陳柳菁，李娟，孟姝

(四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院，成都610041)

乳鐵蛋白調(diào)控炎癥反應(yīng)中NF-κB表達(dá)的分子機(jī)制研究進(jìn)展

陳柳菁，李娟，孟姝

(四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院，成都610041)

乳鐵蛋白是一種天然的免疫調(diào)節(jié)蛋白，而NF-κB在細(xì)胞增殖、分化、免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)等過(guò)程中具有重要作用。乳鐵蛋白與NF-κB在結(jié)構(gòu)與功能上密切相關(guān)，其在炎癥反應(yīng)中對(duì)NF-κB具有重要的調(diào)控作用；在機(jī)體的不同疾病狀態(tài)和炎癥反應(yīng)的不同階段，不同物種的乳鐵蛋白呈現(xiàn)出不同的效應(yīng)。

乳鐵蛋白；核轉(zhuǎn)錄因子kappa B；炎癥

乳鐵蛋白是在多個(gè)種族之間具有高度同源性的多功能糖基化蛋白[1]，具有抗微生物、激活免疫細(xì)胞、抑制炎性因子、抑制嗜酸性粒細(xì)胞增殖、清除自由基、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)等功能[2, 3]。NF-κB是一種重要的快反應(yīng)核轉(zhuǎn)錄因子[4]，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用；NF-κB信號(hào)通路又是與炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)關(guān)系最為密切的信號(hào)通路，以NF-κB為節(jié)點(diǎn)，多條信號(hào)通路相互溝通交聯(lián)?；?qū)用嫔?，乳鐵蛋白DNA上具有兩個(gè)位點(diǎn)，可能通過(guò)與NF-κB基因二聚轉(zhuǎn)錄因子REL同源區(qū)(RHDs)靶點(diǎn)結(jié)合而實(shí)施對(duì)NF-κB的調(diào)控[5, 6]；分子層面上，乳鐵蛋白的碳水化合物鏈[7]和N端肽段[8]是調(diào)控NF-κB表達(dá)的重要結(jié)構(gòu)。乳鐵蛋白對(duì)炎癥反應(yīng)的干預(yù)與其對(duì)NF-κB的調(diào)控作用密不可分。本研究對(duì)炎癥反應(yīng)中乳鐵蛋白調(diào)控NF-κB表達(dá)的分子機(jī)制研究進(jìn)展綜述如下。

1 乳鐵蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上與NF-κB的聯(lián)系

1.1 乳鐵蛋白調(diào)控NF-κB有關(guān)的基因位點(diǎn) 當(dāng)G-菌侵入機(jī)體時(shí)，乳鐵蛋白通過(guò)與G-菌的脂多糖(LPS)相互作用調(diào)控NF-κB的表達(dá)。Pauciullo等[6]發(fā)現(xiàn)，山羊乳鐵蛋白啟動(dòng)子區(qū)包含了3個(gè)可能與LPS結(jié)合相關(guān)的元件，其中2個(gè)是與調(diào)控NF-κB表達(dá)有關(guān)的位點(diǎn)，即-960/-949和-852/-838。這兩個(gè)位點(diǎn)所屬區(qū)域在人、牛、豬、鼠、駱駝等物種中均具有高度保守性，說(shuō)明其在乳鐵蛋白對(duì)NF-κB基因?qū)用娴恼{(diào)節(jié)中起到了關(guān)鍵作用。Gilmore等[5]則認(rèn)為，乳鐵蛋白基因啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)的κB位點(diǎn)(50-GGGRNNYYCC-30，N為任意核苷酸)能與NF-κB基因二聚轉(zhuǎn)錄因子REL同源區(qū)(RHDs)結(jié)合，從而實(shí)施對(duì)NF-κB的調(diào)控。

