張穎/天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心

副豬嗜血桿菌病診斷研究進(jìn)展

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副豬嗜血桿菌病又稱革拉澤氏病，是由副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，Hps）引起的豬的呼吸道傳染病，主要感染斷奶前后仔豬，引起豬多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎，已嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展，因此早期診斷有助于控制好該病。

一、病原學(xué)檢測(cè)

根據(jù)臨床癥狀、剖檢病變進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定是副豬嗜血桿菌病的經(jīng)典診斷方法。然而該菌培養(yǎng)條件苛刻，生長過程需要額外的NAD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）。但往往在實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)，很難從患病動(dòng)物中分離到HPS，尤其是經(jīng)抗生素治療后，其分離更加復(fù)雜。

二、血清學(xué)檢測(cè)

用于檢測(cè)副豬嗜血桿菌抗體的方法由補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CF）、間接血凝試驗(yàn)（IHA）和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。

1.補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CF）。過去國外以補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)為主，在急性病例的臨床經(jīng)過開始后大約1周出現(xiàn)循環(huán)CF抗體。Takahashi等采用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)二次免疫后19 d后陽性抗體滴度，但該實(shí)驗(yàn)并未檢測(cè)不同血清型之間的交叉反應(yīng)。由于補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)參與反應(yīng)的成分多，影響因素復(fù)雜，操作因素復(fù)雜，已被其他方法取代。

2.間接血凝試驗(yàn)（IHA）。將可溶性抗原吸附于一種與免疫無關(guān)且有一定大小的不溶性顆粒的表面，在有電解質(zhì)存在的適宜條件下，與相應(yīng)的抗體發(fā)生特異性凝集。魏子貢等將血清型4、5型分離菌株經(jīng)超聲波破碎處理后的產(chǎn)物致敏醛化紅細(xì)胞，建立HPS間接血凝試驗(yàn)，其敏感性為瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的16倍，對(duì)1 665份豬血清進(jìn)行檢測(cè)，陽性率47.1%。

3.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。

ELISA方法是目前實(shí)驗(yàn)室診斷中常用的方法，具有靈敏度高、穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。建立該方法所選擇的抗原由莢膜多糖、滅活全菌體、超聲破碎抗原等。王艷等以副豬嗜血桿菌全菌體濃度為2.24×107CFU/孔作為包被抗原，建立了副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法，經(jīng)檢測(cè)，14個(gè)發(fā)病豬場(chǎng)的100份血清抗體陽性率94%，明顯高于細(xì)菌分離鑒定結(jié)果。石碧等以該菌血清5型菌株的莢膜多糖作為抗原分別建立了間接血凝試驗(yàn)（IHA）和間接ELISA兩種抗體檢測(cè)方法，其特異性良好，但ELISA敏感性是IHA的5～10倍。對(duì)320份臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，IHA和ELISA陽性率分別40%和59%。劉娜等提取該菌的超聲波破碎抗原、全菌抗原作為包被抗原建立的兩種間接ELISA方法，對(duì)四川省和重慶市的4個(gè)豬場(chǎng)的162份血清進(jìn)行檢測(cè)，并用間接血凝試驗(yàn)作為對(duì)照，結(jié)果顯示，包被全菌抗原、超聲波破碎抗原建立的間接ELISA方法相對(duì)于間接血凝方法的符合率分別為98.15%和97.53%。馮小明等采用超聲裂解的副豬嗜血桿菌血清5型分離株菌體上清作為包被抗原，對(duì)其反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立間接ELISA方法，并對(duì)浙江地區(qū)6個(gè)豬場(chǎng)的200份血清進(jìn)行檢測(cè)，以間接血凝作比對(duì)，其陽性率分別為21%、15%，敏感性明顯高于間接血凝試驗(yàn)。馬福利等采用超聲裂解副豬嗜血桿菌分離株5型菌體上清作為包被抗原，初步建立副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA檢測(cè)方法。與商品化ELISA試劑盒進(jìn)行比對(duì)，檢測(cè)結(jié)果基本一致。然而血清學(xué)檢測(cè)只能作為豬群是否感染過副豬嗜血桿菌的診斷依據(jù)，而不能作為診斷該病的依據(jù)，在臨床診斷中，除了觀察豬群臨床癥狀、病理變化，還需借助分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行確診。

