付迎欣（天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心，天津 300192）

器官移植是終末期器官功能衰竭最有效的治療方法，目前，隨著手術(shù)方式的改進(jìn)和新型免疫抑制劑的臨床應(yīng)用，移植器官的早期存活率明顯提高，但其長期存活率仍不理想。臨床實踐表明，器官移植的成敗取決于供受者之間的組織相容性，其中人類白細(xì)胞抗原（HLA）等位基因的匹配程度起關(guān)鍵作用，能夠影響移植器官的長期預(yù)后［1］。而腎移植受者術(shù)前免疫狀態(tài)也是影響移植腎存活的重要因素，因此，本文就腎移植術(shù)前免疫狀態(tài)評估的內(nèi)容及方法進(jìn)行綜述。

1 組織配型

組織配型方法包括ABO血型、HLA、群體反應(yīng)性抗體（PRA）和補(bǔ)體依賴淋巴細(xì)胞毒性試驗（CDC），而HLA配型是整個組織配型中最重要的一環(huán)。HLA-A、B、DR 3個位點抗原的錯配數(shù)量是衡量供者和受者HLA匹配程度的傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)，錯配數(shù)量增加與術(shù)后新發(fā)供者特異性抗體相關(guān)，并且是導(dǎo)致移植物排斥反應(yīng)的重要因素。國內(nèi)外大量文獻(xiàn)已證實HLA配型與移植物的遠(yuǎn)期預(yù)后密切相關(guān)。

2 HLA抗體

HLA在供腎內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)，具有高度多態(tài)性，是受體免疫識別供者的關(guān)鍵靶分子，也是引發(fā)移植排斥的主要原因。HLA抗體是急性和慢性排斥反應(yīng)以及移植物丟失的危險因素。 移植前輸血、妊娠（暴露于胎兒父親的非己抗原）、器官移植史等原因均可使移植受者體內(nèi)產(chǎn)生抗HLA抗體，從而使受者處于預(yù)致敏狀態(tài)。受者術(shù)前的致敏狀態(tài)始終是影響移植腎存活的一個重要因素。目前，在腎移植中習(xí)慣將PRA陽性的受者稱為致敏受者，這些受者體內(nèi)往往存在針對供體的特異性抗體，包括HLA-Ⅰ、Ⅱ類抗體和一些非HLA類抗體，是移植后發(fā)生排斥的高危人群。

3 HLA抗體檢測方法

1961年，應(yīng)用補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒交叉試驗方法（CDCXM）的檢測結(jié)果表明，預(yù)存的供者特異性抗體（DSA）是導(dǎo)致超急性排斥反應(yīng)的重要原因［2］。這種方法的廣泛應(yīng)用減少了超急性排斥反應(yīng)和早期加速性排斥反應(yīng)的發(fā)生［3］。HLA抗體檢測方法主要經(jīng)歷了CDC、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）和流式細(xì)胞分析和Luminex 磁珠分析幾個階段。這幾種方法的敏感性不同，CDC方法的敏感性不高，ELISA的敏感性高于CDC，Luminex方法敏感性最高。

3.1 細(xì)胞法檢測HLA抗體：PRA檢測通常是指受者對潛在供者具有HLA抗體和交叉反應(yīng)陽性的百分比。早期的PRA檢測方法需要25～60例真正供者細(xì)胞來代表潛在尸體供者人群常見的HLA表型，然后應(yīng)用受者血清進(jìn)行CDC。這種方法對于少見的HLA抗原敏感性差，只能檢測到高滴度的抗體，已不再孤立應(yīng)用于檢測PRA。供者特異的CDCXM檢測高強(qiáng)度的DSA需要結(jié)合補(bǔ)體以證明抗體的存在，然而低滴度的DSA可以通過流式細(xì)胞交叉反應(yīng)（FCXM），陽性結(jié)果僅需要抗體結(jié)合，不需要補(bǔ)體激活。以細(xì)胞為基礎(chǔ)的分析方法會產(chǎn)生由于自身抗體和非HLA抗體引起的假陽性結(jié)果［4-6］，以及有臨床意義的低滴度抗體引起的假陰性結(jié)果［7-8］。

3.2 固相法：固相法包括ELISA和單抗原磁珠法（SAB），它們對低滴度抗體具有較高的敏感性，能更精確地測定與之結(jié)合的HLA及等位基因。而且，固相法可以從基于細(xì)胞法測定的假陽性結(jié)果中鑒別出真正具有免疫相關(guān)的陽性交叉反應(yīng)。ELISA方法的敏感性低于以磁珠為平臺的方法，且不能檢測DSA。SAB是應(yīng)用單個HLA抗原包被磁珠［9］，能夠檢測抗體的特異性，可以更為精確、更特異性地確定DAS的存在。其原理是在微磁珠上包備純化的HLA，然而加入熒光標(biāo)記的抗人抗體，如果血清中存在抗體，抗原抗體結(jié)合以后，該磁珠發(fā)出熒光。SAB應(yīng)用流式細(xì)胞儀或者Luminex進(jìn)行檢測。

4 臨床中應(yīng)用HLA抗體注意事項

應(yīng)用Luminex方法檢測HLA抗體大大提高了敏感性和特異性，被廣泛應(yīng)用于器官分配和移植腎前免疫風(fēng)險評估。但是，由于其高度敏感性，器官移植醫(yī)生在臨床應(yīng)用中要合理理解Luminex方法的檢測結(jié)果。

