歐陽柳鳳，朱珂璇，邵 曉，張 薔，趙玉男＊＊

（1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室 延安 716000；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)研究中心 南京 210046）

腦內(nèi)小分子檢測技術(shù)及人參皂苷入腦的研究進(jìn)展＊

歐陽柳鳳1，朱珂璇2，邵 曉2，張 薔2，趙玉男2＊＊

（1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室 延安 716000；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)研究中心 南京 210046）

許多中藥在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病均有療效，但其作用機(jī)制并不清楚。本文簡要介紹了血腦屏障（BBB）的生理組成，藥物穿透BBB的途徑，并介紹了3種主要針對腦內(nèi)小分子物質(zhì)的檢測技術(shù)：高效液相色譜法、免疫組織化學(xué)法和放射性同位素標(biāo)記法。這些技術(shù)將有助于小分子入腦的研究，并得出它們在腦組織內(nèi)的分布以及判斷是否能透過血腦屏障，從而探索它們中樞活性的作用模式。綜合分析國內(nèi)外的研究人員針對人參皂苷進(jìn)行了其入腦的研究可得：人參皂苷可以到達(dá)BBB，作用于微血管內(nèi)皮細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞間接發(fā)揮中樞活性，至于是否能透過BBB到達(dá)神經(jīng)元，仍需進(jìn)一步的研究確認(rèn)。

人參皂苷 血腦屏障 高效液相色譜法 免疫組化 放射性同位素標(biāo)記

現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，許多中藥有效成分均具有中樞活性，能很好的治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如人參的有效成分人參皂苷[1]。然而，目前中藥有效成分發(fā)揮中樞活性的作用模式并不明朗，其作用靶點(diǎn)可能位于中樞或外周。由于血腦屏障（Blood Brain Barrier，BBB）的存在，可以推斷出中藥有效成分中樞活性的作用模式可能為直接作用于神經(jīng)元或是通過構(gòu)成BBB的內(nèi)皮細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞間接發(fā)揮其中樞活性。因此，腦內(nèi)小分子物質(zhì)的檢測主要有兩個目標(biāo)：一是判斷其能否到達(dá)BBB；二是能否透過BBB進(jìn)入腦組織，接觸神經(jīng)元?；谶@種研究需求，本文簡要介紹了血腦屏障的構(gòu)成、藥物穿透BBB的途徑以及3種主要腦內(nèi)小分子檢測分析技術(shù)：高效液相色 譜 法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）、免疫組化（Immunohistochemistry，IHC）和放射性同位素標(biāo)記法。這些技術(shù)將有助于研究中藥有效成分中樞活性的作用模式；同時，本文還以人參皂苷為例，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果，對人參皂苷入腦研究進(jìn)行了歸納總結(jié)。

1 血腦屏障

1.1 BBB的基本組成及其生理作用

BBB是保護(hù)腦組織的天然生理屏障，是存在于腦組織和血液之間的一個復(fù)雜細(xì)胞系統(tǒng)，通過控制血腦兩側(cè)的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，保證了中樞神經(jīng)組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[2]。它由緊密連接的血管內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜以及星形膠質(zhì)細(xì)胞的足突組成，為BBB的“物理屏障”。毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞最重要的作用就是：使處于循環(huán)中的內(nèi)源性和外源性物質(zhì)無法輕易穿過自身進(jìn)入腦組織。腦內(nèi)的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有著連續(xù)的緊密連接、胞飲作用活力低、不存在開孔[3]，構(gòu)成BBB并調(diào)控其通透性。星形膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成血腦屏障的第二道屏障，星形膠質(zhì)細(xì)胞的終足，貼附于毛細(xì)血管外周形成膠質(zhì)膜，包繞了毛細(xì)血管85%的表面。膠質(zhì)細(xì)胞膜也是血腦屏障不可缺少的一層，其作用不單是機(jī)械阻擋，在促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的荷電性和誘導(dǎo) BBB 功能等方面都發(fā)揮著重要作用[4，5]。終足還能釋放化學(xué)因子和信號參與調(diào)控腦內(nèi)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，在維持腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的屏障特性和控制腦血流方面，也起決定性的作用[6]。BBB是具有生理功能的動態(tài)屏障。對于不同的化學(xué)物質(zhì)，能夠特異性、選擇性地控制它們進(jìn)入與排出腦組織[7]。在正常生理情況下僅允許氣體分子及相對分子質(zhì)量小于400-600的脂溶性小分子通過，除了被動保護(hù)作用外，它還能選擇性地將腦內(nèi)有害或過剩物質(zhì)泵出腦外，從而保持腦的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，使中樞神經(jīng)系統(tǒng)能有效地執(zhí)行功能。

