耿曉華，李明闖，程習(xí)輝

(鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院，鄭州 450007)

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髓母細(xì)胞瘤組織中SIRT6的表達(dá)觀察

耿曉華，李明闖，程習(xí)輝

(鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院，鄭州 450007)

目的觀察髓母細(xì)胞瘤組織中沉默信息調(diào)節(jié)因子6(SIRT6)的表達(dá)變化。方法20例份髓母細(xì)胞瘤組織(腫瘤組)，20例份瘤旁正常組織(瘤旁組)，采用RT-PCR法檢測兩組SIRT6 mRNA，Western blotting法檢測SIRT6蛋白。結(jié)果腫瘤組、瘤旁組SIRT6 mRNA相對表達(dá)量分為0.21±0.16、1.01±0.27，SIRT6蛋白相對表達(dá)量分別為0.54±0.14、1.25±0.12，兩組比較，P均<0.05。結(jié)論髓母細(xì)胞瘤組織中SIRT6 mRNA、蛋白表達(dá)降低。

髓母細(xì)胞瘤；沉默信息調(diào)節(jié)因子6

髓母細(xì)胞瘤是高度惡性的神經(jīng)上皮組織腫瘤，也是兒童常見的惡性腫瘤之一，其預(yù)后較差，目前發(fā)病機(jī)制仍不清楚。沉默信息調(diào)節(jié)因子6(SIRT6)屬Sirtuin家族成員之一[1]，其位于細(xì)胞核內(nèi)，具有去乙?；负虯DP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性的作用，在人和小鼠多種組織中都有表達(dá)[2]，在人類大腦中亦呈高表達(dá)狀態(tài)，對神經(jīng)細(xì)胞的萎縮、代謝均有影響[3]。Chen等[4]發(fā)現(xiàn)，SIRT6可以抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞在體內(nèi)的生長。目前，關(guān)于SIRT6與髓母細(xì)胞瘤關(guān)系的研究鮮有報(bào)道。本研究采取RT-PCR法和Western blotting法分別對髓母細(xì)胞瘤組織中SIRT6 mRNA、蛋白進(jìn)行檢測，以探討其在髓母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇2012年1月～2015年7月鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院收治的髓母細(xì)胞瘤患者20例，男13例，女7例；年齡5～45歲；病程1周～4個(gè)月。所有患者術(shù)前均未接受化療、放療及其他治療。手術(shù)留取腫瘤組織及瘤旁組織各20例份(分別計(jì)為腫瘤組和瘤旁組)。

1.2SIRT6 mRNA檢測方法采用RT-PCR法。兩組分別稱取50 mg組織，在液氮中研磨后移入EP管，加入1 mL TRIzol，冰浴充分勻漿，室溫靜5 min；4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移到新的EP管中。每管中加入200 μL氯仿，渦旋儀劇烈渦旋30 s，冰盒放置3 min；12 000 r/min 離心15 min，取上層無色的水相；加入200 μL異丙醇，反復(fù)顛倒混勻，室溫靜置20 min；12 000 r /min離心10 min，保留沉淀；加入預(yù)冷的1 mL的75%乙醇，渦旋儀振蕩混勻；4 ℃下以7 500 r/min 離心5 min，小心去除上清，將RNA沉淀置于超凈臺通風(fēng)干燥處理10 min；每管中加入30 μL去離子水溶解RNA沉淀，-70 ℃凍存?zhèn)溆谩２捎肕-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄mRNA后，進(jìn)行熒光定量PCR檢測，所有操作均按試劑說明書進(jìn)行。

1.3SIRT6蛋白檢測方法采用Western blotting法。將組織置于液氮中冷凍，后迅速放于研缽中研磨成粉末狀，移入EP管中，加入總蛋白提取液，置于冰上，超聲波振蕩3次，每次10 s，后冰上靜置10 min。置于低溫高速離心機(jī)，4 ℃下以10 000 r/min離心5 min，取上清以BCA法測定蛋白濃度。加入溴酚藍(lán)后進(jìn)行變性。配制10%分離膠，取等量樣品上樣于聚丙烯酰胺凝膠，電泳，至溴酚藍(lán)跑到膠底部。將聚丙烯酰胺凝膠經(jīng)過轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用封閉液封閉該P(yáng)VDF膜60 min，洗膜3次，將轉(zhuǎn)膜后的膜蛋白面朝下平鋪于保鮮膜上的一抗液中，排除氣泡，常溫?fù)u床孵育，2 h后以TBST清洗，每次10 min。酶標(biāo)二抗與一抗結(jié)合，于凝膠成像系統(tǒng)中曝光。顯色后用Image J分析軟件進(jìn)行分析，檢測其IOD累積光密度參照值，并計(jì)算每組目的蛋白對比內(nèi)參表達(dá)的相對值，以此作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

2　結(jié)果

腫瘤組、瘤旁組SIRT6 mRNA相對表達(dá)量分為0.21±0.16、1.01±0.27，SIRT6蛋白相對表達(dá)量分別為0.54±0.14、1.25±0.12，兩組比較，P均<0.05。

3　討論

Sirtuins家族為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性的組蛋白去乙?；?，包含7個(gè)成員(SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、SIRT7)，其分布廣泛，功能復(fù)雜多樣[5,6]，SIRT6屬Sirtuin家族成員之一，同時(shí)具有去乙?；负虯DP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性作用[7]，與神經(jīng)生長、腫瘤發(fā)生有關(guān)[3]。目前已經(jīng)證實(shí)，SIRT6參與了包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝癌、乳腺癌、胰腺癌和結(jié)腸癌等[4,8,9]多種腫瘤的發(fā)生，且在不同腫瘤中發(fā)揮作用不同[10]，而關(guān)于髓母細(xì)胞瘤中SIRT6mRNA轉(zhuǎn)錄情況及蛋白表達(dá)情況鮮有報(bào)道。

本研究顯示，腫瘤組SIRT6 mRNA、蛋白相對表達(dá)量低于瘤旁組，表明SIRT6可能參與了髓母細(xì)胞瘤的發(fā)生。從上述結(jié)果可以看出，不管是在轉(zhuǎn)錄水平，還是在蛋白水平，SIRT6在髓母細(xì)胞瘤中的表達(dá)明顯低于瘤旁正常組織，提示SIRT6在髓母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮著抑制作用。這與此前報(bào)道[4,8,11]SIRT6在肝癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達(dá)下調(diào)結(jié)果一致。SIRT6在腫瘤形成中發(fā)揮抑制作用的機(jī)制尚不清楚，可能是通過直接與腫瘤抑制因子、致癌蛋白相互作用，調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)展或通過調(diào)節(jié)組蛋白的乙?；?賴氨酸9致癌基因的啟動子，通過抑制ERK1/2信號通路而抑制腫瘤細(xì)胞的增長[4,11～13]。但也有報(bào)道[10,14]，SIRT6在某些腫瘤中表達(dá)高于正常組織，如前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌。

總之，髓母細(xì)胞瘤組織中SIRT6 mRNA及蛋白表達(dá)異常，推測其在髓母細(xì)胞瘤中可能發(fā)揮抑癌作用。

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