/min離心3min，棄上清，用1mL細(xì)胞重懸液懸起細(xì)胞。③免疫熒光及免疫組化染色:取在小鼠羊膜鋪片、培養(yǎng)皿上培養(yǎng)的mAMCs，在4℃用4%多聚甲醛固定后，用含0.1%Triton-X100和0.5%BSA的磷酸鹽緩沖液(PBS)透膜同時封閉45min，以1∶200稀釋的抗八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子(OCT)3/4、胚胎階段特異性細(xì)胞表面抗原(SSEA-1)一抗于4℃下反應(yīng)，隔夜，用0.05 mol/L TBS液清洗后再加入Histofine Immunostaining kit中相應(yīng)的二抗于室溫下孵育45min，清洗后用FITC或Texas red-Conjugated Streptavidin于室溫下孵育30min，用0.01 mol/L PBS液清洗后加入10倍稀釋的Hoechst33258核染，以Glycergel Mounting Medium封片，熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞并采集圖像。階段特異性胚胎抗原1(SSEA-1)的免疫組化染色采用Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kitt(Vector Laboratories)按比例配好的顯色液(含左旋咪唑Dako Corp.)顯色5min，清洗后，應(yīng)用 Hematoxylin細(xì)胞核染色1min。Glycergelmounting Medium(Dako Corp)封片，顯微鏡下觀察細(xì)胞并采集圖像，余同免疫熒光染色。

1.2 內(nèi)膜缺失動物模型建立后分組及治療

按文獻方法，造模組50只麻醉后于下腹部正中，尿道上端約1cm處切開皮膚，暴露子宮，用4號針頭于子宮分叉處向左子宮內(nèi)緩慢注入25%苯酚膠漿0.04mL。假手術(shù)組20只開腹后向右側(cè)子宮注入0.04mL生理鹽水。術(shù)后第10天處死造模組10只，假手術(shù)組10只，正常對照組10只，取出各組小鼠的子宮組織置入中性甲醛固定。各組再取10只的大鼠隨機1只宮腔粘連組雌性大鼠、1只假手術(shù)對照或正常對照組雌性大鼠與1只雄性大鼠合籠飼養(yǎng)，次晨行雌鼠的陰道細(xì)胞涂片，以涂片發(fā)現(xiàn)精子當(dāng)日為妊娠第1天D1)，妊娠D10開腹，計數(shù)著床胚胎數(shù)。剩下的30只造模組行宮腔粘連分離后分3組給予不同處理，分別是宮腔內(nèi)注入干細(xì)胞、口服雌激素及空白。

1.3 子宮內(nèi)膜纖維化程度半定量評分

結(jié)合高慧［2］提出的分級方法對子宮進行宮腔粘連大體分級，根據(jù)纖維蛋白原的增多及腺體數(shù)目的減少對子宮內(nèi)膜纖維化程度進行半定量評分:將獲取的右側(cè)子宮內(nèi)膜樣組織進行HE、Masson染色，參照以下標(biāo)準(zhǔn)進行閱片。

1.4 羊膜干細(xì)胞移植

在模型建立成功后，對有粘連的宮腔進行分離，恢復(fù)正常形態(tài)后行干細(xì)胞移植。用體積分?jǐn)?shù)為0.125%胰酶消化已貼壁生長呈梭形的鼠羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(mAMCs)，用胎牛血清終止消化，然后用吸管反復(fù)吹打直至細(xì)胞脫落，1000 r/min離心5min，棄上清，用PBS重懸細(xì)胞，1000 r/min離心3min，棄上清，再用PBS重懸細(xì)胞，計數(shù)mAMCs按3.0×106/只宮腔移植，分mAMCs移植組和空白對照組。

1.5 子宮內(nèi)膜切片組織學(xué)觀察

每周取材1次，每次各組取2只小鼠，對mAMCs治療組和損傷組小鼠子宮內(nèi)膜外觀拍照，將取出的子宮內(nèi)膜組織浸泡于體積分?jǐn)?shù)為10%的中性福爾馬林中，24 h后，常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯處理后做石蠟包埋切片，切片厚度為4μm，經(jīng)HE染色后在普通光學(xué)顯微鏡下觀察子宮內(nèi)膜的組織學(xué)變化。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS10.0統(tǒng)計學(xué)分析軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，并進行t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 羊膜間充質(zhì)細(xì)胞及其分化潛能

