劉洋

（遼寧水利職業(yè)學院，遼寧沈陽 110100）

·研究綜述·

同工酶技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用

劉洋

（遼寧水利職業(yè)學院，遼寧沈陽 110100）

同工酶主要指那些來源相同、催化性質(zhì)相同而分子結(jié)構(gòu)有差異的酶蛋白分子，普遍存在于高等植物中。同工酶技術(shù)作為1種常規(guī)的分析手段，已廣泛應(yīng)用于蔬菜的起源、分類、親緣關(guān)系鑒定、遺傳育種、病理和生理等研究領(lǐng)域，極大推動了蔬菜園藝學科的發(fā)展。

同工酶；植物分類；植物生態(tài)；栽培生理；遺傳育種

同工酶主要指那些來源相同、催化性質(zhì)相同而分子結(jié)構(gòu)有差異的酶蛋白分子，普遍存在于高等植物中。迄今，在園藝作物上已研究過的同工酶有過氧化物酶（POD）、酯酶（EST）、蘋果酸脫氫酶（MDH）、酸性磷酸酶（APS）、磷酸酯酶、α-淀粉酶、胞外漆酶（ECI）、超氧化物歧化酶（SOD）、兒茶酚酶（CAT）、醇脫氫酶（ADH）等。大多數(shù)基因性同工酶由于對底物親和力不同和受不同因素的調(diào)節(jié)，常表現(xiàn)出不同的生理功能，在植物分類、植物形態(tài)、栽培生理和遺傳育種上均有廣泛應(yīng)用。

1 同工酶技術(shù)在植物分類學上的應(yīng)用

20世紀70年代，同工酶電泳技術(shù)開始在植物研究中應(yīng)用，Gottlieb首次用于種子植物。1977年，Gottlieb對植物中已作過等位酶報道的28個物種進行了總結(jié)，發(fā)現(xiàn)種內(nèi)居群間遺傳一致度很高，平均值為0.95。雖然不同物種有差異，但除一例外（遺傳一致度為0.54），其余種內(nèi)居群間的遺傳一致度均大于0.90（0.90～1.00）?？墒?3對種間的遺傳一致度值明顯下降，平均值為0.67（0.28～0.99）。這說明遺傳相似性在植物種內(nèi)居群間較高而在種間則較低。Crawford2次對此后數(shù)量倍增的報道進行總結(jié)分析，所得結(jié)果與10多年前Gottlieb（1977）的結(jié)果基本一致。根據(jù)迄今利用等位酶來探討種內(nèi)居群間、地理宗間、亞種（或變種）間，以及屬內(nèi)種間遺傳趨異的大量報道，可以得出1個一般規(guī)律：隨著分類等級的提高，遺傳一致度下降，遺傳距離加大。

在分類學領(lǐng)域，大量的實驗已經(jīng)證明同工酶電泳技術(shù)在屬、種鑒定中是1項切實可行的實驗手段，近年來有關(guān)這方面的報道也較多。朱光華等對鵝觀草屬與披堿草屬屬界劃分的酷酶和過氧化物酶同工酶比較研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用酌酶和過氧化物酶同工酶很容易將二者區(qū)分開來，為鵝觀草屬與披堿草屬的分類鑒定上提供了科學依據(jù)。伍世平等對10種草坪及地被植物的同工酶進行了研究，結(jié)果表明同工酶的方法能使種與品種（如草地早熟禾與瓦巴斯）很好地在分子水平上區(qū)分開，在區(qū)分同科同屬或同科不同屬（如百合科的3種植物）種類方面也取得了較好的效果。

2 同工酶技術(shù)在植物生態(tài)學上的應(yīng)用

由于同工酶參與植物的大多數(shù)生理生態(tài)活動和代謝途徑，因而同工酶分析技術(shù)在植物生理生態(tài)學研究中應(yīng)用相當廣泛［1］。在植物的不同發(fā)育階段和不同器官組織中同工酶都具有特異性表現(xiàn)，其合成受一系列基因的調(diào)控，常作為遺傳信息的指標來研究植物的生長發(fā)育和器官分化［2］。植物種子生活力、組織與器官分化、生長及胚胎發(fā)育，以及環(huán)境因素和植物激素都會影響同工酶的變化。植物在不同發(fā)育時期其同工酶酶譜也有差異。

