祁偉仲，李奇，林荔軍，王宇召，陸遙

(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院，廣州 510280)

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強直性脊柱炎患者髖關(guān)節(jié)滑膜組織中骨硬化蛋白、β-鏈蛋白表達(dá)觀察

祁偉仲，李奇，林荔軍，王宇召，陸遙

(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院，廣州 510280)

目的觀察強直性脊柱炎(AS)患者髖關(guān)節(jié)滑膜組織中骨硬化蛋白(SOST)、β-鏈蛋白(β-catenin)表達(dá)變化，并探討其意義。方法AS患者15例(觀察組)，創(chuàng)傷性骨折患者18例(對照組)，分別采別用免疫組化法和Western blotting法檢測兩組髖關(guān)節(jié)滑膜組織中SOST、β-catenin。結(jié)果觀察組SOST、β-catenin的IOD值分別為36.433±17.281、83.077±37.988，對照組分別為7.417±3.843、16.099±6.862，兩組比較，P均<0.05；觀察組SOST、β-catenin相對表達(dá)量分別為14.608±1.945、6.226±1.015，對照組分別為0.910±0.030、0.960±0.050，兩組比較，P均<0.05。結(jié)論AS患者髖關(guān)節(jié)滑膜組織中SOST、β-catenin表達(dá)升高。

強直性脊柱炎；骨硬化蛋白；β-鏈蛋白；外周關(guān)節(jié)骨化

強直性脊柱炎(AS)是一種骨骼及軟組織慢性進(jìn)行性風(fēng)濕性疾病，炎癥不僅累及中軸關(guān)節(jié)，而且對全身多處關(guān)節(jié)均造成慢性炎癥損傷，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)纖維化及骨性強直。β-鏈蛋白(β-catenin)是Wnt信號通路中的一個重要組成部分，它被Wnt蛋白激活后再參與下游基因的轉(zhuǎn)錄，骨硬化蛋白(SOST)是Wnt/β-catenin信號通路的抑制劑，SOST和β-catenin的變化在骨形成的平衡調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。本研究觀察了AS患者髖關(guān)節(jié)滑膜組織中SOST、β-catenin的表達(dá)變化，以探討AS外周關(guān)節(jié)異位骨化的機制，旨在尋找骨化依賴的信號通路和作用靶點。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取2011年5月～2014年5月南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院收治的AS患者15例(觀察組)，男13例，女2例；年齡(37±11)歲；診斷符合1984修訂的紐約診斷標(biāo)準(zhǔn)。另選18例創(chuàng)傷性骨折患者作對照(對照組)，男15例，女3例；年齡(52±4)歲；排除風(fēng)濕病、髖關(guān)節(jié)滑膜炎等疾病。手術(shù)留取受試對象髖關(guān)節(jié)滑膜組織。

1.2滑膜標(biāo)本制備所有標(biāo)本均經(jīng)0.9%生理鹽水清洗3～5遍，洗凈血液，分兩份處理。第一份以10%中性甲醛固定24～48 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋,做連續(xù)組織切片，厚度為4 μm,留作免疫組化檢測使用。第二份在無菌操作下，切碎放入凍存管中，轉(zhuǎn)入-196 ℃低溫液氮中保存,留作Western blotting檢測使用。

1.3滑膜組織SOST、β-catenin檢測

1.3.1免疫組化SP法標(biāo)本脫蠟和水化，抗原微波熱修復(fù)15 min，PBS沖洗。滴加5%BSA封閉30 min，滴加Ⅰ抗(50倍稀釋的SOST和β-catenin)，4 ℃過夜，PBS沖洗。滴加生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃、30 min，PBS沖洗。滴加SABC，37 ℃、30 min，PBS沖洗。使用DAB顯色試劑著色。蒸餾水洗后蘇木素復(fù)染。脫水、透明、封片、鏡檢。結(jié)果使用Nikon 550i顯微鏡攝像系統(tǒng)觀察及攝影。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：SOST、β-catenin以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核著色成棕黃色或者棕褐色為陽性。采用Image-pro plus6.0圖像處理分析系統(tǒng)對免疫組化進(jìn)行定量分析，所有切片放大倍數(shù)為400×。每張切片觀察6個視野，結(jié)果以單個視野下平均光密度(IOD)來表示。

1.3.2Western blotting法充分研磨組織至勻漿。取蛋白樣品，用BCA法對蛋白樣品進(jìn)行定量，取等量蛋白用10%SDS-PAGE進(jìn)行電泳，恒壓將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。經(jīng)5%脫脂奶粉封閉，稀釋后加入一抗，4 ℃孵育過夜，加入熒光二抗，室溫孵育2 h。α-tubulin作為內(nèi)源性參照。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：檢測兩組滑膜標(biāo)本中SOST、β-catenin灰度值，分別與對應(yīng)的α-tubulin蛋白灰度值比較，計算兩者比值。

2　結(jié)果

觀察組SOST、β-catenin的IOD值分別為36.433±17.281、83.077±37.988，對照組分別為7.417±3.843、16.099±6.862，兩組比較，P均<0.05；觀察組SOST、β-catenin的相對表達(dá)量分別為14.608±1.945、6.226±1.015，對照組分別為0.910±0.030、0.960±0.050，兩組比較，P均<0.05。

