馮萬(wàn)宇，徐　馨，張　艷，黃　健

(黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江齊齊哈爾 161006)

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乳頭藥浴涂膜劑對(duì)奶牛乳房炎致病菌體外抑菌效果評(píng)價(jià)

馮萬(wàn)宇，徐馨，張艷，黃健

(黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江齊齊哈爾 161006)

摘要:為探討以聚維酮碘為主要成分的奶牛乳頭藥浴涂膜劑對(duì)奶牛乳房炎致病菌的體外抑菌效果，為臨床試驗(yàn)提供科學(xué)依據(jù),以純水浸泡、加熱制成PVA膠漿液為成膜基質(zhì)，將經(jīng)純水預(yù)處理的PVP-I加入其中，隨后加入一定比例甘油作為增塑劑，充分融合后制成奶牛乳頭藥浴涂膜劑；采用10倍稀釋法進(jìn)行乳頭藥浴涂膜劑對(duì)奶牛乳房炎臨床分離的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌及停乳鏈球菌4種主要致病菌的最小抑菌殺菌濃度試驗(yàn)，試驗(yàn)同時(shí)設(shè)青霉素和頭孢噻呋的抗生素對(duì)照。結(jié)果表明，乳頭藥浴涂膜劑4種致病菌有良好的體外抑菌和殺菌作用，其抑殺菌濃度低于頭孢噻呋和青霉素。乳頭藥浴涂膜劑對(duì)奶牛乳房炎致病菌有較好的抑菌效果，可以用其作為奶牛乳頭藥浴藥物替代臨床常用抗生素預(yù)防。

關(guān)鍵詞:奶牛乳房炎；致病菌；乳頭藥浴涂膜劑；體外抑菌殺菌試驗(yàn)

奶牛乳房炎是降低奶牛泌乳量、損害乳質(zhì)，危害奶牛養(yǎng)殖、制約奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素之一，它不僅會(huì)影響奶牛泌乳量，誘發(fā)其他疾病，造成消費(fèi)性飼養(yǎng)，而且重度乳房炎還會(huì)造成奶牛喪失泌乳能力，從而使部分奶牛的被迫淘汰。除了疾病引起的經(jīng)濟(jì)損失，也給人類(lèi)健康及公共衛(wèi)生造成巨大危害[1-2]。

病原微生物是引起奶牛乳房炎的主要原因，迄今為止相關(guān)病原報(bào)道已達(dá)150多種以上，病原菌通過(guò)乳頭管口侵入是引起乳房炎的主要因素。隨著季節(jié)、品種、區(qū)域等不同情況分離到的致病菌種類(lèi)差異也很大，主要分離到的包括大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房炎鏈球菌等[3-4]。諸多的專(zhuān)家學(xué)者為研究和探索防治乳房炎做了大量卓有成效的工作，研制出許多治療藥物和防治措施，但主要還是全身及乳房局部的抗感染治療[4-6]。全身用藥不但大量消耗藥物導(dǎo)致費(fèi)用較高，而且在乳房局部難以達(dá)到和維持徹底殺菌的有效藥物濃度，而且極易引起牛體及乳制品藥物殘留和超標(biāo)[7]。干奶期乳頭管注射長(zhǎng)效抗生素和泌乳期擠奶前后乳房消毒是目前比較被廣大奶牛場(chǎng)采納和接受的最普遍的方法，由于抗生素7的大量臨床應(yīng)用產(chǎn)生的細(xì)菌耐藥性，使治療效果不盡人意，抗生素殘留造成的廢棄奶也是抗生素治療的不利結(jié)果[8-9]。利用洗必泰、高錳酸鉀、新潔爾滅、碘及聚維酮碘進(jìn)行奶牛乳頭藥浴是目前預(yù)防奶牛乳房炎比較常用的方法。

聚維酮碘為近些年臨床比較常用的消毒防腐劑，具有抗菌譜廣、不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)臨床常見(jiàn)細(xì)菌均有殺滅作用，病毒、真菌、衣原體、結(jié)核桿菌等也對(duì)其十分敏感，臨床上已有多種劑型的聚維酮碘產(chǎn)品用于皮膚黏膜的殺菌消毒，效果明顯，以聚維酮碘為主要作用成分的乳頭藥浴涂膜劑用于治療和預(yù)防奶牛乳房炎尚未見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)考察以聚維酮碘為主藥的乳頭藥浴涂膜劑對(duì)奶牛乳房炎4種致病菌的體外抑菌效果，測(cè)定其最小抑菌濃度和殺菌濃度，為其臨床用藥提供技術(shù)依據(jù)，這對(duì)于防治奶牛乳房炎獸藥新劑型研究及提高治療療效，提升奶牛保健水平，推動(dòng)奶牛養(yǎng)殖健康發(fā)展具有重要意義[10-11]。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)菌株大腸埃希菌20100528、金黃色葡萄球菌20091031、無(wú)乳鏈球菌20110708及停乳鏈球菌20070331四種菌株由黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所牛病研究室自齊齊哈爾及其周邊市縣采集經(jīng)生化鑒定后予以編號(hào)。