1.2 穿透BBB的途徑

BBB并不能阻止所有物質(zhì)進(jìn)出大腦，一些物質(zhì)例如具有脂溶性、一定分子質(zhì)量及電荷的小分子物質(zhì)能夠直接從血液擴(kuò)散穿越BBB進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。大多數(shù)物質(zhì)必須通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞腔面細(xì)胞膜上所表達(dá)的特殊轉(zhuǎn)運(yùn)體和（或）受體相互作用，才可以穿過BBB，進(jìn)行物質(zhì)代謝。現(xiàn)已知物質(zhì)透過BBB的機(jī)制有以下3種：①有些水溶性小分子物質(zhì)可經(jīng)在血管內(nèi)皮細(xì)胞腔面及基底側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)入腦；②相對分子量更大的親水性物質(zhì)可經(jīng)胞吞或跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)穿過BBB；③一些脂溶性小分子可通過被動擴(kuò)散入腦。然而，不管通過何種方式入腦，藥物在進(jìn)入腦組織之前都會與血管內(nèi)皮細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)存在的降解酶接觸而被降解或代謝，其原型或代謝物最終會通過BBB的血管內(nèi)皮細(xì)胞管腔側(cè)所表達(dá)的排出泵（如：P-糖蛋白、多藥耐藥相關(guān)蛋白2、乳腺癌耐藥蛋白等）而被泵出，從而限制藥物進(jìn)入腦組織的量，可以看成BBB的“代謝屏障”[8，9]。

1.2.1 被動擴(kuò)散

被動擴(kuò)散僅適合小分子、親脂性、非極性的物質(zhì)。脂溶性氣體如O2和CO2通過血管壁進(jìn)行充分的交換；BBB允許脂溶性高的物質(zhì)通過，如丁醇，不允許脂溶性低的分子通過，如甘露醇；BBB對許多物質(zhì)的通透系數(shù)與這些物質(zhì)的脂溶度即油-水比例系數(shù)呈正相關(guān)：如尼古丁和海洛因油-水比例系數(shù)較高，在一定范圍內(nèi)增加藥物脂溶度就較易于進(jìn)入腦組織[10]。

1.2.2 跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)

大多數(shù)非脂溶性物質(zhì)以及大分子物質(zhì)主要通過跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)透過BBB。這些物質(zhì)必須與特異性的載體或受體結(jié)合，改變構(gòu)相后跨過脂質(zhì)膜性BBB，再與之分離。

水溶性小分子物質(zhì)主要是通過血管內(nèi)皮細(xì)胞血管腔面與基底側(cè)上所表達(dá)的轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)穿過BBB。腦必需的每一種主要的營養(yǎng)物質(zhì)都有特定的輸送器[11]，這些輸送器能識別營養(yǎng)物質(zhì)分子，輸送它穿過胞膜。葡萄糖是腦組織惟一的能量來源，BBB內(nèi)皮細(xì)胞存在著的己糖轉(zhuǎn)運(yùn)裝置即同型葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)裝置即是一個很好的例證。由于其轉(zhuǎn)運(yùn)為非耗能性過程，故不能逆濃度差運(yùn)載葡萄糖。葡萄糖的凈流量是由血漿中相對較高濃度所驅(qū)動。氨基酸跨膜方式與葡萄糖相似，但其轉(zhuǎn)運(yùn)體可以分為3種：①大分子中性氨基酸系統(tǒng)（Large Neutral Amino Acid，LNAA）或稱亮氨酸系統(tǒng)，運(yùn)送多種氨基酸，但對大分子氨基酸優(yōu)先；②丙氨酸優(yōu)先系統(tǒng)，僅僅存在于BBB的腔面；③必需氨基酸系統(tǒng)，主要轉(zhuǎn)運(yùn)精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸等。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（Glucose Transporter 1，GLUT1）、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（L-type amino Acid Transporter-1，LAT1）等特異的內(nèi)源性載體，還可以和一些具有相近結(jié)構(gòu)的小分子藥物結(jié)合，從而協(xié)助它們穿過BBB。如水溶性的天麻素能直接入腦，并迅速代謝為天麻苷元，與其化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)[12]。天麻素是由天麻苷元與一分子葡萄糖構(gòu)成，苷元部分可視為葡萄糖的取代基，因此，可能是通過腦毛細(xì)血管內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞上特異性的葡萄糖載體轉(zhuǎn)運(yùn)至腦內(nèi)。