1.2 乳鐵蛋白調(diào)控NF-κB相關(guān)的結(jié)構(gòu) 乳鐵蛋白是一種糖蛋白，糖基共價(jià)結(jié)合在Asn-XThr/Ser(X為任意氨基酸)的天冬酰胺殘基上，形成2～4條N-連接型碳水化合物鏈。該碳水化合物鏈經(jīng)分離、純化后可促進(jìn)鼠成纖維細(xì)胞NF-κB RelA:p50的活化；同時(shí)，在THP-1細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)中也表明，當(dāng)人乳鐵蛋白的碳水化合物鏈被水解成寡肽甚至氨基酸時(shí)是無(wú)法誘導(dǎo)NF-κB活化的[9]。上述研究表明，碳水化合物鏈在人乳鐵蛋白誘導(dǎo)NF-κB活化方面不可或缺[7]。乳鐵蛋白多肽鏈N端肽段也為乳鐵蛋白功能的發(fā)揮提供了基礎(chǔ)。Ando等[7]研究發(fā)現(xiàn)，乳鐵蛋白可以削弱THP-1細(xì)胞株中LPS誘導(dǎo)NF-κB活化的能力，與乳鐵蛋白上能與LPS結(jié)合的某一多肽段相關(guān)。Xin等[8]研究發(fā)現(xiàn)，豬乳鐵蛋白N端肽段LFP-20能抑制IKK-β的磷酸化，使IκB-α和NF-κB(p65)的磷酸化減少，從而抑制NF-κB(p65)的活化。

2 乳鐵蛋白對(duì)炎癥反應(yīng)中NF-κB表達(dá)的調(diào)控作用

靜息狀態(tài)下，NF-κB與抑制單位IκB的中心區(qū)結(jié)合，以NF-κB-IκB復(fù)合體的無(wú)活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。盡管許多因素都能活化NF-κB，但所有通路都擁有一個(gè)核心調(diào)控子，即IKK復(fù)合物。IKK復(fù)合物由2個(gè)催化亞單位(IKKα、IKKβ)及1個(gè)調(diào)控亞單位IKKγ(NF-κB的基本調(diào)節(jié)子，也稱為NEMO)組成[10]，IKKβ的活化能使IκBα磷酸化，隨后被K48(或K63)多聚泛素化和蛋白酶降解，使NF-κB脫離IκB的束縛而進(jìn)入細(xì)胞核中，與DNA結(jié)合，啟動(dòng)下游靶基因的表達(dá)，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[11]。也有報(bào)道顯示，NF-κB的活化依賴于自身第536位氨基酸Ser536的磷酸化，與IκBα無(wú)關(guān)[12]。乳鐵蛋白既參與固有免疫，又參與適應(yīng)性免疫，不僅可幫助宿主抵抗微生物入侵，也使宿主免于遭受炎癥的破壞性效應(yīng)。但是在機(jī)體不同的疾病狀態(tài)和炎癥反應(yīng)的不同階段，不同物種的乳鐵蛋白表現(xiàn)出不同的效應(yīng)，即乳鐵蛋白既有抗炎作用，又有促炎作用。乳鐵蛋白對(duì)NF-κB的調(diào)控大多數(shù)情況下表現(xiàn)為抑制，但也可表現(xiàn)為促進(jìn)。

2.1 下調(diào)NF-κB表達(dá) 研究表明，在2.5%硫酸葡聚糖鈉(DSS)誘導(dǎo)的小鼠腸炎模型中，牛乳鐵蛋白能減少NF-κB的表達(dá)，緩解小鼠炎癥表現(xiàn)[13]。van der Does等[14]研究表明，hLF1-11(由人乳鐵蛋白N端頭11個(gè)氨基酸組成)能降低單核細(xì)胞中NF-κB(p65)的表達(dá)。此外，乳鐵蛋白能減少2型糖尿病小鼠模型中LPS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6和IL-1表達(dá)[15]，其機(jī)制與競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合相關(guān)細(xì)胞因子啟動(dòng)子區(qū) NF-κB位點(diǎn)有關(guān)[16]。研究表明，在人K562和Caco-2細(xì)胞核中的ICAM-1啟動(dòng)子區(qū)域，LF作用位點(diǎn)和NF-κB作用位點(diǎn)存在一定交叉[17]。外源性乳鐵蛋白(LF)可以轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ICAM-1啟動(dòng)子上與NF-κB位點(diǎn)重疊的LF位點(diǎn)，從而抑制TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1等炎性因子的生成[18]。乳鐵蛋白下調(diào)NF-κB的作用主要通過(guò)MyD88途徑和TRAF6途徑實(shí)現(xiàn)。