3　討論

AS是一種骨骼及軟組織慢性進(jìn)行性炎癥性疾病，主要對脊柱、全身多處關(guān)節(jié)及鄰近肌腱、韌帶造成損傷。AS患者中，約有一半以上存在外周關(guān)節(jié)發(fā)病，其中髖關(guān)節(jié)受累的發(fā)生率較高[1]。AS關(guān)節(jié)發(fā)病早期即出現(xiàn)以滑膜病變?yōu)橹鞯难装Y改變[2]，接著骨侵蝕破壞，繼而新骨形成、骨贅增生，最終發(fā)展為全關(guān)節(jié)骨化強直[3,4]?；び醒装Y時，各種細(xì)胞因子誘導(dǎo)使局部滑膜組織血管化，聚集分化出多種潛能的前體干細(xì)胞，誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞向骨性細(xì)胞分化。因此，滑膜是AS關(guān)節(jié)骨硬化和骨贅形成的特殊組織部位。正確處理AS骨化影響因素對患者診斷、預(yù)后及治療皆具有重要指導(dǎo)意義[5]。

Wnt/β-catenin信號通路對骨形成的平衡調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用，激活通路后可促進(jìn)骨硬化、骨贅的形成[6，7]，故Wnt信號通路被認(rèn)為是調(diào)控AS異位成骨的關(guān)鍵途徑之一，對細(xì)胞的生長和功能具有重要調(diào)節(jié)意義[8,9]。Wnt蛋白與細(xì)胞膜上的卷曲蛋白胞外區(qū)特異性結(jié)合，此過程需與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6(LRP5/6)識別形成共受體[10]。卷曲蛋白變構(gòu)激活后，促進(jìn)β-catenin復(fù)合體解聚和抑制β-catenin單體降解，使胞內(nèi)β-catenin積聚到一定濃度后進(jìn)入胞核，后與細(xì)胞因子作用，進(jìn)行下游基因轉(zhuǎn)錄[11]。Wnt信號通路的啟動蛋白是一類具有相同半胱氮酸殘基的分泌型糖蛋白[12,13],而作為Wnt信號抑制劑的SOST可與LRP5/6受體競爭性結(jié)合[14，15]，抑制信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。在對Wnt誘導(dǎo)蛋白聚合和齊聚的研究[16]中發(fā)現(xiàn)，介導(dǎo)LRP6受體可影響或增強Wnt信號的活性[17]。以上說明SOST和Wnt信號通路聯(lián)系緊密，或可通過LRP受體影響Wnt信號通路。研究[18,19]發(fā)現(xiàn)，與正常人相比，AS患者骨硬化蛋白低水平表達(dá)與骨贅形成存在相關(guān)性，血清水平降低的患者更易發(fā)生關(guān)節(jié)強直。Klingber等[20]發(fā)現(xiàn)，AS患者血清SOST水平明顯低于健康組。研究[21]報道，血清中SOST持續(xù)低水平可能是AS患者抗炎治療的結(jié)果。因此，Wnt信號抑制劑水平或成為預(yù)測AS患者骨化能力的指標(biāo)之一[22,23]，而其抑制劑水平或成為預(yù)測AS患者骨化能力的指標(biāo)之一[24]。

本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組SOST、β-catenin表達(dá)較對照組升高。Wnt通路活化時，局部組織內(nèi)β-catenin表達(dá)量將增加，此結(jié)論與實驗結(jié)果相符合。而作為抑制劑的SOST，在局部滑膜組織中的表達(dá)卻明顯增高，此發(fā)現(xiàn)在國內(nèi)外暫未見相關(guān)報道?？紤]其增高的原因如下：①SOST通過負(fù)反饋機制抑制調(diào)節(jié)信號通路作用。在Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活的同時，其受體相關(guān)蛋白LRP5/6增多。而協(xié)受體的增多也需要相應(yīng)的抑制劑去中和。因此，當(dāng)出現(xiàn)LRP受體蛋白增加的情況，作為負(fù)性調(diào)控的抑制劑SOST出現(xiàn)反應(yīng)性增高。②不同部位所表達(dá)的蛋白效應(yīng)與濃度不同。在國內(nèi)外研究中，主要以檢測AS患者血清SOST水平，血清中的濃度與全身骨細(xì)胞釋放入血的蛋白水平有關(guān)。而我們此次實驗選擇的是關(guān)節(jié)腔內(nèi)滑膜組織。因解剖學(xué)關(guān)系，骨化關(guān)節(jié)的滑膜組織所代表的是局部成骨能力的體現(xiàn)。在成骨能力較強的組織中，作為抑制劑的SOST，其表達(dá)同樣可高于其他部位。通過免疫組化染色鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，SOST和β-catenin主要分布于滑膜組織中的成纖維細(xì)胞胞質(zhì)中。van Bezooijen等[25]認(rèn)為，SOST在人體由骨細(xì)胞特異性分泌;但最近研究[26]在骨組織及軟骨組織中也發(fā)現(xiàn)其存在。因此，SOST的產(chǎn)生來源或許是其骨化的始動靶點。有學(xué)者實驗發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞是AS韌帶骨化的發(fā)生細(xì)胞[27]，AS關(guān)節(jié)囊中成纖維細(xì)胞也處于過度增殖狀態(tài)[28]。在對AS骶髂關(guān)節(jié)炎研究中發(fā)現(xiàn)[29]，骨和軟骨的破壞與成纖維細(xì)胞的增殖情況密切相關(guān)，隨著成纖維細(xì)胞增殖程度改變，局部炎癥也由侵襲破壞逐漸轉(zhuǎn)向新骨形成[30]。以此推測，成纖維樣滑膜細(xì)胞作為AS髖關(guān)節(jié)滑膜組織骨化作用的主要發(fā)生細(xì)胞可能向成骨細(xì)胞分化。

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國家自然科學(xué)基金資助項目(81430031)。

李奇(E-mail： qili565@foxmail.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.15.033

R593.23

B

1002-266X(2016)15-0086-03

2015-11-06)