三、分子生物學(xué)技術(shù)

隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入，PCR診斷技術(shù)已廣泛用于各個(gè)領(lǐng)域。尹秀鳳等建立了快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的PCR方法，擴(kuò)增片段大小為822 bp，最小檢測(cè)量為1 080個(gè)Hps。與大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌無特異性反應(yīng)。經(jīng)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)肺臟檢出率最高。張盼鋒等針對(duì)副豬嗜血桿菌16 s rRNA基因特異性PCR引物序列，合成一對(duì)PCR引物，建立相應(yīng)的PCR檢測(cè)方法，結(jié)果顯示可檢測(cè)出濃度為2.8×103CFU/mL。萬世平等根據(jù)副豬嗜血桿菌16 s rRNA基因設(shè)計(jì)了一對(duì)引物， 通過最佳條件摸索，擴(kuò)增出大小為821 bp的特異目的基因片段， 建立了快速檢測(cè)副豬嗜血桿菌的PCR方法。該方法最低檢出量達(dá)10-3ng， 且對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、傳染性胸膜肺炎放線桿菌和巴氏桿菌等均無交叉反應(yīng)。但常規(guī)PCR只能定性，而不能定量起始DNA模板的拷貝數(shù)，隨著熒光定量PCR技術(shù)的快速發(fā)展，該技術(shù)廣泛用于用于疾病的檢測(cè)。該技術(shù)靈敏度比普通PCR提高100倍，并能減少假陽性發(fā)生的幾率，并且由于不用電泳減少了污染、節(jié)省了時(shí)間、使檢測(cè)結(jié)果更為直觀。于江等根據(jù)infB基因序列建立基于SYBR Green I熒光定量PCR檢測(cè)方法，結(jié)果表明，該方法特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性高，批間與批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)均小于2.5%。李軍等根據(jù)16 s rRNA基因序列，建立快速定量檢測(cè)副豬嗜血桿菌的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，結(jié)果表明，該方法最低檢測(cè)限為50拷貝/uL，特異性、重復(fù)性好，變異系數(shù)均小于2%。羅寶玉等根據(jù)轉(zhuǎn)錄起始因子infB基因序列，建立TaqMan探針熒光PCR技術(shù)，檢測(cè)結(jié)果顯示，其靈敏度達(dá)1 ul 1.0×101拷貝的數(shù)量級(jí)，在對(duì)送檢的56份豬肉和12份血漿蛋白粉樣品進(jìn)行檢測(cè)中顯示，該方法與細(xì)菌分離方法效果一致。

四、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)最早是由日本學(xué)者Notomi于2000年提出的新的基因診斷技術(shù)，目前已有一些病原微生物成功利用LAMP檢測(cè)，該方法靈敏度高，反應(yīng)時(shí)間短，無需特殊儀器，操作簡(jiǎn)單，特別適合基層人員操作。朱杰儀等人根據(jù)GenBank上發(fā)表的不同血清型Hps的16S rRNA序列，針對(duì)其保守區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性引物，建立Hps環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法，實(shí)驗(yàn)表明，該方法在恒溫63℃條件下特異性強(qiáng)，敏感性是PCR的100倍。魏曉媛以O(shè)MP P2基因序列建立環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，LAMP最低檢測(cè)DNA量為0.2 pg/ uL。車勇良等根據(jù)副豬嗜血桿菌肽聚糖相關(guān)脂蛋白（PalA）基因序列建立該菌的可視化LAMP檢測(cè)方法，實(shí)驗(yàn)表明，該方法在55℃水浴1h可高效擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后加入SYBR Green I可通過肉眼觀察結(jié)果，其對(duì)DNA核酸的最低檢測(cè)限為40fg，是常規(guī)PCR檢測(cè)最低限的100倍。但在實(shí)際操作中，由于其靈敏度高，以致開蓋后容易造成氣溶膠污染而出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，相信一些新型診斷方法會(huì)不斷問世以推廣應(yīng)用，使人們能更快速、準(zhǔn)確地診斷副豬嗜血桿菌病。

（略）