相對分子質(zhì)量更大和（或）親水的物質(zhì)，如激素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素和脂蛋白主要利用血管內(nèi)皮細(xì)胞的管腔側(cè)高度表達(dá)的特殊受體進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，這些受體的作用是介導(dǎo)化合物經(jīng)過胞吞或跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)穿過BBB。

在腦極后區(qū)、下丘腦正中隆起、后聯(lián)合下器官、垂體后葉、松果體、脈絡(luò)叢，存在“腦的特殊區(qū)”，其特點(diǎn)為血竇多，竇外僅有嗜銀網(wǎng)狀纖維包裹，無膠質(zhì)突，毛細(xì)血管內(nèi)皮有小孔，基膜不連續(xù)并與鄰近膠質(zhì)突分開，有較大的通透性。在這些特殊區(qū)域可允許某些大分子化合物，如激素和一些毒物少量進(jìn)入，這可能具有它特殊的生物學(xué)意義。此外，離子通道和離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)可傳遞電解質(zhì)通過BBB。

2 腦內(nèi)小分子檢測技術(shù)

檢測小分子物質(zhì)是否入腦的方法有很多，主要有腦組織勻漿、腦脊液、腦部微透析液聯(lián)合HPLC、免疫組織化學(xué)技術(shù)以及放射性同位素標(biāo)記法等。為了探討中藥有效成分中樞活性的作用模式，探討其作用于中樞還是外周，必須知道其能否到達(dá)BBB，以及能否透過BBB。HPLC配合腦組織勻漿法可判斷待測物質(zhì)能否到達(dá)BBB；如果能，即待測物質(zhì)可能分布于構(gòu)成BBB的星形膠質(zhì)細(xì)胞和（或）血管內(nèi)皮細(xì)胞；而其他的檢測技術(shù)都能判斷待測物質(zhì)能否透過BBB；如果能，說明待測物質(zhì)能直接作用于神經(jīng)元。同時，免疫組織化學(xué)技術(shù)和放射性同位素標(biāo)記法還能對待測物質(zhì)進(jìn)行定位，清楚明了地顯示其具體分布于哪個細(xì)胞以及分布情況。這些檢測分析技術(shù)，可以為研究中藥有效成分的中樞作用模式提供直接明了的證據(jù)。

2.1 HPLC

HPLC為色譜法的一個重要分支，具有高壓、高速、高效、高靈敏度以及應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)，此外HPLC還具有樣品不被破壞、色譜柱可反復(fù)使用以及易回收等優(yōu)點(diǎn)。但HPLC也存在“柱外效應(yīng)”，從而柱效率降低。液相色譜和質(zhì)譜連接，即液-質(zhì)聯(lián)用（HPLC-MS）既具有液相強(qiáng)大的分離能力，又具有質(zhì)譜高靈敏度、高選擇性、高分辨率的特點(diǎn)，已經(jīng)成為研究藥物微量雜質(zhì)分析鑒定、藥物降解產(chǎn)物分析鑒定、藥代動力學(xué)、組合化學(xué)高通量篩選等最用力的分析工具之一。它主要用來分析難揮發(fā)或者熱不穩(wěn)定、中性或者極性大的化合物，適用于大多數(shù)藥物及其代謝產(chǎn)物的定性和定量研究。

2.1.1 腦組織勻漿

腦組織勻漿樣品采集過程一般為：灌注后取腦組織，生理鹽水勻漿，離心取上清，然后進(jìn)行樣品預(yù)處理，處理好的樣品通過HPLC/HPLC-MS的檢測方法檢測。

采用HPLC檢測腦組織勻漿液中的中藥有效成分，是目前比較常用的檢測方法。董小平等[13]將梔子苷給藥大鼠后，各時間段分別取腦組織勻漿，HPLC法測定腦組織樣本中梔子苷的量，發(fā)現(xiàn)冰片可提高梔子苷入腦量和入腦速度。川芎嗪微乳與其水溶液分別尾靜脈給藥，用HPLC法測定不同時間點(diǎn)小鼠血、肝、腦中的川芎嗪質(zhì)量濃度，發(fā)現(xiàn)微乳改變了川芎嗪在小鼠血漿、肝、腦中藥動學(xué)行為，提高了川芎嗪在腦、血、肝，特別是腦中的分布[14]。為了闡明苦碟子注射液中的4種黃酮類成分在血漿、心肌及腦組織的藥代動力學(xué)特征，有研究采用超高效液相色譜－三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-MS/MS）建立同時測定苦碟子注射液中4種黃酮類成分在大鼠血漿、腦組織、心肌組織中濃度的含量[15]。米佳等[16]采用HPLC測定腦組織中天麻苷元含量，測得天麻與鉤藤配伍對天麻苷元在大鼠腦組織中分布具有先抑制后促進(jìn)的影響。不過，在腦組織勻漿中測定待測成分，并不能說明待測成分可以透過BBB，它也有可能僅存在構(gòu)成BBB的星形膠質(zhì)細(xì)胞和（或）血管內(nèi)皮細(xì)胞中。此外，如果血液灌注不充分或不進(jìn)行灌注，很容易得到假陽性結(jié)果。

