芮　萍，馬增軍*，郭　剛，項(xiàng)　方，劉曜綜

(1.河北科技師范學(xué)院河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河北秦皇島 066600；2. 昌黎縣畜牧發(fā)展局,河北昌黎 066000)

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貉源犬巴氏桿菌的分離與鑒定

芮萍1，馬增軍1*，郭剛2，項(xiàng)方2，劉曜綜1

(1.河北科技師范學(xué)院河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河北秦皇島 066600；2. 昌黎縣畜牧發(fā)展局,河北昌黎 066000)

摘要:為查明7日齡～10日齡仔貉急性死亡的主要病因，無(wú)菌采集仔貉的肺臟、脾臟、肝臟及腎臟組織，進(jìn)行病原的分離培養(yǎng)，對(duì)分離菌株進(jìn)行形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生化特性觀察，初步表明分離菌株為犬巴氏桿菌。擇優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行了16 S rRNA基因的 PCR 檢測(cè)，基因序列分析表明，所檢菌株16 S rRNA基因序列與犬巴氏桿菌的同源性在97.8%～100%，在進(jìn)化樹位于一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的分支。人工感染試驗(yàn)證實(shí)分離菌株對(duì)小鼠有強(qiáng)致病性。藥敏試驗(yàn)顯示分離菌株對(duì)青霉素類、頭孢菌素類、氟喹諾酮類敏感，對(duì)鏈霉素、四環(huán)素、土霉素、磺胺嘧啶鈉耐藥。

關(guān)鍵詞:貉；犬巴氏桿菌；分離；生物學(xué)特性；16 S rRNA

巴氏桿菌屬的細(xì)菌是一種小的革蘭陰性桿菌或球桿菌，大量定居在哺乳動(dòng)物和鳥類上呼吸道和消化道黏膜表面，并產(chǎn)生致病作用。許多種屬細(xì)菌作為原發(fā)性或條件性致病菌，可引起養(yǎng)殖業(yè)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。如多殺性巴氏桿菌是畜禽出血性敗血癥和傳染性肺炎的主要病原菌，溶血性巴氏桿菌可致牛、羊、豬的肺炎、乳房炎和敗血癥。犬巴氏桿菌存在于狗、貓等動(dòng)物的口腔中，可以通過(guò)咬人后感染人的傷口，引起腹膜炎、眼結(jié)膜炎、骨關(guān)節(jié)炎[1-3]等。也有報(bào)道犬巴氏桿菌可以引起幼駒的多發(fā)性關(guān)節(jié)炎[4]。犬巴斯德菌生物型1型引起新生幼犬的全身性感染[5]。關(guān)于犬巴氏桿菌引起家養(yǎng)貉發(fā)生全身敗血癥的病例未見報(bào)道，昌黎某養(yǎng)貉場(chǎng)發(fā)生仔貉以發(fā)病急，死亡快為主要特征的疾病，在飼養(yǎng)的25窩仔貉，其中9窩仔貉10日齡內(nèi)全部急性死亡，剖檢呈全身敗血癥變化，經(jīng)病原鑒定，以及16 S rRNA基因序列分析，確診為犬巴氏桿菌引起疾病，為該病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病料來(lái)源2014年秦皇島昌黎某貉場(chǎng)的新生仔貉，臨診上表現(xiàn)為7日齡～10日齡的仔貉發(fā)病急、死亡快，病死率達(dá)到100%，肺表面有大量出血點(diǎn)，肝臟淤血腫大，表面有灰白色壞死灶；腎腫大呈灰黃色，表面有密集出血點(diǎn)；腸系膜淋巴結(jié)出血腫大，切面多汁。無(wú)菌采集肺臟、肝臟、腎臟、脾臟進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

1.1.2主要試劑ID32E腸道菌鑒定試條(產(chǎn)品編號(hào)：32400)為法國(guó)梅里埃公司產(chǎn)品;DNA Marker DL 2000 、2×EsTaqMasterMix為北京賽百盛基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)所用小鼠為Balb/c小鼠，約25 g，由河北科技師范學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2方法

1.2.1病原分離純化及生化特性鑒定無(wú)菌采取病死仔貉肝、肺、脾、腎等器官組織，劃線接種于鮮血瓊脂平板、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h~24 h，選取圓形、透明、露珠樣優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)菌落移接于改良馬丁肉湯進(jìn)行純培養(yǎng)供鑒定用。挑取上述純培養(yǎng)菌落抹片，分別進(jìn)行革蘭染色和美藍(lán)染色，鏡檢。分離菌經(jīng)鮮血瓊脂純培養(yǎng)24 h后，分別用ID32E腸道菌鑒定試劑條進(jìn)行糖發(fā)酵及其他生化試驗(yàn)，具體方法依據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.2致病性試驗(yàn)將分離菌株接種改良馬丁肉湯，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，用生理鹽水稀釋菌數(shù)約為109CFU/mL，腹腔注射4只小鼠，0.2 mL/只；同時(shí)設(shè)生理鹽水陰性對(duì)照。接種后觀察發(fā)病及死亡情況，對(duì)死亡小鼠進(jìn)行剖檢，觀察組織病變，同時(shí)采集肝、脾、肺進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。