1.1.2試驗(yàn)藥品5%聚維酮碘，購(gòu)自齊齊哈爾醫(yī)藥商廈；鹽酸頭孢噻呋及青霉素購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所，乳頭藥浴涂膜劑由黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所提供，批號(hào)：201104。

1.1.3主要儀器及培養(yǎng)基泰勒斯超凈臺(tái)；泰斯特DH-4000恒溫培養(yǎng)箱；YX280A手提式高壓蒸汽滅菌器；ZW-A微量振蕩器、肉湯及普通瓊脂培養(yǎng)基為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌培養(yǎng)將冰柜凍存的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、停乳鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌等4種菌種取出，分別接種至相應(yīng)培養(yǎng)基中，置于恒溫箱37 ℃培養(yǎng)24 h~48 h。取出培養(yǎng)物，選取典型菌落轉(zhuǎn)種3代備用。

1.2.2藥液制備將頭孢噻呋、青霉素標(biāo)準(zhǔn)品用相應(yīng)磷酸鹽緩沖液稀釋成濃度為100 mg/mL，乳頭藥浴涂膜劑(黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所牛病研究室自制，有效碘含量為1.5 g/L)，生理鹽水稀釋為0.80 mg/mL溶液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 奶牛乳房炎病原菌CFU測(cè)定

1.2.3.1病原菌擴(kuò)增用接種環(huán)挑取每一復(fù)蘇菌種單個(gè)菌落接種到10 mL滅菌肉湯培養(yǎng)基中37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h備用。

1.2.3.2病原菌CFU測(cè)定取經(jīng)121 ℃ 30 min處理的EP管9只，每個(gè)管中加入普通肉湯 900 μL，在第一個(gè)EP管中加入100 μL 1.2.3.1中擴(kuò)增的菌液，混合均勻后取100 μL加到第2管中，如此依次10倍稀釋至第9管。取105~109等5個(gè)稀釋度菌液各100 μL以混碟法方式分別接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板中，倒置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h~24 h后計(jì)數(shù)，選取菌落數(shù)在30個(gè)~300個(gè)的稀釋度計(jì)算CFU。

1.2.4奶牛乳房炎致病菌藥物敏感性測(cè)定將純化的細(xì)菌接種肉湯，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后依據(jù)測(cè)定的CFU將菌液稀釋至106CFU/mL。在96孔微量平板1孔~12孔各加無(wú)菌肉湯100 μL，向第1孔中加100 μL藥物原液(256 μL/mL)，2倍稀釋至第10孔，第10孔稀釋好后吸100 μL棄之，11孔為不加菌液、12孔為不加藥物對(duì)照。除11孔外，其他各孔分別加入106CFU/mL菌液10 μL，微量振蕩器2 min后37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h~48 h。每種藥物做4個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)24 h記錄最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，培養(yǎng)48 h記錄最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)。

2結(jié)果

2.1奶牛乳房炎致病菌培養(yǎng)基計(jì)數(shù)結(jié)果

奶牛乳房炎致病菌培養(yǎng)基計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1，每毫升樣品細(xì)菌數(shù)見(jiàn)表2。

表1　奶牛乳房炎致病菌培養(yǎng)基計(jì)數(shù)

表2　奶牛乳房炎4種致病菌每毫升樣品中細(xì)菌數(shù)量

由表1、表2中可以看出，4種臨床分離株在肉湯培養(yǎng)基中進(jìn)行體外培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)速度比較相近，其中大腸埃希菌CFU為3.21×107/mL、金黃色葡萄球菌CFU為3.49×107/mL、無(wú)乳鏈球菌為CFU為3.38×107/mL、停乳鏈球菌CFU為3.07×107/mL，差異不顯著(P>0.05)。