2.1.2 腦脊液

目前，抽取腦脊液的方法主要有經(jīng)延髓池穿刺和經(jīng)側(cè)腦室穿刺兩種[17-20]。這兩種方法相比較，經(jīng)側(cè)腦室穿刺操作較復(fù)雜，且易造成腦組織損傷和出血；而經(jīng)延髓池穿刺方法簡單、迅速，易于掌握，因此經(jīng)延髓池穿刺抽取腦脊液法在各實(shí)驗(yàn)室更為常用。抽取的腦脊液經(jīng)預(yù)處理后，采用HPLC/HPLC-MS進(jìn)行檢測分析。

HPLC-MS也是檢測腦脊液中中藥有效成分較常見的一種檢測分析手段。腦脊液中如能檢測到待測物質(zhì)，則說明該物質(zhì)能透過BBB。楊雁芳等[21]采用HPLC-MS/MS的方法，研究黃芩苷及配伍三七總皂苷在大鼠腦脊液藥代動力學(xué)變化，在給藥腦脊液中能檢測到黃芪苷，并且其在腦脊液中的代謝不受三七總皂苷影響，認(rèn)為黃芩苷能透過BBB。吳建明等[22]以大鼠口服疏肝解郁膠囊后，建立腦脊液HPLC指紋圖譜，在腦脊液中檢出5種成分。吳霜[23]建立HPLC測定法檢測天麻的4種活性成分及代謝產(chǎn)物在腦脊液中的濃度，口服給藥，發(fā)現(xiàn)其中有2種成分其原形和代謝產(chǎn)物穿透BBB能力強(qiáng)，還有2種其原形和代謝產(chǎn)物穿透能力弱。

2.1.3 微透析液

微透析技術(shù)是對活動動物特定腦區(qū)內(nèi)灌流液進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測的一種新方法。該項(xiàng)技術(shù)能在麻醉或清醒的生物體上使用，非常適合于深部組織和重要器官的活體生化研究。腦內(nèi)微透析技術(shù)有以下優(yōu)勢：①由于大分子的蛋白質(zhì)不能透過半透膜，因此得到的腦透析液樣品可以直接進(jìn)行HPLC檢測，樣品不需提純，且還可以避免酶對神經(jīng)肽的降解作用。②透析液樣品是在清醒的活體動物中獲得，還可在透析的同時觀察動物的行為。生物指標(biāo)結(jié)合行為學(xué)，可更科學(xué)的解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果。③這種技術(shù)可以節(jié)省實(shí)驗(yàn)動物，動物自身可成空白對照，且實(shí)驗(yàn)的空間準(zhǔn)確性要優(yōu)于其他技術(shù)手段。

腦內(nèi)微透析技術(shù)與HPLC-MS這種靈敏的檢測分析系統(tǒng)相結(jié)合，主要用于檢測腦內(nèi)細(xì)胞外液中許多神經(jīng)遞質(zhì)如乙酰膽堿、去甲腎上腺素等及它們的代謝產(chǎn)物、小的肽類、游離氨基酸、磷酸乙醇胺、維生素、各種離子等濃度的變化?，F(xiàn)代研究學(xué)者也將此法運(yùn)用于檢測腦內(nèi)中藥有效成分的動態(tài)濃度變化。呂允鳳[24]考察不同劑量天麻素皮下及口服給藥后，大鼠腦內(nèi)的天麻素及其代謝產(chǎn)物天麻苷元的濃度變化。采用腦內(nèi)微透析技術(shù)對大鼠進(jìn)行在體動態(tài)取樣，得到透析液以HPLC-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜方法測定天麻素含量， HPLC-二極管陣列檢測方法測定天麻苷元含量。結(jié)果顯示，無論皮下及口服給藥，天麻素濃度在不同腦區(qū)內(nèi)均較低，天麻苷元腦內(nèi)濃度則明顯高于其原型天麻素。因此，天麻素的BBB透過能力差，而其活性代謝產(chǎn)物天麻苷元卻能夠較好地進(jìn)入腦內(nèi)發(fā)揮作用。方浩[25]以微透析技術(shù)和傳統(tǒng)采樣方法研究鹽酸麻黃堿在大鼠額葉皮層細(xì)胞外液和血漿中藥動學(xué)過程，比較研究兩種方法所得主要藥動學(xué)參數(shù)之間的區(qū)別與聯(lián)系，探討靶器官藥動學(xué)研究方法。

