孫緒磊，冷義福，胡淑敏，張學(xué)奎，徐嘉君

（沈陽九州家圓醫(yī)院，遼寧 沈陽 110000）

卵母細(xì)胞和胚胎發(fā)育中的DNA雙鍵斷裂損傷

孫緒磊，冷義福，胡淑敏，張學(xué)奎，徐嘉君

（沈陽九州家圓醫(yī)院，遼寧 沈陽 110000）

在體細(xì)胞中，DNA雙鍵斷裂（DNA doubled-strand breaks，DSBs）是目前已知DNA損傷中最為嚴(yán)重的一種。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，DSBs能夠引起哺乳動物卵母細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致生殖能力下降。針對DSBs后機體進行的DNA損傷應(yīng)答通路的研究在生殖領(lǐng)域也成為熱點。但是卵子發(fā)生和后期胚胎發(fā)育過程中，參與DSBs損傷修復(fù)機制的基因，是怎樣突破染色體精確結(jié)構(gòu)，最終完成DNA修復(fù)，維持基因組穩(wěn)定或啟動細(xì)胞凋亡過程的，這一復(fù)雜調(diào)控機制尚不十分明確，亟需進一步研究。

DSBs；DNA損傷修復(fù)；卵母細(xì)胞；胚胎發(fā)育

在體細(xì)胞中，DSBs是目前已知DNA損傷中最為嚴(yán)重的一種。DNA鏈斷裂可以在正常的生理過程中發(fā)生，如DNA復(fù)制過程中的錯配或異常的拓?fù)洚悩?gòu)酶I和II活性；同時也可以由環(huán)境中的有害因素導(dǎo)致，如化學(xué)試劑，重金屬，紫外光以及電離輻射[1]。許多化學(xué)電離輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是阻斷DNA復(fù)制的結(jié)果，導(dǎo)致復(fù)制叉形成失敗和DSB的發(fā)生。DSBs如果不及時準(zhǔn)確的修復(fù)，可能會導(dǎo)致基因組大范圍的畸變，從而使得細(xì)胞周期阻滯或細(xì)胞凋亡。

為了應(yīng)對DSBs損傷，生命體進化DNA損傷應(yīng)答（DNA-damage response，DDR）機制，DNA損傷修復(fù)基因可修復(fù)由不同原因?qū)е碌腄NA損傷，防止錯誤遺傳信息的傳遞，保護遺傳信息的完整性?，F(xiàn)在已知有兩種機制參與DNA DSBs的修復(fù)。一種是同源重組（Homologous recombination，HR），也稱為同源末端鏈接（homologous end-joining，HEJ）；一種是非同源性末端鏈接（nonhomologous end-joining，NHEJ）[2]。NHEJ在有絲分裂G1/G0期中起主要作用，而HR在減數(shù)分裂，有絲分裂晚期S/G2期以及胚胎細(xì)胞修復(fù)中發(fā)揮重要作用。DSBs由包括信號（激酶）或修復(fù)活性的蛋白識別。其中最重要的成員是是共濟失調(diào)毛細(xì)血管擴張癥突變基因（ATM）和同源的ATR蛋白，兩者皆由DSBs激活[3]。一旦被激活，ATM通過Mre11-Nbs1-Rad50復(fù)合體被募集到DNA雙鏈斷裂處，ATM磷酸化并激活細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期停滯以及DNA修復(fù)等的多個下游效應(yīng)分子。ATM和ATR有三個重要功能：調(diào)節(jié)和刺激DSB修復(fù)，細(xì)胞周期信號調(diào)控以及通過p53調(diào)控細(xì)胞凋亡[4]。