2.1.1 MyD88途徑 生理情況下，TLR4被激活后，MyD88可在橋接配體TIRAP的介導(dǎo)下與TLR4結(jié)合；也能借助雙方蛋白結(jié)構(gòu)中的死亡域、激酶與IRAK4結(jié)合。IRAK4相關(guān)受體隨后使IRAK1磷酸化，磷酸化的IRAK1則能與E3泛素化連接酶TRAF6形成復(fù)合物[19]，在包含UBC13和UEV1A的E2復(fù)合物的輔助下，引起由K63介導(dǎo)的TRAF6多聚泛素化，并通過(guò)TAB2和TAB3泛素結(jié)合蛋白招募TAK1[20]。TAK1是一種IKK激酶，能磷酸化IKKβ活化鏈中關(guān)鍵性的絲氨酸，從而使IKKβ活化，隨后磷酸化，并經(jīng)歷IκBα K48基團(tuán)多聚泛素化的過(guò)程，最終導(dǎo)致IκBα降解，激活NF-κB[21]。Xin等[8]研究表明，LPS能上調(diào)豬肺泡巨噬細(xì)胞MyD88表達(dá)，而豬乳鐵蛋白活性肽段(LFP-20)則抑制MyD88表達(dá)。采用siRNA技術(shù)干擾巨噬細(xì)胞中MyD88的表達(dá)后，LFP-20則無(wú)法抑制IKK-β的磷酸化，也不能下調(diào)NF-κB的表達(dá)。因此推測(cè)LFP-20是通過(guò)下調(diào)活化的巨噬細(xì)胞中與MyD88相互作用的信號(hào)分子而影響MyD88表達(dá)，如抑制MyD88上游分子TLR4等。LFP-20能抑制豬肺泡巨噬細(xì)胞中LPS所誘導(dǎo)的TLR4表達(dá)，主要是通過(guò)削弱LFP-20對(duì)LPS的細(xì)胞外結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)的[8]，但LFP-20能否抑制LPS與TLR4的結(jié)合活性目前尚無(wú)研究證實(shí)。此外，LFP-20也能通過(guò)MyD88抑制MAPK信號(hào)通路間接實(shí)現(xiàn)對(duì)NF-κB的調(diào)節(jié)，并影響炎癥反應(yīng)中的相關(guān)細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄[22]。

2.1.2 TRAF6途徑 Toshihiro等[18]研究表明，牛乳鐵蛋白可下調(diào)LPS介導(dǎo)的NF-κB表達(dá)，其作用靶點(diǎn)不在MyD88，而在MyD88甚至IRAK1的下游；這些下游信號(hào)通過(guò)特異性結(jié)合TLR4受體的結(jié)構(gòu)域來(lái)阻斷TLR4的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并抑制IRAKI的降解；而當(dāng)選擇性抑制IKKβ時(shí)，則不能抑制IRAKI的降解。因此，IRAK1的降解需要IRAK1激酶的作用和自動(dòng)磷酸化作用，說(shuō)明牛乳鐵蛋白的調(diào)控靶點(diǎn)位于IRAK1的下游。研究表明，牛乳鐵蛋白是通過(guò)干擾TNF受體相關(guān)因子(TRAF6)的多聚泛素化來(lái)影響NF-κB活化的，且具有時(shí)間依賴性；LPS能明顯引起小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞ST2細(xì)胞株TRAF6 Lys-63相關(guān)的泛素化，而預(yù)先用牛乳鐵蛋白處理過(guò)的LPS則沒(méi)有這種作用，TRAF6-TAK1復(fù)合物的形成也受到抑制，無(wú)法使IKK激活[23]。分析原因，可能是牛乳鐵蛋白直接與ST2細(xì)胞株中的內(nèi)源性TRAF6結(jié)合，從而阻斷NF-κB的活化。但Oh等[24]研究表明，乳鐵蛋白可通過(guò)上調(diào)TRAF6而促進(jìn)NF-κB的表達(dá)；其機(jī)制可能是乳鐵蛋白通過(guò)與TRAF6的環(huán)指或鋅指區(qū)域結(jié)合，進(jìn)而招募IKK復(fù)合物，最終使NF-κB(p65)磷酸化活性增強(qiáng)。