但腦內(nèi)微透析技術(shù)在應(yīng)用中也存在不足之處：①實(shí)驗(yàn)操作較復(fù)雜，需能熟練使用微透析泵及立體定位儀，否則易造成較大的人為誤差。②透析膜的回收率測定始終是一個沒有很好解決的問題，回收率測定的不準(zhǔn)確會直接限制該項(xiàng)技術(shù)在測定腦內(nèi)物質(zhì)絕對濃度時的應(yīng)用。③微透析探頭植入的位置、透析膜面積、截留分子量、溫度、灌流速度、產(chǎn)生的損傷等都會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，同時探頭植入大腦的時候可能會阻塞針孔，而且灌流的量也不好把握。④微透析探頭的植入有可能破壞BBB，得到假陽性結(jié)果。

2.2 IHC

IHC是檢測組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中某些物質(zhì)分布及在組織或細(xì)胞中含量的定性、定量、定位研究的方法。IHC具有特異性強(qiáng)、敏感性高、定位準(zhǔn)確和定量等優(yōu)點(diǎn)。

應(yīng)用IHC這種免疫分析技術(shù)，凡是能作為抗原或半抗原的物質(zhì)都能用相應(yīng)的抗體在組織或細(xì)胞中檢測到。而采用IHC檢測小分子物質(zhì)中藥有效成分，需要提供其抗體，這就需要應(yīng)用到半抗原抗體技術(shù)。

2.2.1 半抗原抗體技術(shù)

隨著免疫分析技術(shù)的不斷發(fā)展進(jìn)步，中藥有效成分半抗原抗體技術(shù)已經(jīng)被運(yùn)用到中藥的各個現(xiàn)代化研究領(lǐng)域。合成具有良好免疫原性的抗原是建立免疫分析技術(shù)的前提和關(guān)鍵所在。大多數(shù)中藥的有效成分是小分子物質(zhì)[26，27]，如有機(jī)酸類、黃酮類、木脂素類、蒽醌類、萜類及皂苷類，這些小分子物質(zhì)一般都只有反應(yīng)原性而沒有免疫原性，因此需要偶聯(lián)載體蛋白來形成完全抗原。目前，常見的偶聯(lián)方法有以下幾種：①有機(jī)酸類利用碳二亞胺法使羧基與載體上的氨基偶聯(lián)，如綠原酸[28]、柚皮苷等[29]；②黃酮類利用混合酸酐法使酚羥基或羧基先與氯甲酸異丁酯生成混合酸酐，再與載體上的伯胺基偶聯(lián)，如橙皮苷[30]；③木脂素類和蒽醌類利用重氮法，其活潑氫可與氮化修飾的載體偶聯(lián)，如Agatharesinol[31]、大黃素等[32]；④萜類和皂苷類利用高碘酸鈉法將糖基氧化成醛基，再與載體上的氨基偶聯(lián)，如紫杉醇[33]、人參皂苷Re[34]等；⑤萜類利用半琥珀酸鹽法將羥基與琥珀酸酐反應(yīng)生成羧基，再偶聯(lián)載體上的氨基，如雷公藤內(nèi)酯醇[35]。

2.2.2 半抗原抗體技術(shù)的檢測應(yīng)用

近年來，大量的研究發(fā)現(xiàn)，半抗原抗體技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各個方面：如酶聯(lián)免疫檢測、Knockout提取物、免疫親和提取、分子育種以及細(xì)胞免疫組化等。其中，酶聯(lián)免疫檢測可用于中藥質(zhì)量控制和藥代動力學(xué)研究。與色譜法相比，半抗原抗體技術(shù)具有易操作、樣品前處理簡單、反應(yīng)速度快、費(fèi)用低以及適用于大批量樣品等優(yōu)點(diǎn)，其靈敏度ELISA可以是HPLC的20倍以上，甚至達(dá)到液質(zhì)的檢測靈敏度。其檢測結(jié)果也能與HPLC結(jié)果一致。Knockout提取物能選擇性剔除復(fù)方或有效成分混合物中的某單個成分，在研究復(fù)合物中的某單一成分在復(fù)合物中所處的地位方面有著重要作用：如Yuan等[36]發(fā)現(xiàn)西洋參漿果有降低成年糖尿病小鼠血糖水平的作用，而剔除掉漿果中的人參皂苷Re成分，則降血糖的效應(yīng)明顯變?nèi)?，說明人參皂苷Re在漿果降血糖作用中占重要地位。免疫親和提取是將半抗原抗體連接到固相載體上，再通過抗原抗體的特異性反應(yīng)吸附樣品中的半抗原，再將半抗原洗脫，通過HPLC或ELISA分析，測得復(fù)雜樣品中該種小分子半抗原的含量。這種方法可以用于比較高效的樣品前處理，或獲得高純度的中藥有效成分。如用于對食品質(zhì)量的監(jiān)控：林維宣[43]以單克隆免疫親和柱-HPLC測定醬油中伏馬毒素B1、B2，以免疫親和柱凈化樣品。用于免疫組化，則是將半抗原抗體作為一抗，因其抗原抗體的特異性結(jié)合，形成的免疫復(fù)合物，再與標(biāo)記的二抗結(jié)合，可直觀的檢測到待測物質(zhì)的分布，可為中藥有效成分的作用靶點(diǎn)提供依據(jù)[37]。