判斷SAB結(jié)果時應(yīng)注意的問題包括：① 每個實驗室應(yīng)用SAB檢測已知陰性和陽性結(jié)果的血清，建立本實驗室抗體平均熒光強(qiáng)度 （MFI） 的閾值，并且該閾值要與應(yīng)用FCXM陽性結(jié)果建立聯(lián)系；② 非HLA抗體可以與磁珠非特異性結(jié)合，某些藥物（如免疫球蛋白）、炎癥或感染可以增加對照珠和目標(biāo)磁珠的熒光背景，因此，單純檢測目標(biāo)珠的MFI值會過高，對照珠能提供這種情況的線索；③ 高滴度的抗體能激活補(bǔ)體和C1復(fù)合物沉積到磁珠上，IgM抗體或其他血清成分可能干擾次要檢測試劑的結(jié)合，出現(xiàn)假陰性，被稱為前帶現(xiàn)象。應(yīng)用血清稀釋和乙二胺四乙酸（EDTA）處理或加熱可以減少這種現(xiàn)象［10-11］。

5 移植前檢測抗體的意義

5.1 估算的群反應(yīng)性抗體（cPRA）：計算應(yīng)用SAB測定出的特異性抗體在人群中出現(xiàn)的頻率，是目前估算隨機(jī)選擇供者時出現(xiàn)交叉反應(yīng)陽性或者DSA可能性的最有效的方法［12-13］。有較高cPRA的患者可以獲得器官分配的優(yōu)先權(quán)，增加患者進(jìn)行器官移植的機(jī)會。因為抗體水平和特異性隨著時間推移而減弱，需要每年反復(fù)進(jìn)行檢測（通常每年檢測3～12次）以增加移植機(jī)會。抗體代表潛在的將來免疫記憶反應(yīng)，影響危險性評估。

5.2 虛擬交叉反應(yīng)（VXM）：應(yīng)用SAB結(jié)果可以進(jìn)行虛擬交叉配型從而判斷術(shù)前預(yù)存的DSA，反過來有利于器官的分配和風(fēng)險評估。虛擬交叉反應(yīng)已應(yīng)用在無法進(jìn)行細(xì)胞交叉反應(yīng)的移植中或科研中。研究發(fā)現(xiàn)高致敏患者如果沒有DSA，其腎移植的結(jié)果與非致敏患者相似［14-15］。對于高致敏患者應(yīng)用虛擬交叉反應(yīng)方法能夠比較受者的抗體與供者的抗原，快速和提前判斷DSA陰性的供者，稱之為可接受的錯配策略。

6 分層分析術(shù)前預(yù)存DSA的危險度

不存在DSA，特別是無高滴度的DSA，通常認(rèn)為是成功進(jìn)行腎移植的先決條件，至少移植前交叉反應(yīng)是陰性。

6.1 術(shù)前DSA陽性、交叉反應(yīng)陽性：交叉反應(yīng)陽性并且固相法檢測的DSA陽性，近期和遠(yuǎn)期的預(yù)后都較差［16-17］。相反，缺少DSA，陽性的交叉反應(yīng)可能與預(yù)后的相關(guān)性不強(qiáng)［18］。在活體或尸體腎移植中，術(shù)前預(yù)存的DSA可能通過脫敏治療降低抗體來增加移植的機(jī)會。然而長期的結(jié)果不同，研究表明，脫敏治療的患者中抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)（AMR）的發(fā)生率在37%～45%，對照組AMR的發(fā)生率小于5%，移植腎脫敏治療組大于50%而對照組AMR的發(fā)生率小于10%［19-20］。

預(yù)存DSA的MFI值對預(yù)后尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。Gloor等［21］研究發(fā)現(xiàn)，交叉反應(yīng)陽性的患者中，所有水平DSA的MFI值都能增加AMR和移植腎病的發(fā)生率，當(dāng)MFI值大于10 000時明確地增加了AMR的發(fā)生率。研究結(jié)果顯示，當(dāng)MFI＞1 500時會影響移植物的存活［22］，而另一些研究認(rèn)為當(dāng)MFI＞3 000時才會影響移植腎遠(yuǎn)期存活，可見DSA的MFI閾值尚未統(tǒng)一［23］。當(dāng)MFI＞10 000時可能是補(bǔ)體結(jié)合DSA（C1q+DSA），并未發(fā)現(xiàn)術(shù)前C1q+DSA比普通DSA更能增加AMR的發(fā)生率［24-26］。

6.2 術(shù)前交叉反應(yīng)陰性的DSA：由于SAB的高度敏感性，可以在交叉反應(yīng)陰性的血清中檢測到 DSA［27-28］。在這種情況下， AMR 的發(fā)生率為20% ～55%［29-30］，DSA的 MFI值被認(rèn)為是重要的指標(biāo)。而也有研究人員發(fā)現(xiàn)當(dāng)交叉反應(yīng)陰性時，DSA陽性不影響移植物的排斥反應(yīng)和遠(yuǎn)期存活［31-32］。這些研究的樣本例數(shù)較小，并且是回顧性研究，很難比較不同研究中心實驗方法的差異。并且沒有對術(shù)前預(yù)存DSA進(jìn)一步分層分析抗體的類別，抗體的數(shù)量和MFI值。

HLA抗體檢測是腎移植術(shù)前免疫評估的重要內(nèi)容，目前Luminex技術(shù)是檢測DSA最敏感的方法。但這種高度敏感的技術(shù)也存在一些局限性，對臨床預(yù)后的影響需要進(jìn)行綜合判斷。