比較分析水稻不同發(fā)育時期淀粉酶、醋酶同工酶的變化，結(jié)果顯示，各種植物激素也可導(dǎo)致同工酶變化。Lee的一系列研究工作指出，煙草愈傷組織的過氧化物酶譜受到外源植物激素在量上及質(zhì)上的調(diào)控。高濃度的IAA引起兩個新的過氧化物酶同工酶出現(xiàn)，在有IAA時，赤霉素及玉米素也能誘導(dǎo)新的酶帶。王振英等以強耐鹽、一般耐鹽和鹽敏感3種水稻為材料，在鹽脅迫下進行了RAPD和POD同工酶檢測，結(jié)果強耐鹽的水稻經(jīng)鹽脅迫后，POD同工酶增加，而對鹽敏感的水稻側(cè)根系內(nèi)POD同工酶減少，一般耐鹽與正常品種水稻根內(nèi)POD同工酶比較穩(wěn)定或略有減少現(xiàn)象。實驗表明，POD同工酶的變化水稻耐鹽與鹽敏感特性存在一定的相關(guān)性，POD同工酶是1種對外界不良環(huán)境條件十分敏感的酶。環(huán)境中高濃度的鹽可以誘導(dǎo)或抑制某些同工酶的產(chǎn)生。一些學者把這些特性稱作適應(yīng)性的反應(yīng)。

3 同工酶技術(shù)在園藝作物栽培生理上的應(yīng)用

過氧化物酶具有氧化吲哚乙酸、促進木質(zhì)化和對感病與機械損傷等傷害的保護等多種作用。大量的實驗表明，嫁接體發(fā)育過程中不同生育期及植株不同部位顯示的不同過氧化物酶酶譜，與器官和組織的生理特性及代謝有關(guān)。盧善發(fā)［3］等在研究番茄嫁接體發(fā)育過程中的過氧化物酶同工酶的變化中發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)處理的對照中同工酶帶略有變化，是植物正常生長發(fā)育的結(jié)果。嫁接和創(chuàng)傷處理后酶譜及酶活性變化與對照明顯不同，說明處理后植物體內(nèi)發(fā)生了一系列不同于對照的代謝變化。嫁接初期，因嫁接切割而引起的創(chuàng)傷響應(yīng)可誘導(dǎo)產(chǎn)生過氧化物酶同工酶并影響酶活性。目前已經(jīng)找到了一些受創(chuàng)傷誘導(dǎo)的過氧化物酶，它們可消除因創(chuàng)傷而產(chǎn)生的大量自由基并參與隨后的愈合作用。創(chuàng)傷部位過氧化物酶同工酶的產(chǎn)生及酶活性的升高與此相關(guān)。

嫁接接合部的發(fā)育有別于傷口愈合。嫁接初期，接穗和砧木間失去共質(zhì)體聯(lián)絡(luò)，隨著嫁接面產(chǎn)生隔離層，植物激素如生長素的極性運輸受阻，在維管束切割面附近積累并釋放到周圍組織，引起嫁接面激素分布發(fā)生變化。接合部激素的失衡遠較具有共質(zhì)體聯(lián)絡(luò)的傷口嚴重。作為氧化吲哚乙酸的關(guān)鍵酶之一，相關(guān)的過氧化物酶同工酶快速表達，在嫁接面的局部氧化吲哚乙酸、調(diào)節(jié)生長素水平、維持激素平衡顯得非常重要。嫁接體發(fā)育還包括愈傷組織的產(chǎn)生、貫通接穗和砧木的維管束橋分化等幾方面。在此過程中過氧化物酶參與木質(zhì)素合成、細胞壁多糖間的連結(jié)及一些蛋白質(zhì)分子的交聯(lián)反應(yīng)。人們發(fā)現(xiàn)過氧化物酶同工酶的產(chǎn)生和酶活性的變化與木質(zhì)化作用相關(guān)。如在牙買加辣椒和番茄的親和與不親和嫁接接合部，正是過氧化物酶呈現(xiàn)活性的部位出現(xiàn)木質(zhì)素沉積，此外還分離出1個在管狀分子分化過程中特異地參與木質(zhì)素合成的過氧化物酶同工酶。