2.2乳頭藥浴涂膜劑與抗生素對(duì)奶牛乳房炎病原菌體外抑菌效果比較

頭孢噻呋、青霉素和乳頭藥浴涂膜劑對(duì)奶牛乳房炎4種病原菌大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌和停乳鏈球菌的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可以看出，乳頭藥浴涂膜劑對(duì)臨床分離的4種奶牛乳房炎致病菌最小抑菌濃度(MIC)比頭孢噻呋、青霉素低8倍~250倍，最小殺菌濃度(MBC)比頭孢噻呋、青霉素低16倍~250倍以上。由此可見(jiàn)，分離到的大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌對(duì)青霉素產(chǎn)生耐藥，雖然無(wú)乳鏈球菌和停乳鏈球菌尚未對(duì)青霉素產(chǎn)生耐藥性，但其抑菌和殺菌濃度也比以前報(bào)道的大有增加，提示在應(yīng)用青霉素治療奶牛無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌乳房炎時(shí)，應(yīng)當(dāng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選用高敏藥物和適當(dāng)劑量，不能完全依照臨床獸醫(yī)人員經(jīng)驗(yàn)性的推薦劑量或所謂最高劑量，從而減少耐藥菌株產(chǎn)生和治療失敗。頭孢噻呋對(duì)臨床分離的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌和停乳鏈球菌菌株的最小抑菌濃度(MIC)最高值為5.20、最小殺菌濃度最高值為10.50，其抑殺菌效果也比較理想，可用于奶牛乳房炎的治療，但其抑殺菌效果低于乳頭藥浴涂膜劑。以上結(jié)果表明乳頭藥浴涂膜劑對(duì)奶牛乳房炎病原菌大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌和停乳鏈球菌菌株殺菌作用強(qiáng)，且不會(huì)導(dǎo)致菌株產(chǎn)生耐藥性。

表3　乳頭藥浴涂膜劑、頭孢噻呋及青霉素對(duì)奶牛乳房炎主要致病菌的抑菌效果比較

3討論

3.1擠奶前后利用乳頭藥浴涂膜劑藥浴防治奶牛乳房炎的優(yōu)點(diǎn)

聚維酮碘目前人類(lèi)醫(yī)學(xué)和動(dòng)物醫(yī)學(xué)臨床較為常用的一種消毒殺菌劑，具有廣譜抗菌、強(qiáng)力殺菌、無(wú)耐藥性和毒性低等特點(diǎn)，對(duì)細(xì)菌、真菌、原蟲(chóng)和病毒均有很好的殺滅作用。其機(jī)理是通過(guò)與病原微生物細(xì)胞接觸，緩慢釋放出的碘分子，破壞細(xì)胞膜及蛋白質(zhì)而起殺滅作用。除用于用于皮膚黏膜消毒以外，在臨床上也用于防治多種疾病[5]。乳頭藥浴涂膜劑是以聚維酮碘為主要成分的一種新型可用于奶牛擠奶前后乳頭藥浴的高效廣譜殺菌劑，它通過(guò)逐步釋放出原子碘鹵化菌體蛋白質(zhì)，使其變性而導(dǎo)致病菌死亡。由于使用方便，性狀穩(wěn)定，其對(duì)奶牛乳房皮膚無(wú)刺激和損傷，不產(chǎn)生二次污染，適用于擠奶間歇期奶牛乳頭藥浴。

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，對(duì)奶牛乳房炎4種致病菌的體外抑菌效果為乳頭藥浴涂膜劑>頭孢噻呋>青霉素，可見(jiàn)其對(duì)奶牛乳房炎致病菌抑殺效果高于敏感抗生素十分理想，不易引發(fā)細(xì)菌耐藥性，不產(chǎn)生抗生素奶導(dǎo)致的額外休乳期和休藥期。根據(jù)資料報(bào)道，涂膜劑既能夠避免藥物通過(guò)腸胃的首過(guò)效應(yīng)，也能夠減輕藥物毒副作用和不良反應(yīng)。根據(jù)不同藥物要求，利用不同性質(zhì)和規(guī)格的成膜材料可以制備出不同特性的涂膜劑[6]。應(yīng)用涂膜劑可以減少皮膚表面水分蒸發(fā)，使皮膚角質(zhì)層水化，增加皮膚滲透性，從而有利于促進(jìn)藥物透過(guò)角質(zhì)吸收發(fā)揮更好的治療作用。同時(shí)，涂膜劑也隔斷了外部細(xì)菌在皮膚表面滋生的機(jī)會(huì)。以聚維酮碘為主藥的乳頭藥浴涂膜劑制法簡(jiǎn)單，使用后奶牛無(wú)不適感。