2.2 上調(diào)NF-κB表達(dá) 雖然大多數(shù)研究顯示乳鐵蛋白具有優(yōu)良的抗炎特性，能抑制NF-κB的表達(dá)，但也有研究報(bào)道，乳鐵蛋白可上調(diào)NF-κB的表達(dá)[7]。Ando等[7]研究表明，人乳鐵蛋白在25～500 μg/mL(遠(yuǎn)低于生理濃度)時(shí)，可以不依賴于LPS或其經(jīng)典的活化因子(如TNF或IL-1)，便能激活THP-1細(xì)胞株NF-κB的表達(dá)，與前述乳鐵蛋白可下調(diào)NF-κB表達(dá)的結(jié)論不符。Ando等[7]認(rèn)為，乳鐵蛋白糖基化后與CD14形成LF-CD14復(fù)合物，一方面的確能干擾CD14-LPS復(fù)合物的形成，從而減弱LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，下調(diào)NF-κB的表達(dá)；另一方面又能通過(guò)碳水化合物鏈激活TLR4，通過(guò)MyD88依賴和非依賴途徑活化NF-κB。由MyD88介導(dǎo)的LF對(duì)NF-κB的活化過(guò)程，與生理調(diào)節(jié)過(guò)程相似；而在MyD88非依賴途徑中，LF可通過(guò)TRIF來(lái)活化NF-κB。當(dāng)TLR4激活TRIF后，TRIF可通過(guò)N端的TRAF6結(jié)合相關(guān)基序直接與TRAF6結(jié)合，其C端包含Rip同源基序，可與RIP1結(jié)合[25]。與MyD88依賴途徑類似，TRAF6可活化TAK1，RIP1可通過(guò)多聚泛素化與TRAF6、TAK1形成復(fù)合物，導(dǎo)致NF-κB的活化[26]。但實(shí)際上，在TLR4介導(dǎo)LF對(duì)NF-κB的調(diào)節(jié)過(guò)程中，是先通過(guò)MyD88依賴途徑，再通過(guò)TRIF途徑而實(shí)現(xiàn)的[7]。

關(guān)于何種情況下乳鐵蛋白上調(diào)和下調(diào)NF-κB表達(dá)的作用更為突出，可能與乳鐵蛋白的濃度有關(guān)。研究表明，低濃度牛乳鐵蛋白(0.1～1 g/L)能阻斷NF-κB活化，進(jìn)而減少IL-8分泌，顯示出抗炎效應(yīng)；而高濃度乳鐵蛋白(10 g/L)則表現(xiàn)出促炎效應(yīng)，上調(diào)NF-κB的表達(dá)[27]。有研究采用0.1、1、10 g/L的牛乳鐵蛋白分別處理豬腸上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)當(dāng)牛乳鐵蛋白濃度為0.1 g/L時(shí)，NF-κB的表達(dá)基本不變；濃度為1～10 g/L時(shí)才會(huì)導(dǎo)致NF-κB活化，且10 g/L牛乳鐵蛋白的激活速度要快于1 g/L[28, 29]。由此說(shuō)明，乳鐵蛋白上調(diào)或下調(diào)NF-κB的表達(dá)是具有濃度依賴效應(yīng)的。此外，乳鐵蛋白上調(diào)和下調(diào)NF-κB表達(dá)的作用也可能與其亞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞特性及生理狀況有關(guān)。乳鐵蛋白具有不同的亞結(jié)構(gòu)，如碳水化合物鏈[7]和N端肽段[8]，可能對(duì)NF-κB的表達(dá)具有不同的調(diào)節(jié)效應(yīng)。而不同類型的細(xì)胞，因其生物學(xué)特性和生理情況不同，對(duì)乳鐵蛋白的作用也呈現(xiàn)出不同的反應(yīng)。關(guān)于不同生理情況下何種亞結(jié)構(gòu)對(duì)NF-κB表達(dá)的調(diào)節(jié)占主導(dǎo)地位，亟待研究。