1.2.3藥敏試驗(yàn)按照美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法進(jìn)行試驗(yàn)操作和結(jié)果判斷[7]。

1.2.416 S rRNA基因序列測(cè)定16 S rRNA基因序列PCR擴(kuò)增的2個(gè)通用引物27F和 1492R由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以小量細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取的細(xì)菌基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系(25 μL)：2×EsTaqMasterMix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，ddH2O 8.5 μL，DNA模板2.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 1 min ，45 ℃ 2 min，72 ℃ min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸6 min。取出3 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后送上海生工進(jìn)行序列測(cè)定，利用DNA Star 軟件對(duì)16 S rRNA基因進(jìn)行序列分析，同時(shí)使用MegAlign軟件與從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的序列相似性較高的菌株序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2結(jié)果

2.1分離培養(yǎng)和鏡檢結(jié)果

無(wú)菌取肝臟、肺臟、腎臟、脾臟組織，經(jīng)鮮血瓊脂平板培養(yǎng)生長(zhǎng)良好，呈均一的露珠大小、表面光滑、邊緣整齊、淡灰白色、不溶血的菌落；在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)貧瘠，形成針尖大小、淡灰白色菌落；在麥康凱培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)。革蘭染色鏡檢為革蘭氏陰性短小桿菌，美藍(lán)染色見兩極濃染球桿菌。

2.2生化試驗(yàn)結(jié)果

4株分離菌觸酶和氧化酶試驗(yàn)為陽(yáng)性，經(jīng)NEW ATB微生物鑒定分析系統(tǒng)檢測(cè)，鑒定結(jié)果見表1。

表1　分離菌的生化特性

注：“+”為陽(yáng)性，“-”為陰性。

Note："+" positive，"-"negative.

2.3致病性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)組小白鼠24 h內(nèi)全部發(fā)病死亡。剖檢死亡小白鼠可見皮下有不同程度的瘀血、出血；肝、肺、腎有出血點(diǎn)和出血斑，脾腫大淤血。無(wú)菌采集死亡小鼠病變臟器接種于鮮血瓊脂平板，培養(yǎng)24 h后分離獲得純的病原細(xì)菌。挑取單個(gè)菌落革蘭染色后鏡檢，可見與接種菌一致的病原細(xì)菌。對(duì)照組小白鼠健康存活，剖檢各臟器無(wú)異?，F(xiàn)象。試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)分離菌株對(duì)小鼠有致病性。

2.4藥敏試驗(yàn)結(jié)果

分離菌株對(duì)青霉素、阿莫西林、頭孢拉定、頭孢噻呋、頭孢氨芐、阿米卡星、氧氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、磺胺嘧啶鈉敏感，對(duì)鏈霉素、四環(huán)素、土霉素耐藥。

2.516 S rRNA基因序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)

將分離的病原菌(編號(hào):p0140501)進(jìn)行16 S rRNA基因序列測(cè)定，所擴(kuò)增的基因序列長(zhǎng)度為1 441 bp(圖1)，獲得的基因序列提交GenBank(登錄號(hào): KM079615)。將分離菌株的16 S rRNA基因序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST搜索比對(duì)，擇取部分菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。進(jìn)化樹整體上分為四大分支，分離菌株與犬巴氏桿菌親緣關(guān)系較近聚為一支。經(jīng)同源性分析(圖3)，分離菌株的16 S rRNA基因與犬巴氏桿菌同源性分別在98.9%～100%。與口腔巴氏桿菌的同源性在97.1%，與肺炎巴氏桿菌的同源性為97.9%，與多殺巴氏桿菌的的同源性在97.8%~97.9%。

M. DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1~4. 分離自肝、脾、肺、腎菌株的PCR產(chǎn)物

M. DNA Maker DL 2 000；1-4. PCR products of positive strains from liver,spleen,lung and kidney

圖1分離菌16 S rRNA基因的PCR擴(kuò)增

Fig.1PCR results of 16 S rRNA gene fromS.suis

3討論

昌黎某養(yǎng)貉場(chǎng)發(fā)生仔貉以發(fā)病急，死亡快為主要特征的疾病，剖檢呈全身敗血癥變化，從病變組織中分離獲得4株細(xì)菌。從形態(tài)特征、培養(yǎng)特性分析，初步證明分離菌株為巴氏桿菌。采用16 S rRNA基因序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，進(jìn)一步證實(shí)其為犬巴氏桿菌，且分離菌株能產(chǎn)生靛基質(zhì)，屬于生物1型。通過(guò)人工感染試驗(yàn)，證明分離菌株具有一定致病性。為該病的預(yù)防、控制和臨床治療提供指導(dǎo)。