麻醉后動物手術(shù)，顯示鼠 Y型子宮結(jié)構(gòu)(見圖1)。從羊膜中分離出間充質(zhì)細(xì)胞(HAMCs)，經(jīng)體外擴增后顯示出有分化成脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞的潛能(見圖2)。

圖1 鼠Y型子宮結(jié)構(gòu)

圖2 羊膜間充質(zhì)細(xì)胞及其分化潛能

2.2 小鼠造模后宮腔粘連纖維化評分及對妊娠的影響

造模組在造模后宮腔纖維化面積比例增加，腺體數(shù)量減少，妊娠能力明顯下降，而假手術(shù)組及對照組無明顯變化，造模組與假手術(shù)組及對照組相比，3項指標(biāo)都有顯著差異(P＜0.05)，見表1。

表1 各組造模后宮腔纖維化面積比率及腺體數(shù)量比較(n=10，±s)

表1 各組造模后宮腔纖維化面積比率及腺體數(shù)量比較(n=10，±s)

注:與正常對照組及假手術(shù)組相比，均1)P＜0.05

組別 纖維化面積比率 腺體數(shù)量/n 著床胚胎數(shù)/n造模組 0.743±0.0661)4.19±1.351)01)假手術(shù)組 0.275±0.094 14.97±1.68 6正常對照組0.221±0.065 15.16±1.32 5

2.3 造模成功組在分離粘連及干細(xì)胞移植后宮腔恢復(fù)情況

對造模成功組采用不同治療方案，結(jié)果顯示，干細(xì)胞宮腔內(nèi)注射可以改善宮腔纖維化面積及腺體數(shù)量，而雌激素?zé)o明顯作用，3組治療相比，干細(xì)胞組比其他組作用更明顯，差異有顯著性(P＜0.05)，見表2。

表2 造模成功組分離粘連及干細(xì)胞移植后宮腔纖維化面積比率及腺體數(shù)量比較 (n=10，±s)

注:與空白對照組及雌激素治療組相比，均1)P＜0.05

組別 纖維化面積比率 腺體數(shù)量干細(xì)胞治療組 0.533±0.0251)10.68±1.551)雌激素治療組 0.236±0.054 5.11±1.24空白對照組0.225±0.038 4.21±1.16

3 討論

隨著各種子宮腔內(nèi)操作手術(shù)(如人流刮宮、縱隔切除等)的增多，發(fā)生宮腔粘連(Asherman's syndrome)的病例也隨著增加，而這一并發(fā)癥嚴(yán)重影響了女性的生育能力。雖然以往采用了多種治療措施，但嚴(yán)重宮腔粘連的治療效果仍然很差［3-4］，致使臨床醫(yī)生束手無策，很多患者因此喪失了生育的能力。因此，探索新的治療方法，減少宮腔粘連，盡量避免女性患者喪失生育能力是當(dāng)前婦科需要解決的任務(wù)。目前的臨床研究顯示在處理粘連恢復(fù)宮腔形態(tài)方面效果顯著，但在預(yù)防粘連復(fù)發(fā)及修復(fù)內(nèi)膜方面仍無良策。文獻報道［5］，宮腔粘連術(shù)后復(fù)發(fā)率為3.1%～23.5%，其中20.0%～62.5%為重度粘連，預(yù)防復(fù)發(fā)是治療成功的關(guān)鍵。已有的研究結(jié)果表明，宮腔粘連術(shù)后預(yù)防再粘連的處理，無論是放置宮內(nèi)節(jié)育器、放置球囊導(dǎo)尿管、雌孕激素周期治療、血管擴張劑、生長激素、透明質(zhì)酸鈉、醫(yī)用幾丁糖的應(yīng)用，都不能有效解決宮腔粘連處理后內(nèi)膜修復(fù)的問題。到目前為止尚未能尋找到行之有效的辦法來解決宮腔粘連處理后內(nèi)膜修復(fù)的問題，探索新的更有效的修復(fù)內(nèi)膜措施成為生殖及計劃生育領(lǐng)域亟需解決的難題。已有實驗研究表明［6］，胚胎干細(xì)胞(ESCs)移植有助于小鼠新鮮損傷的子宮內(nèi)膜修復(fù)，外源的干細(xì)胞部分地補充了組織干細(xì)胞的功能，但也表現(xiàn)出高致瘤性。本研究擬采用羊膜干細(xì)胞作為種子細(xì)胞用于子宮內(nèi)膜修復(fù)的研究，有望解決胚胎干細(xì)胞高致瘤性的缺點，而且羊膜來源容易，費用極低，是理想的種子細(xì)胞來源，因此，研究它的有效性具有廣泛的應(yīng)用價值。