綜上所述，乳鐵蛋白和NF-κB在結(jié)構(gòu)和功能上密切相關(guān)。以NF-κB為節(jié)點(diǎn)，多種不同的信號(hào)通路相互溝通交聯(lián)，不同物種、不同濃度的乳鐵蛋白作用于不同的細(xì)胞，可通過(guò)不同的通路上調(diào)或下調(diào)NF-κB表達(dá)。關(guān)于乳鐵蛋白對(duì)NF-κB的促進(jìn)和抑制作用分別在何種情況下占主導(dǎo)地位以及深層次的調(diào)控機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。

[1] Chatterton DE, Nguyen DN, Bering SB, et al. Anti-inflammatory mechanisms of bioactive milk proteins in the intestine of newborns[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2013,45(8):1730-1747.

[2] Cooper C, Nonnecke E, Bo L, et al. The lactoferrin receptor may mediate the reduction of eosinophils in the duodenum of pigs consuming milk containing recombinant human lactoferrin[J]. Biometals, 2014,27(5):1031-1038.

[3] Valenti P, Vogel HJ. Lactoferrin, all roads lead to Rome[J]. Biometals, 2014,27(5):803-806.

[4] Muzio M, Polentarutti N, Bosisio D, et al. Toll-like receptor family and signalling pathway[J]. Biochem Soc Trans, 2000,28(5):563-566.

[5] Gilmore TD. Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives[J]. Oncogene, 2006,25(51):6680-6684.

[6] Pauciullo A, Cosenza G, Nicodemo D, et al. Molecular cloning, promoter analysis and SNP identification of Italian Nicastrese and Saanen lactoferrin gene[J]. Vet Immunol Immunopathol, 2010,134(3-4):279-283.

[7] Ando K, Hasegawa K, Shindo KI, et al. Human lactoferrin activates NF-κB through the Toll-like receptor 4 pathway while it interferes with the lipopolysaccharide-stimulated TLR4 signaling[J]. FEBS J, 2010,277(9):2051-2066.

[8] Xin Z, Song D, Wang T, et al. LFP-20, a porcine lactoferrin peptide, ameliorates LPS-induced inflammation via the MyD88/NF-κB and MyD88/MAPK signaling pathways[J]. Dev Comp Immunol, 2015,52(2):123-31.

[9] Baker EN, Baker HM. A structural framework for understanding the multifunctional character of lactoferrin[J]. Biochimie, 2009,91(1):3-10.

[10] Schmukle AC, Henning W. No one can whistle a symphony alone-how different ubiquitin linkages cooperate to orchestrate NF-κB activity[J]. J Cell Sci, 2012,125(Pt3):549-559.

[11] Shirane M, Hatakeyama SK, Nakayama K, et al. Common pathway for the ubiquitination of IkappaBalpha, IkappaBbeta, and IkappaBepsilon mediated by the F-box protein FWD1[J]. J Biol Chem, 1999,274(40):28169-28174.

[12] Doyle SL, Jefferies CA, O′neill LA. Bruton′s tyrosine kinase is involved in p65-mediated transactivation and phosphorylation of p65 on serine 536 during NFkappaB activation by lipopolysaccharide[J]. J Biol Chem, 2005,280(25):23496-23501.

[13] Spagnuolo PA, Hoffman-Goetz L. Dietary lactoferrin does not prevent dextran sulfate sodium induced murine intestinal lymphocyte death[J]. Exper Biol Med, 2008,233(9):1099-1108.