2.3 放射性同位素標(biāo)記法

同位素標(biāo)記法是以放射影像學(xué)方法來證實(shí)其是否透過BBB或其在腦內(nèi)的分布。因存在放射污染，目前該項(xiàng)檢測技術(shù)已不被眾多實(shí)驗(yàn)室考慮。但這項(xiàng)技術(shù)憑借其特有的追蹤顯影的優(yōu)勢，依然被應(yīng)用于各個領(lǐng)域。

Rokka等[38]合成了一種（18）F-標(biāo)記的姜黃素衍生物，并通過電子發(fā)射斷層掃描（PET）轉(zhuǎn)基因APP23小鼠模型的β-amyloid斑塊，發(fā)現(xiàn)斑塊在血液中清除的較快，得出姜黃素對于阿爾茲海默病（Alzheimer Disease，AD）有治療效果。2型大麻素受體（Type 2 Cannabinoid Receptors，CB2）在神經(jīng)炎癥和神經(jīng)退行性疾病中起著重要的作用，Mu等[39]為了證明大麻素對阿爾茨海默病是一種非常有前途的治療方法，通過合成的放射性標(biāo)記的CB2大鼠和小鼠脾片和腦片進(jìn)行體外放射自顯影，觀察腦片和脾片動態(tài)正電子發(fā)射斷層掃描，發(fā)現(xiàn)與CB2受體激動劑的結(jié)合性較高，說明這種方法可以用來研究大麻素是否可以穿越BBB。

綜上所述，許多中藥有效成分在中樞神經(jīng)系統(tǒng)方面存在多種已知藥效，然而關(guān)于其在腦內(nèi)的具體作用部位方面尚無任何報導(dǎo)。采用HPLC配合腦組織勻漿法能初步判斷中藥有效成分能否到達(dá)BBB，HPLC配合腦脊液、透析液法以及IHC和放射性同位素標(biāo)記法可以判斷中藥有效成分是否透過BBB，并且IHC和放射性同位素標(biāo)記法還能直觀顯示藥物具體到達(dá)哪個細(xì)胞以及分布量的多少。以上檢測手段各有優(yōu)劣，在研究中藥有效成分的中樞作用模式方面亦各具千秋，這些技術(shù)手段為研究中藥在腦內(nèi)的作用靶點(diǎn)提供新的研究路徑，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物的研發(fā)提供新的思路。

3 人參皂苷入腦的研究

人參是祖國傳統(tǒng)名貴中藥之一，人參皂苷為人參的主要有效成分。已有大量的現(xiàn)代研究證明，人參皂苷在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面有著很明確的療效，并因其毒副作用小以及西藥難以匹及的保健預(yù)防效果而成為臨床研究熱點(diǎn)。因此，關(guān)于人參皂苷作用機(jī)制的研究也日漸熱門，人參皂苷可通過抗氧化、抗凋亡、調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)、調(diào)節(jié)腦內(nèi)興奮性氨基酸含量等多種機(jī)制達(dá)到保護(hù)神經(jīng)元的作用。人參皂苷的中樞活性可能有以下3種作用模式：①人參皂苷能透過BBB直接作用于神經(jīng)元；②人參皂苷不能透過BBB，但是能到達(dá)BBB，通過構(gòu)成BBB的內(nèi)皮細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞間接作用發(fā)揮其中樞活性；③人參皂苷不能透過BBB，也不能達(dá)到BBB，通過外周間接發(fā)揮其中樞活性。目前，有研究報道稱發(fā)現(xiàn)人參皂苷能到達(dá)BBB，這掀起了一股探討人參皂苷能否透過BBB的研究熱潮。大多數(shù)研究趨向于人參皂苷不能透過BBB這個觀點(diǎn)，但也有少量研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷能透過BBB。因此，關(guān)于人參皂苷是否入腦及人參皂苷的具體作用部位的研究已經(jīng)亟待開展。本實(shí)驗(yàn)室即以多種檢測分析方法，來探討人參的有效成分人參皂苷能否入腦并進(jìn)一步研究其在小鼠腦組織中的分布，旨在明確人參皂苷作用于腦的具體部位，為中藥有效成分的作用靶點(diǎn)研究提供研究方向，為指導(dǎo)臨床用藥提供依據(jù)。

