何成偉，王培坤，秦麗莉，畢玉彧，鄒廣珍，楊永立，彭　昊，韋　平*

(1. 廣西憑祥出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣西憑祥 532600；2. 廣西大學(xué)養(yǎng)禽與禽病學(xué)研究所，廣西南寧 530004)

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廣西憑祥斗雞禽白血病病毒檢測及分離株env基因分析

何成偉1,2，王培坤2，秦麗莉2，畢玉彧2，鄒廣珍2，楊永立2，彭昊2，韋平2*

(1. 廣西憑祥出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣西憑祥 532600；2. 廣西大學(xué)養(yǎng)禽與禽病學(xué)研究所，廣西南寧 530004)

摘要:為了解廣西憑祥市特有家禽品種斗雞禽白血病病毒(ALV)的感染情況，采集了該市3個雞場斗雞的肛拭子、血清、血漿樣品共344份，用禽白血病ELISA檢測試劑盒進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，斗雞ALV感染情況嚴(yán)重，其中肛拭樣品ALV-p27抗原陽性率高達(dá)39.13%，血清樣品病毒分離陽性率為12.97%，ALV-J和ALV-A/B抗體陽性率分別為22.39%和7.46%；對從2只斗雞獲得的病毒分離株DJ-3-18和DJ-45進(jìn)行病毒囊膜蛋白基因env的擴(kuò)增、序列測定及比較分析，結(jié)果顯示2株病毒的gp85基因與ALV-A亞群參考株之間氨基酸的同源性為88.2%～96.5%，gp37基因與ALV-A亞群參考株之間氨基酸的同源性為91.4%～98.0%，其中與臺灣A亞群蛋雞源分離株TW-3577的親緣關(guān)系最近，而與ALV其他亞群毒株的同源性則較低。結(jié)果表明，首次獲得的2株斗雞源ALV分離株屬A亞群。

關(guān)鍵詞:斗雞；禽白血病；流行病學(xué)調(diào)查；env基因；ALV-A亞群

禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科α反轉(zhuǎn)錄病毒屬，可引起禽的免疫抑制、生長抑制和臨床腫瘤為特點(diǎn)的傳染性致骨髓細(xì)胞瘤疾病或成髓性白血病[1]。自2000年杜巖等[2]首次報道在中國分離到J亞群禽白血病(Subgroup J of avian leukosis virus，ALV-J)以來，該病迅速在中國蔓延，眾多品種雞中相繼報道分離到ALV-J[3-8]，并給我國養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。

斗雞(game fowl)體型魁梧、體質(zhì)健壯結(jié)實(shí)、結(jié)構(gòu)勻稱緊湊、筋肉發(fā)達(dá)強(qiáng)健，以性強(qiáng)悍、善斗為基本特征。廣西憑祥市位于我國西南，與越南相鄰。該市的斗雞自2005年開始從鄰國越南引進(jìn)后自行選擇繁育，近年來斗雞產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，斗雞養(yǎng)殖規(guī)模逐年擴(kuò)大。據(jù)統(tǒng)計，憑祥市目前有斗雞養(yǎng)殖戶150戶左右，年產(chǎn)值近億元。在生產(chǎn)過程中，據(jù)養(yǎng)殖戶反映，一些雞個體在成年后出現(xiàn)內(nèi)臟腫瘤而死亡，而且有逐年增多趨勢。之前沒有對病例進(jìn)行過確診，也沒有開展過禽白血病的調(diào)查與凈化工作。為了確診這些病例，也為了了解該地區(qū)斗雞中ALV感染情況、病毒類型與特征等，為將來可能進(jìn)行的禽白血病凈化與防控工作提供依據(jù)，課題組對該地區(qū)幾個規(guī)模較大的斗雞養(yǎng)殖場進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，并對其中獲得的2個分離株進(jìn)行了序列分析以及遺傳進(jìn)化分析。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品本次調(diào)查選擇廣西憑祥市目前3個規(guī)模最大的斗雞養(yǎng)殖場進(jìn)行，檢測樣品為雞的泄殖腔肛拭子(后面簡稱為肛拭子)92份、血漿185份、血清67份。