[14] van der Does AM, Bogaards SJ, Jonk L, et al. The human lactoferrin-derived peptide hLF1-11 primes monocytes for an enhanced TLR-mediated immune response[J]. Biometals, 2010,23(3):493-505.

[15] Moreno-Navarrete JM, Ortega FJ, Bassols J, et al. Decreased circulating lactoferrin in insulin resistance and altered glucose tolerance as a possible marker of neutrophil dysfunction in type 2 diabetes[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2009,94(10):4036-4044.

[16] Gong XW, Xu YJ, Yang QH, et al. Effects of soothing liver and invigorating spleen recipes on the IKKβ-NF-κB signaling pathway in kupffer cells of nonalcoholic steatohepatitis rats[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2015,2015:687-690.

[17] Sun L, Deng L, Ea CK, et al. The TRAF6 ubiquitin ligase and TAK1 kinase mediate IKK activation by BCL10 and MALT1 in T lymphocytes[J]. Mol Cell, 2004,14(3):289-301.

[18] Toshihiro I, Aki K, Mutsumi M, et al. Molecular mechanisms of the inhibitory effects of bovine lactoferrin on lipopolysaccharide-mediated osteoclastogenesis[J]. J Biol Chem, 2012,287(28):23527-23536.

[19] Carmody RJ. Nuclear factor-κB: activation and regulation during Toll-Like receptor signaling[J]. Cell Mol Immunol, 2007,4(1):31-41.

[20] Deng L, Wang C, Spencer E, et al. Activation of the IkappaB kinase complex by TRAF6 requires a dimeric ubiquitin-conjugating enzyme complex and a unique polyubiquitin chain[J]. Cell, 2000,103(2):351-361.

[21] Ruaidhri, Carmody, Youhai, et al. Nuclear Factor-kB: activation and regulation during Toll-Like receptor signaling[J]. Cell Mol Immunol, 2007,4(2):31-41.

[22] Diao Y, Xin Y, Zhou Y, et al. Extracellular polysaccharide from Bacillus sp. strain LBP32 prevents LPS-induced inflammation in RAW 264.7 macrophages by inhibiting NF-κB and MAPKs activation and ROS production[J]. Int Immunopharmacol, 2014,18(1):12-19.

[23] Inubushi T, Kawazoe A, Miyauchi M, et al. Molecular mechanisms of the inhibitory effects of bovine lactoferrin on lipopolysaccharide-mediated osteoclastogenesis[J]. J Biol Chem, 2012,287(28):23527-23536.

[24] Oh SM, Lee SH, Lee BJ, et al. A distinct role of neutrophil lactoferrin in RelA/p65 phosphorylation on Ser536 by recruiting TNF receptor-associated factors to IkappaB kinase signaling complex[J]. J Immunol, 2007,179(9):5686-5692.

[25] Akira S. TLR Signaling[J]. Curr Top Microbiol Immunol, 2006,311(5):1-16.

[26] Inomata M, Niida S, Shibata KI, et al. Regulation of Toll-like receptor signaling by NDP52-mediated selective autophagy is normally inactivated by A20[J]. Cell Mol Life Sci, 2012,69(6):963-979.

[27] Nguyen DN, Li Y, Sangild PT. Effects of bovine lactoferrin on the immature porcine intestine[J]. Br J Nutr, 2014,111(2):321-331.

[28] Nguyen DN, Li Y, Sangild PT, et al. Effects of bovine lactoferrin on the immature porcine intestine[J]. Br J Nutr, 2014,111(2):321-331.

[29] Samuli R, Lei L, N Nanda N, et al. TGF-β2induces maturation of immature human intestinal epithelial cells and inhibits inflammatory cytokine responses induced via the NF-κB pathway[J]. J Pediatr Gastroenterol Nutr, 2011,54(5):630-638.

國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201510610114)；四川省科技支撐計(jì)劃生物骨材料開(kāi)發(fā)關(guān)鍵技術(shù)研究項(xiàng)目(2014SZ0019)。

孟姝(E-mail： dreamingsue@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.48.037

R341

A

1002-266X(2016)48-0106-04

2016-06-04)