以前對于DSBs損傷修復(fù)通路研究最多最廣泛的是癌癥醫(yī)學(xué)的靶向治療方面。最初的研究發(fā)現(xiàn)，患癌后經(jīng)過化療幸存的年輕女性，其卵巢儲備功能顯著下降，許多患者癌癥化療后生育能力顯著下降或喪失，提示化療藥物可能損傷卵巢功能和卵子質(zhì)量[5]。進一步人的卵巢組織體外培養(yǎng)和小鼠體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，化療藥物能夠?qū)θ撕蛧X類動物初級卵泡，卵母細(xì)胞以及顆粒細(xì)胞以劑量依賴的方式造成大量的DNA雙鍵斷裂損傷，而且這一損傷與卵母細(xì)胞凋亡以及ATM的激活有關(guān)[6]。不同的是，嚙齒類動物卵母細(xì)胞有通過基因毒性應(yīng)激修復(fù)DSBs的能力[7]。乳腺癌敏感基因1即BRCA1（breast cancer susceptibility gene1）是ATM介導(dǎo)的DSBs修復(fù)基因家族中的關(guān)鍵成員。BRCA基因的突變，是乳腺癌、卵巢癌和其他癌癥發(fā)生的高危因素。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，BRCA1突變的女性在控制性超數(shù)排卵時，往往伴隨卵巢低反應(yīng)的發(fā)生，并且有卵巢早衰現(xiàn)象[8-9]。這些發(fā)現(xiàn)說明，DNA DSBs的修復(fù)能力對于卵巢儲備和卵子凋亡都有十分密切的關(guān)系。

根據(jù)哺乳動物物種的不同，卵母細(xì)胞停滯在生發(fā)泡期（germinal vesicle，GV）長達幾個月甚至幾十年之久，直至它們恢復(fù)第一次減數(shù)分裂。這一長時間的靜止期，使得卵母細(xì)胞染色質(zhì)能夠遭受各種體內(nèi)外因素影響，從而導(dǎo)致DNA發(fā)生DSBs，影響卵母細(xì)胞發(fā)育潛能和雌性生殖力。雌性的生殖力隨著年齡的增加是逐步下降，直至喪失的。隨著年齡的增加，雌性哺乳動物的卵巢儲備功能而降低，卵母細(xì)胞損失的比率明顯增高。而所有的細(xì)胞，包括卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞，其DNA損傷都是隨著年齡的增加而加劇的。

γH2AX是研究DNA DSBs的標(biāo)志基因。DNA雙鍵斷裂后，組蛋白H2AX在DNA雙鍵斷裂處迅速磷酸化形成γH2AX焦點（γH2AX foci），它的表達量可以衡量DSBs發(fā)生的程度。有研究發(fā)現(xiàn)，老齡獼猴卵泡中顆粒細(xì)胞上γH2AX表達量相較于年輕獼猴顯著增加，但是BRCA1在卵子和顆粒細(xì)胞中的表達卻是降低的[10]。人和嚙齒類動物相應(yīng)的研究發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞中DNA DSBs隨著年齡的增長而增加，與此形成對應(yīng)的是一些DSBs修復(fù)基因（如BRCA1）在卵母細(xì)胞中表達降低[11]。這說明，卵母細(xì)胞中增加的DSBs與年齡引起的DNA損傷修復(fù)水平降低有關(guān)。但是在牛上的研究結(jié)果顯示，IVM過程中DNA修復(fù)基因RAD51，APEX-1和 MLH1的表達量升高，但是只有RAD51的表達在年輕和老齡的供體牛中有差異[12]。