3.1 人參皂苷能否到達(dá)BBB

當(dāng)前，已有研究在腦組織勻漿中檢測到了人參皂苷。陳新梅[40]在勻漿液樣品中分別加入不同濃度的人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成高、中、低3個質(zhì)量濃度的生物樣品，然后按生物樣品的處理方法進(jìn)行處理后，利用HPLC測定其回收率和精密度，能在腦組織中測得人參皂苷Rg1。郝成欣[41]通過靜脈注射人參皂苷Rb1，腦組織勻漿樣品采用HPLC檢測，測得人參皂苷Rb1在腦組織中5 min可達(dá)高峰，之后含量明顯下降，30 min后不能再檢測到。陳鋼等[42]采用HPLC測定人參皂苷Rb1、Rg1和三七皂苷R1在腦脊液和腦組織中的濃度，通過測定其回收率和精密度，得到其藥代動力學(xué)參數(shù)，并在腦組織中檢測出這3種物質(zhì)。張穎等[43]灌胃給藥，發(fā)現(xiàn)人參皂苷在塞絡(luò)通作用下，能迅速吸收進(jìn)入腦組織內(nèi)。采用HPLC-MS的檢測方法，測得人參皂苷單體Rg1、Re、Rb1、Rc在腦組織中含量較高。然而，這些文獻(xiàn)研究中，腦組織均未灌注清洗或僅以PBS洗去表面浮血，腦組織勻漿液中可能含有血液而導(dǎo)致假陽性結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)室采用了HPLC-MS以及免疫熒光雙染技術(shù)來探討這個問題：HPLC-MS檢測腦組織勻漿中的人參皂苷，并在獲得腦組織勻漿樣品過程中，特別以PBS心臟灌注清洗腦組織中的血液，排除樣品中含有血液帶來的假陽性結(jié)果，結(jié)果測得樣品中含有人參皂苷Rg1。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持人參皂苷能到達(dá)BBB；同時本實(shí)驗(yàn)室還采用半抗原抗體技術(shù)，將制得的人參皂苷抗體與膠質(zhì)纖維酸性蛋白（Collagen Fibre Acidic Protein，GFAP）和von Willebrand因子（vWF）抗體兩兩聯(lián)用，通過免疫熒光雙染法在構(gòu)成BBB的星形膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了人參皂苷。因此，本實(shí)驗(yàn)室通過實(shí)驗(yàn)認(rèn)為人參皂苷能到達(dá)BBB[44]。

3.2 人參皂苷能否透過BBB

關(guān)于人參皂苷能否透過BBB，大部分學(xué)者認(rèn)為人參皂苷不能透過BBB：如Wang等[45]發(fā)現(xiàn)無論體內(nèi)還是體外實(shí)驗(yàn)，人參皂苷Rg1能透過BBB的能力都很弱。吳雪[46]發(fā)現(xiàn)芳香開竅藥可助羥基紅花黃色素A、葛根素、川芎嗪入腦，但并不能引人參皂苷Rg1入腦。但也有研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷在通絡(luò)藥的作用下能透過BBB，甚至在無任何輔助藥物時也能透過BBB。張穎等[43]發(fā)現(xiàn)，塞絡(luò)通能促進(jìn)人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc迅速入腦，尤其是Rg1和Re。李磊等[47]尾靜脈給藥大鼠，采用HPLC-MS測定方法，能在腦脊液中檢測到人參皂苷Rg1，并發(fā)現(xiàn)解毒通絡(luò)方并不影響其在腦脊液中的代謝。Xue等[48]收集大鼠大腦額葉中區(qū)、海馬區(qū)以及側(cè)腦室微透析液，采用HPLCMS來研究人參皂苷Rg1在腦內(nèi)的藥代動力學(xué)，發(fā)現(xiàn)Rg1能透過BBB。