同工酶本身是受遺傳控制的，李能芳等研究嫁接后POD同工酶的變化發(fā)現(xiàn)，嫁接茄子植株莖葉的POD同工酶譜發(fā)生了明顯的變化，可以說嫁接影響了茄子的遺傳特性。前蘇聯(lián)學者研究辣椒親本及其雜交種的結(jié)構(gòu)蛋白成分和POD同工酶時，發(fā)現(xiàn)雜交優(yōu)勢強的雜種電泳譜中有新的特異蛋白成分及POD同工酶帶。嫁接茄子也具有此特性。而且，嫁接茄子植株在結(jié)果后期，莖葉和根的POD同工酶均發(fā)生了不同程度的變化，莖葉的酶帶由原來的4條增加到5條，強帶由原來的2條增加到3條，根的酶帶數(shù)未發(fā)生變化，僅是強弱和遷移率的變化?？梢姡藿又仓曛姓枘緦铀氲挠绊懽饔么笥诮铀雽φ枘镜挠绊懽饔?。

許多研究已證實同工酶具有階段特異性和組織特異性。通過對不同時期及不同器官中的POD同工酶分析，發(fā)現(xiàn)貯藏期的瓜類干種子僅有3條弱的POD酶帶，種子萌發(fā)時酶帶迅速增至6條，但活性仍較弱，子葉期和真葉期酶帶和活性都比前一階段明顯增強。用南瓜作試驗證明，在休眠種子中只有1種谷氨酸脫氫酶的同工酶，萌發(fā)后2d，在子葉內(nèi)又形成此酶的2種同工酶，經(jīng)4d同工酶總數(shù)達5種，而經(jīng)5d則有7種同工酶。

4 同工酶技術(shù)在園藝遺傳育種上的應(yīng)用

雜種優(yōu)勢的利用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要作用，但在制種過程中必須要人工去雄。這在玉米等雌雄異花作物中相對容易些，但在水稻、小麥等作物中，靠人工去雄則無法實現(xiàn)，必須找到雄性不育系才能制雜交種。楊太興等對玉米T、C、M型等12個雄性不育系及其保持系的苗期葉片、灌漿期胚乳及花藥進行了8個同工酶分析，除看到不育系與相應(yīng)保持系花藥中的過氧化物酶、酯酶和淀粉酶的同工酶酶譜有明顯差異外，還觀察到T型、C型和M型等3種細胞質(zhì)雄性不育類型之間酶譜不同，但未發(fā)現(xiàn)不育系花藥中其他5種同工酶酶譜與保持系之間的差異。曾孟潛等進一步用異質(zhì)同核系和正常系為材料，用電泳方法分析了花藥中的酯酶、過氧化物酶和α-淀粉酶同工酶酶譜，就不育系種類而論，POD第5、6帶相對活性按T型、S（M）型和C型順序遞減，而第3帶按S（M）型、T型和C型順序遞減。此外，在α-淀粉酶和酯酶同工酶酶譜中也觀察到各型不育細胞質(zhì)類型間的差異，并認為可能是劃分不同不育類型的1種補充指標。劉春光等對小麥D2型細胞質(zhì)不育系雄配子發(fā)育的細胞形態(tài)學特征和同工酶進行了研究，結(jié)果表明，D2型不育系花粉敗育起始于單核—雙核期，表現(xiàn)敗育方式多樣化。三核期花藥的同工酶有明顯差異，不育系酯酶比保持系少3條帶。酶的總活性比保持系弱，過氧化物酶總活性比保持系弱很多，且少3條酶帶。這些特征表明D2型不同于T型和K型，是新型不育類型。蔡明等用甘藍型油菜和埃塞俄比亞芥進行正反交研究，從F3開始，在正交組合中選擇雄性不育株與反交組合中的可育株成對測交和回交，篩選雄性不育和相應(yīng)的保持材料。酯酶同工酶和核型分析結(jié)果表明，它的雄性不育是重組的核基因在普通甘藍油菜細胞質(zhì)遺傳背景下的表現(xiàn)。

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