1.1.2主要試劑禽白血病病毒p27抗原試劑檢測試劑盒，禽白血病病毒A/B亞群抗體、J亞群抗體檢測試劑盒為北京IDEXX生物科技有限公司產(chǎn)品；DF-1細(xì)胞由廣西大學(xué)養(yǎng)禽與禽病學(xué)研究所保存；基因克隆載體pUC-T、感受態(tài)Dpα細(xì)菌、2×TaqPCR Mix為北京康為世紀(jì)公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000為楚杰生物科技有限公司產(chǎn)品；胎牛血清和DMEM為GIBCO公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計與合成參照文獻(xiàn)[9]設(shè)計，并交由北京華大科技有限公司合成ALV-A env基因擴(kuò)增引物，env-F：5′-GGATGAGGTGACTAAGAAAG-3′，env-R：5′-ACACTACATTTCCCCCTCCCTAT-3′，擴(kuò)增片段大小為2 200 bp左右。ALV-A、ALV-B、ALV-J的分型引物，參考相應(yīng)文獻(xiàn)[2, 10-11]設(shè)計合成。

1.2.2樣品ELISA檢測與病毒分離

1.2.2.1樣品處理及檢測泄殖腔肛拭子樣品采集后加到檢測試劑盒專門配置稀釋液中冷凍保存。檢測前凍融3次進(jìn)行檢測；血清、血漿樣品則是按常規(guī)方法無菌采集，用抗體檢測試劑盒分別進(jìn)行A/B亞群抗體、J亞群抗體的檢測。

1.2.2.2病毒分離培養(yǎng)選擇泄殖腔肛拭子ALV-p27抗原檢測呈陽性的個體及全部的公雞個體35只，分別采集其血漿，接種DF-1細(xì)胞進(jìn)行病毒分離，具體步驟參考文獻(xiàn)[4]的方法。取0.5 mL血漿接種于長滿DF-1細(xì)胞單層的培養(yǎng)板中，37 ℃孵育2 h后，吸棄血漿，加入含10 mL/L FBS的DMEM維持液培養(yǎng)3 d，更換培養(yǎng)基后繼續(xù)維持至第9天。

1.2.2.3分離株P(guān)CR鑒定按照DNA抽提試劑盒說明書，抽提第2代細(xì)胞培養(yǎng)物的DNA，置-20℃保存。用ALV-A、ALV-B、ALV-J引物進(jìn)行分型鑒定，用env-F、env-R進(jìn)行ALV-A env 基因的擴(kuò)增。

1.2.3env基因序列測定及分析對PCR鑒定為陽性的分離株用env-F和env-R引物進(jìn)行env基因的PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min；PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收后，與pUC-T載體22 ℃連接1 h后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Dpα感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)1 h后，涂LB平板培養(yǎng)；過夜后挑取單個菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，菌液提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR鑒定為陽性的克隆，送3個克隆樣品到華大基因公司測序；利用DNA Star Lasergene 7.1軟件對所獲得的序列及從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載的12個參考株LR-9 (AY350569 )、HPRS-103 (Z46390)、MAV-1(L10922)、2011NDVP4(KF866225)、GXSH01( HM988993)、RSA(M37980)、SDAU09C1(HM452339)、TW3577(HM582657 )、 Schmidt-Ruppin B(AF052428 )、Prague C(J02342)、 Schmidt-Ruppin D(D10652)、ev-1(AY013303)的序列進(jìn)行比較分析。

2結(jié)果

2.1樣品的ELISA檢測結(jié)果

肛拭子、血清樣品及其病毒分離培養(yǎng)物上清的檢測結(jié)果顯示，肛拭子樣品ALV-p27抗原陽性率為39.13%(36/92)；細(xì)胞培養(yǎng)物ALV-p27抗原陽性率12.97%(24/185)；血清樣品ALV-J抗體陽性率為22.39%(15/67)；血清樣品ALV-A/B抗體陽性率為7.46%(5/67)。

肛拭子樣品檢測ALV-p27抗原陽性率高達(dá)近40%，顯著高于課題組歷年對廣西地區(qū)其他品種雞進(jìn)行的流調(diào)平均水平；ALV-J抗體陽性率也顯著高于其他品種的平均水平；ALV-A/B抗體陽性率為7.46%，則低于其他品種的平均水平。