圖2　16 S rRNA基因進(jìn)化分析

圖3　16 S rRNA基因的核苷酸序列同源性比較

對(duì)供試4株菌的理化性狀鑒定結(jié)果顯示，有個(gè)別生化特性的結(jié)果與《Bergey's Manual of Systematic Bacteriology》第2版(2009)[6]中不一致，如葡萄糖、蔗糖；但通過(guò)16 S rRNA基因序列測(cè)定的發(fā)育學(xué)分析，與犬巴氏桿菌具有98.9%～100%的同源性。因此認(rèn)為，在對(duì)犬巴氏桿菌進(jìn)行鑒定時(shí)，除了形態(tài)特征、理化特性等表觀分類學(xué)的傳統(tǒng)分類鑒定外，最好結(jié)合16 S rRNA等分子分類鑒定，以準(zhǔn)確進(jìn)行菌種的判定。

犬巴氏桿菌包括2個(gè)生物型，犬巴斯德菌生物型1型存在于狗、貓等動(dòng)物的口腔中，可以通過(guò)咬人后感染人的傷口，引起腹膜炎、眼結(jié)膜炎、骨關(guān)節(jié)炎等，因此常在狗咬人的感染人傷口中分離到此菌。生物2型菌株多分離于肺炎牛的病變肺。本文首次從全身敗血癥感染仔貉組織中分離到犬巴氏桿菌生物型1型菌株，與文獻(xiàn)[5]報(bào)道犬巴氏桿菌生物型1型引起新生幼犬的全身性感染相一致。近年來(lái)，隨著毛皮動(dòng)物飼養(yǎng)規(guī)模不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖環(huán)境污染嚴(yán)重，圈舍擁擠通風(fēng)不良的、冷熱交替、氣候驟變等誘因，均可使仔貉抵抗力降低，給致病菌的入侵提供了機(jī)會(huì)。因此，本文將為有效診斷和防治毛皮動(dòng)物疾病提供指導(dǎo)意義。

藥敏測(cè)定結(jié)果顯示，分離菌株對(duì)青霉素、阿莫西林、頭孢拉定、頭孢噻呋、頭孢氨芐、阿米卡星、氧氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、磺胺嘧啶鈉敏感，對(duì)鏈霉素、四環(huán)素、土霉素耐藥。該結(jié)果有益于選擇用藥防治由犬巴氏桿菌引起的感染癥?？紤]到細(xì)菌耐藥變遷，條件許可最好對(duì)分離菌株進(jìn)行藥敏測(cè)定后選擇敏感藥物為宜。

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Isolation and Identification ofPasteurellacanisfrom Raccoon Dogs

RUI Ping1, MA Zeng-jun1,GUO Gang2, XIANG Fang2, LIU Yao-zong1

(1.KeyLaboratoryofPerventiveVeterinaryMedicineofHebei,HebeiNormalUniversityofScicineandTechnology,Qinhuangdao,Hebei, 066000,China；2.ChangliAnimalHusbandryBureaue,Changli,Hebei, 066600,China)

Abstract:Four pathogenic strains were isolated from lungs, spleen, liver and kidney of the infected 7-10 days old aberdeen raccoon by routine bacterial isolation, identification technologies. The pathogen was identified as Pasteurella multocida based on its morphology, culture characteristics, biochemical characteristics and 16S rRNA gene PCR results. Sequence alignments indicated that 16 S rRNA gene from the isolates shared 97.8%-100% identity with Pasteurella canis in GenBank and located in a relatively independent branch. Artificial infection experiment confirmed that the isolates were pathogenic. The result of drugs sensitivity test showed that the isolates were highly sensetive to penicillin, cephalosporins and fluoroquinolones, resistant to streptomycin, tetracycline, oxytetracycline and sulfadiazine sodium. This represents the first report of systemic pasteurellosis caused by P. canis in raccoon dogs.

Key words:raccoon dog; Pasteurella canis; isolation; physiological characteristic; 16 S rRNA

文章編號(hào):1007-5038(2016)02-0125-04

中圖分類號(hào):S852.612

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B

作者簡(jiǎn)介：芮萍(1969-)，女，河北張北人，教授，博士，主要從事獸醫(yī)病原微生物學(xué)及藥理學(xué)研究。*通訊作者

基金項(xiàng)目：河北省科技支撐項(xiàng)目(13226609D)；河北省畜牧局計(jì)劃項(xiàng)目(2011-1-19)

收稿日期：2015-06-12