本研究采用小鼠作為動物模型，主要在于飼養(yǎng)成本低，適合大規(guī)模復(fù)制。造模用的是化學(xué)物苯酚，曾經(jīng)用于輸卵管結(jié)扎，此造模方法簡單、可靠、周期短，造模成功后病理結(jié)果與人類宮腔粘連病理結(jié)果一致。在造模成功后，妊娠率明顯下降，說明宮腔粘連會引起妊娠困難。人羊膜干細(xì)胞分離培養(yǎng)及培養(yǎng)已經(jīng)成熟，而小鼠羊膜干細(xì)胞分離培養(yǎng)比較少，本實驗中采用小鼠干細(xì)胞特異標(biāo)志物Oct3/4及SSEA-1進行篩選，得到了比較純的羊膜干細(xì)胞。Oct3/4基因只能在多能細(xì)胞中表達［7］，SSEA-1是干細(xì)胞未分化的標(biāo)志物［8］。在分離粘連后植入羊膜干細(xì)胞可以明顯改善再次粘連的發(fā)生，與以往常用的補充雌激素相比，效果更明顯。有理由認(rèn)為用羊膜干細(xì)胞治療將成為未來臨床治療宮腔嚴(yán)重粘連的措施之一。

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Experimental Study of Amniotic Mesenchymal Stem Cells Used for Repair the Injuried Endometrium of Mouse

ZHANG Yanyan，XU Muhui，MA Lingxuan，et al

ObjectiveTo investigate whether the amniotic mesenchymal stem cells(mAMC)could repair injured mouse endometrium.MethodsFemale moue amniotic mesenchymal stem cells(mAMC)were established with reference to the method that used in human Amniotic mesenchymal stem cells collection.The mouse models of the injured mouse endometrium were established and then were divied into three groups(model qroup，n=50，false group，n=20 and normal control group，n=20)according to the methods used，10 days after operation.10 mice were selected in every group and were killed and change of uterine cavity were observed，then uterines were fixed with neutral formalin and then were dyed with HE and Masson.The fibrosis of endometrium was evaluated.another10 female mice in each group were reared with male mice，the number of implanted embryo was counted as indication of fertility after10days of pregnancy.Another30 mice in model group were treated with mAMC，estrogen and empty after separation of fibre adhesion and the reparation of injured endometrium after transplanted stem cells were observed.ResultsAfter opertion，the fibrosis of endometrium increased，the number of gland decreased and the fertility droped in model group，there was no change in other groups.There was a obvious difference between operation group and other group(P＜0.05).In the model group，different treatment were used after separation of fibre adhesion，mAMC intrauterin-injected could obviously improved the result of repairation.ConclusionmAMC intrauterin-injected could obviously improved the result of repairation after separation of fibre adhesion in uterine.

Amniotic Mesenchymal Stem Cells;Endometrium;Repairement Of Injuried Endometrium

R-332

:Adoi:10.3969/j.issn.1671-332X.2016.08.008

廣東省科技計劃項目(編號:2012B061700065);汕頭市科技計劃項目重點項目［編號:(2014)242-70］

張燕燕 許慕慧 馬玲璇 劉桂香:汕頭市潮陽區(qū)大峰醫(yī)院 廣東汕頭 515154

徐成康:中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院 廣東廣州 510080

李 璽:中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院 廣東廣州 510630

李 璽