2.2病毒分離株P(guān)CR鑒定及env基因的擴(kuò)增結(jié)果

通過ALV-A、ALV-B、ALV-J的3對亞型的特異性分型引物對分離株進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果表明，用ALV-A引物從2個分離株樣品中擴(kuò)增到特異性片段(圖1)，而用ALV-B、ALV-J的分型引物的擴(kuò)增則沒有特異性片段，說明分離到的病毒屬于ALV-A。用ALV-A的env F、env R引物擴(kuò)增其env基因，擴(kuò)增到的目的條帶約為2 200bp(圖2)。2個分離株分別命名為DJ-3-18株和DJ-45株。

1. DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000；2. 陰性對照；3~4. A亞型的擴(kuò)增；5~6. B亞型的擴(kuò)增；7~8. J亞型的擴(kuò)增

1. DNA Marker DL 2000；2. Negative control；3-4. Subgroup A；5-6. Subgroup B；7-8. Subgroup J

圖1分離株ALV分型的PCR鑒定結(jié)果

Fig.1PCR identification results of subgroup ALV of the isolates

1.Super DNA Maker；2-3.ALV-A env

圖2分離株ALV-A env基因的PCR擴(kuò)增

Fig.2PCR amplification on ALV-A env gene of the isolates

2.3分離株序列的分析結(jié)果

經(jīng)DNA Star軟件分析，分離株DJ-3-18和DJ-45的gp85基因開放閱讀框大小均為1 029 bp，編碼343個氨基酸殘基。與雞的不同亞群ALV參考株同源性比較表明，2個分離株的氨基酸序列與ALV-A參考株的氨基酸序列同源性最高(88.2%～96.5%)，而與B、C、D、E、J亞群的同源性僅為36.2%～83.8%(圖3)。同時，2個分離株gp85基因的氨基酸序列繪制的進(jìn)化樹分析表明，兩分離株均與ALV-A亞型毒株同屬一個分支(圖4)。兩分離株的gp85基因氨基酸與其他代表性參考株相比存在突變，兩分離株共同擁有突變共5個，分別為D57G、R190K、V249M、T284 A和G339 D。此外，DJ-45株還出現(xiàn)S33A的突變。兩分離株與臺灣TW-3577株gp85基因氨基酸序列相近，有著較近的親緣關(guān)系。gp37基因則相對比較保守，各ALV-A毒株gp37基因氨基酸同源性為91.4%～98.0%，未發(fā)現(xiàn)有缺失或插入突變。

圖3　分離株與ALV各亞型病毒參考株間gp85基因氨基酸同源性比較

圖4　分離株與ALV各個亞型病毒參考株gp85基因的氨基酸序列進(jìn)化樹

3討論

廣西是我國養(yǎng)禽產(chǎn)業(yè)較為發(fā)達(dá)的地區(qū)，且優(yōu)質(zhì)地方品種雞較多。在作者所在課題組的指導(dǎo)與帶領(lǐng)下，從2008年開始對該地區(qū)的幾個主要大型種雞企業(yè)開展了禽白血病和白痢(簡稱“兩白”)的凈化工作，成效顯著[6]。此外本課題組對廣西主要的地方品種雞開展禽白血病病毒流行病學(xué)調(diào)查，掌握了本地區(qū)主要地方品種禽類禽白血病病毒流行情況。本研究對位于廣西與越南接壤的城市-憑祥市近年來剛剛興起的斗雞產(chǎn)業(yè)開展禽白血病流行病學(xué)調(diào)查，為豐富與完善廣西各種禽類禽白血病流行病學(xué)資料以及下一步禽白血病的凈化與防控奠定了基礎(chǔ)。