本實(shí)驗(yàn)室也采用了HPLC-MS以及免疫熒光雙染技術(shù)來探討這個問題：以HPLC-MS的檢測方法，并沒有在腦脊液中檢測到人參皂苷，這個實(shí)驗(yàn)結(jié)果似乎支持人參皂苷不能透過BBB；而在免疫熒光雙染實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)神經(jīng)元內(nèi)沒有人參皂苷，但還是有一些神經(jīng)元上有人參皂苷陽性顯示，說明有人參皂苷能透過BBB作用于少數(shù)神經(jīng)元。至于腦脊液中沒有檢測到人參皂苷，原因可能和進(jìn)入神經(jīng)元的人參皂苷極性小或者含量低有關(guān)，因而在腦脊液中不能被HPLC-MS檢測到，卻能用免疫組織化學(xué)的方法捕捉到。

本實(shí)驗(yàn)室采用IHC的檢測方法來測定人參皂苷在腦組織中的具體分布，這種免疫分析技術(shù)相較而言特異性強(qiáng)、靈敏度高、定位準(zhǔn)確，能直觀明了地顯示人參皂苷的分布。但也不能排除假陽性的可能，人參皂苷在神經(jīng)元中的陽性顯色也可能僅僅是背景著色。為了使實(shí)驗(yàn)更具說服力，在未來的研究中，還需要采取更多的技術(shù)手段來佐證這個結(jié)論。如采用靈敏度更高的同位素標(biāo)記法來追蹤腦組織中人參皂苷單體或代謝產(chǎn)物等。因此，如何使實(shí)驗(yàn)結(jié)論更完善，并明確透過BBB的人參皂苷或代謝產(chǎn)物具體有哪些，這將是研究學(xué)者們下一步的研究任務(wù)。

4 小結(jié)

綜上所述，小分子成分可通過被動擴(kuò)散和主動轉(zhuǎn)運(yùn)，克服BBB的“物理屏障”和“代謝屏障”進(jìn)入腦組織，分布于內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元等內(nèi)。HPLC配合腦組織勻漿、腦脊液、透析液以及IHC和放射性同位素標(biāo)記法可以用于小分子藥物入腦的研究，并得出它們在腦組織內(nèi)的分布以及判斷是否能透過血腦屏障?；谏鲜黾夹g(shù)，結(jié)合我們和其他研究人員的發(fā)現(xiàn)，目前基本可以得出人參皂苷可以到達(dá)BBB，通過作用于微血管內(nèi)皮細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞間接發(fā)揮中樞活性。至于是否能透過BBB到達(dá)神經(jīng)元，大部分的研究結(jié)果都不支持。不過，我們采用IHC技術(shù)發(fā)現(xiàn)在少量神經(jīng)元里有人參皂苷存在，該發(fā)現(xiàn)雖有所突破，但未來依然需要更多的證據(jù)來支持該結(jié)果。

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Studies on Detection Technology of Small Molecular Substance in Brain and Distribution of ginsenosides in Brain Tissues

Ouyang Liufeng1, Zhu Kexuan2, Shao Xiao2, Zhang Qiang2, Zhao Yunan2
(1. Laboratory of Pathological Sciences, Medical College, Yan'an University, Yan'an 716000, China; 2. Research Center, Basic Medical College, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210046, China)

A lot of traditional Chinese medicine presented favorable efficacy on central nervous system disease. However， its functioning mode of central activity has not been clarified. This study briefly introduced the physiological compositions of blood brain barrier (BBB) and the pathways as drugs penetrated BBB， and three main techniques of the detections of small molecules in the brain tissues， involving high performance liquid chromatography (HPLC)， immunohistochemistry (IHC) and radioactive isotope labeling. These technologies was beneficial to detecting small molecules in the brain tissues and determining their penetration rate through BBB， in order to elucidate their functioning mode of central activities. Both domestic and foreign researchers have implemented volumes of studies on the detection of ginsenosides in the brain tissues， from which can be concluded that ginsenosides performed central activities as they reached BBB and targeted on microvascular endothelial cells or astrocytes. However， whether ginsenosides penetrated BBB and acted on neurons need verifying.

Ginsenoside， blood brain barrier， high performance liquid chromatography， immunohistochemistry，radioactive isotope labeling

10.11842/wst.2016.09.022

R966

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-09-19

修回日期：2016-09-20

＊ 國家自然科學(xué)基金委青年基金項(xiàng)目（81303246）：腦局部糖原代謝在人參總皂苷抗應(yīng)激致海馬結(jié)構(gòu)可塑性損傷中的作用研究，負(fù)責(zé)人：趙玉男；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目（中西醫(yī)結(jié)合），負(fù)責(zé)人：黃熙。

＊＊ 通訊作者：趙玉男，副教授，主要研究方向：中藥藥理學(xué)。