3.2抗生素防治奶牛乳房炎的優(yōu)劣

利用抗生素防治奶牛乳房炎是幾十年以來(lái)國(guó)內(nèi)外普遍采用的方法，在奶牛乳房控制工作中有不可替代的作用[12-13]，可以說(shuō)，沒(méi)有抗生素的大量臨床應(yīng)用，就沒(méi)有各國(guó)畜牧業(yè)蓬勃發(fā)展的今天。近些年，尤其是進(jìn)入新世紀(jì)以來(lái)，對(duì)乳及乳制品安全性要求越來(lái)越高，無(wú)抗、綠色、安全已漸入人心，運(yùn)用抗生素治療奶牛乳房炎有諸多缺點(diǎn)：①抗生素長(zhǎng)期使用使病原微生物的抗藥性增加，耐藥菌株使抗生素失去作用；②乳中殘留抗生素產(chǎn)生廢棄奶處理不當(dāng)，能污染環(huán)境和危害人及動(dòng)物身體健康[14-15]；③大量、不當(dāng)和長(zhǎng)期應(yīng)用抗生素治療乳房炎還可能導(dǎo)致畸形后代，使優(yōu)良基因無(wú)法遺傳到下一代；④抗生素不當(dāng)使用會(huì)影響奶牛胃腸道消長(zhǎng)，破壞了奶牛體內(nèi)微生態(tài)平衡，通過(guò)增大使用劑量或是更換抗生素品種的做法也容易造成藥品的浪費(fèi)，增加飼養(yǎng)管理成本；⑤乳房炎治療過(guò)程中有一定數(shù)量的抗生素通過(guò)血液進(jìn)入乳汁，導(dǎo)致乳汁抗生素的殘留超標(biāo)，藥物殘留超標(biāo)奶被廢棄，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[16]。

本研究考察了以聚維酮碘凝膠為主藥的乳頭藥浴涂膜劑對(duì)奶牛乳房炎4種主要致病菌的體外抑菌效果，測(cè)定了其最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)，冀望對(duì)奶牛乳房炎防治及用藥提供技術(shù)依據(jù)。試驗(yàn)結(jié)果表明，乳頭藥浴涂膜劑對(duì)奶牛乳房炎4種致病菌體外抑菌效果好，其MIC和MBC均低與頭孢噻呋，更遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于青霉素，乳頭藥浴涂膜劑對(duì)子宮內(nèi)膜炎致病菌的體外抑菌效果明顯優(yōu)于頭孢噻呋和青霉素。此外，乳頭藥浴涂膜劑不易引發(fā)細(xì)菌耐藥性，與預(yù)期結(jié)果相符合。進(jìn)一步研究擠奶間期奶牛乳頭藥浴后對(duì)乳頭表面及乳頭管口乃至管內(nèi)微生物滅殺菌效果，是本研究的下一步所要解決的主要問(wèn)題之一。

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Evaluation of Bacteriostatic Effects of Teat Dipping Coating Agent on Pathogenic Bacteria Causing Cow MastitisinVitro

FENG Wan-yu，XU Xin，ZHANG Yan，HUANG Jian

(HeilongjiangAcademyofVeterinaryMedicine，Qiqihar,Heilongjiang，161006,China)

Abstract:In order to understand the bacteriostatic effects of the teat dipping coating agent on major pathogens causing cow mastitis and provide science evidence for clinical trial, the mucilage of PVA which was dipped and heated then affiliated the PVP-I which was primed in purified water and added in a certain ratio glycerol as plasticizer, after all of them, fully integrated into the teat dipping coating agent. Utilizing 10 times microdilution method，we determine in vitro effectiveness of the teat dipping coating agent on clinical isolates. In order to compare bacteriostatic effectiveness of the teat dipping coating agent and antibiotics，ceftiofur and penicillin were used as controls. The results showed that in vitro the agent had significant bacteriostatic effects on four major pathogens of cow mastitis, and the bactericidal and bacteriostatic concentrations were lower than that of ceftiofur and penicillin.

Key words:dairy cow mastitis; pathogen; teat dipping coating agent; bactericidal and bacteriostatic test in vitro

文章編號(hào):1007-5038(2016)02-0133-04

中圖分類(lèi)號(hào):S857.26

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B

作者簡(jiǎn)介：馮萬(wàn)宇(1976-),男,黑龍江木蘭人，副研究員,碩士,主要從事奶牛普通病防治新技術(shù)的研究。

收稿日期：2015-05-25