調(diào)查的結(jié)果顯示，斗雞感染禽白血病病毒情況比較嚴(yán)重。肛拭子樣品ALV-p27抗原陽性率、ALV-J抗體陽性率都高于廣西其他禽類的平均水平。表明該地區(qū)斗雞產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展迫切需要對其種群進(jìn)行白血病(包括白痢)的凈化。廣西憑祥市斗雞飼養(yǎng)量較多，在全國也較為有名，許多外省客戶慕名來購買。該地區(qū)目前母雞多為自繁自養(yǎng)，而種公雞則從越南引進(jìn)，但均未對種雞進(jìn)行過禽白血病的檢測，更談不上凈化了。因此，凈化工作除了對本地區(qū)的斗雞產(chǎn)業(yè)發(fā)展有必要之外，還有利于防控白血病隨銷售的斗雞傳播到其他地區(qū)。課題組下一步的工作之一就是指導(dǎo)斗雞種雞場開展凈化工作，有效降低白血病的陽性率。

對分離到2株ALV-A毒株env基因序列分析的結(jié)果顯示，兩毒株與臺灣蛋雞分離株TW-3577親緣關(guān)系最近，表明它們可能由同一個毒株衍化而來。對gp85基因核苷酸分析并與其他代表株比較，兩毒株存在點(diǎn)突變，兩分離株共同點(diǎn)突變有9個，其中沉默突變4個，有意義突變5個。此外毒株DJ-45 gp85基因還有一個額外的突變(S33 A)。分離株的不同位置出現(xiàn)的突變，對其生物學(xué)特性的影響有待于進(jìn)一步研究。

目前對我國雞群禽白血病報道主要集中于J亞群ALV，對其他亞群報道的相關(guān)文章相對較少，對當(dāng)前其他亞群ALV在雞群中流行作用也還不甚清楚。我們從廣西憑祥市斗雞中分離到兩株A亞群病毒，表明我國雞群ALV感染存在復(fù)雜性。國內(nèi)有相關(guān)文章報道J亞群ALV主要是引進(jìn)未經(jīng)檢疫種雞時帶入的[12]。本研究A亞群ALV雖是從廣西憑祥市斗雞中分離到的，但本地斗雞的種雞特別是種公雞又多從外地引種。因此，我們分離到的A亞群ALV是否是通過這個渠道傳入？還是是從本地雞群傳染的？這個問題的回答有助于今后對白血病的預(yù)防和控制。

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Detection of Avian Leukosis Virus in Game Fowl of Pingxiang,Guangxi and env Gene Analysis of Isolates

HE Cheng-wei1,2, WANG Pei-kun2, QIN Li-li2, BI Yu-yu2, ZOU Guang-zhen2,YANG Yong-li2, PENG Hao2, WEI Ping2

(1.Entry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Pingxiang,Guangxi,532600,China;2.InstituteofPoultryScienceandHealth,GuangxiUniversity,Nanning,Guangxi, 530004,China)

Abstract:In order to investigate the infection status of avian leukosis virus (ALV) of the game fowl in Pingxiang, Guangxi，totally 344 samples of cloaca swabs and sera were collected from three representing flocks and detected by the commercial ELISA detection kits. The results showed that the ALV infection in the game fowl was very serious with the ALV-p27 positive rate 39.13% in cloaca swabs and seral positive rate 12.97%, the positive rates of ALV-J and ALV-A/B antibodies were 22.39% and 7.46%, respectively. Two isolates DJ-3-18 and DJ-45 were recovered by culturing in DF-1 cells from two of the p27 positive birds and the env genes were amplified, sequenced and analyzed. The sequence comparison of gp85 and gp37 genes indicated that 88.2%-96.5% and 91.4%-98.0% homologies were found between the isolates and the reference strains of ALV-A subgroup, and with the highest homology with an ALV-A layer original isolate TW-3577. It is the first report of ALV-A subgroup isolated from game fowl.

Key words:game fowl；Avian leukosis；epidemiological investigation；env gene; ALV-A subgroup

文章編號:1007-5038(2016)02-0023-04

中圖分類號:S852.659.3;S858.31

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

作者簡介：何成偉(1969-)，男，廣西容縣人，高級獸醫(yī)師，碩士，主要從事進(jìn)出境動物檢驗(yàn)檢疫工作。 *通訊作者

基金項(xiàng)目：國家公益性(農(nóng)業(yè))行業(yè)科研專項(xiàng)(201203055)；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系廣西肉雞產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(nycytxgxcxtd-04-20-2)

收稿日期：2015-06-27