IVM和IVP過程中，有些研究運用了許多方法制造DNA雙鍵斷裂，如激光顯微切割和藥物處理，從而揭示DSBs對于卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進程以及后期胚胎發(fā)育的影響。博萊霉素（Bleomycin，BLM）或激光顯微切割處理小鼠卵母細(xì)胞，能夠降低GVBD的發(fā)生，并延長GVBD的時間。第一極體的排出也受到延遲，但是一旦GVBD發(fā)生，第一極體排出并不受影響[13]。這些經(jīng)過DSBs損傷最終成熟的小鼠的卵母細(xì)胞能夠被孤雌激活，但是胞質(zhì)內(nèi)會形成多核或多微核。這說明在小鼠上DSBs抑制或延遲G2/M轉(zhuǎn)變，但是一旦GVBD發(fā)生，DNA損傷的卵母細(xì)胞可以完成染色體分離和第一極體排出，此時紡錘體組裝檢驗點（SAC）活性很高，導(dǎo)致卵母細(xì)胞內(nèi)形成多微核。進一步小鼠的體內(nèi)外對比實驗發(fā)現(xiàn)，體外DSBs導(dǎo)致小鼠卵母細(xì)胞體外成熟過程中紡錘絲檢測點的激活，并且影響紡錘體微管著絲粒連接中斷。盡管體外培養(yǎng)過程中發(fā)生了嚴(yán)重的DSBs，還是會有卵母細(xì)胞能夠成熟。但是腹腔注射BLM后對小鼠進行超排，獲卵數(shù)顯著降低，且卵子凋亡比例顯著升高[14]。激光處理小鼠合子中的雄原核或雌原核，胚胎發(fā)育能力顯著降低，這些合子最終形成不了囊胚。激光處理部分卵裂球最終發(fā)生凋亡，而未處理的卵裂球則繼續(xù)發(fā)育形成囊胚，但是囊胚形成率和細(xì)胞數(shù)顯著降低[15]。BLM處理豬的卵母細(xì)胞，DSBs的發(fā)生呈劑量依賴性，但并不影響GVBD，卻阻礙卵母細(xì)胞的最終成熟，表現(xiàn)為第一極體不排出[16]。

體外胚胎發(fā)育過程中，DSBs修復(fù)機制的研究意義是巨大的。盡管胚胎發(fā)生DSBs后會影響發(fā)育，但是與體細(xì)胞相比，胚胎的DSBs修復(fù)機制和能力是不同的。有研究發(fā)現(xiàn)，豬的孤雌胚胎中，早卵裂的胚胎DSBs較少，DSBs修復(fù)基因表達水平較低。早卵裂和晚卵裂的胚胎DSBs水平，在囊胚期無差異，這表明只有較少DNA損傷或者有超強DNA修復(fù)能力的胚胎才會發(fā)育至囊胚[17]。由于與人在卵泡波出現(xiàn)，卵泡選擇，排卵以及和年齡相關(guān)的內(nèi)分泌變化方面都特別相近，牛已被公認(rèn)作為一個合適的動物模型研究生殖力保存。在牛上，體外受精胚胎合子期γH2AX的表達量顯著高于孤雌胚胎和體細(xì)胞核移植胚胎。但在隨后的發(fā)育階段，γH2AX的表達量各組相當(dāng)[18]。此外，該研究中γH2AX表達量在體外培養(yǎng)的牛的胚胎中從1cell期到囊胚期是減少的，這說明在牛體外胚胎發(fā)育過程中DNA修復(fù)機制發(fā)生作用，但是這一機制是怎樣參與調(diào)控的目前尚無報道。

盡管DSBs影響卵子質(zhì)量與胚胎發(fā)育的研究已有報道，但是只是針對某一修復(fù)通路里的某幾個關(guān)鍵基因的表達。在配子發(fā)生和胚胎發(fā)育過程中，DSBs引起的DNA修復(fù)應(yīng)答機制和關(guān)鍵通路的系統(tǒng)研究報道較少。綜上研究顯示，DSBs對不同物種卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和胚胎發(fā)育的影響是有差異的，對同一物種體內(nèi)外成熟的卵母細(xì)胞的影響也是有差異的，甚至胚胎發(fā)育進程不同的胚胎影響也有差異。這些影響與DNA修復(fù)水平密切相關(guān)，但是又存在許多差異，需要系統(tǒng)的研究。

在不同的外源因素和內(nèi)源生理狀況下，卵子發(fā)生和后期胚胎發(fā)育過程中，參與DSBs損傷修復(fù)機制的基因，是怎樣突破染色體精確結(jié)構(gòu)，最終完成DNA修復(fù)，維持基因組穩(wěn)定或啟動細(xì)胞凋亡過程的，這一復(fù)雜調(diào)控機制尚不十分明確，亟需進一步研究。

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本文編輯：徐 陌

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ISSN.2095-8803.2016.20.194.02