鄭茗貞　陳會　劉魯英

【摘 要】采用免疫組織化學(xué)染色法檢測138例結(jié)直腸癌、19例結(jié)腸腺瘤和11例正常結(jié)腸黏膜組織中Lgr5蛋白的表達情況，并分析結(jié)直腸癌組織中Lgr5蛋白表達與β-catenin蛋白表達的相關(guān)關(guān)系。結(jié)果，Lgr5蛋白表達在正常結(jié)腸黏膜、結(jié)腸腺瘤與結(jié)直腸癌組織中逐漸升高在，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期高的腫瘤組織中，Lgr5蛋白表達顯著升高，并與β-catenin的表達顯著相關(guān)。Lgr5的異常表達與大腸癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】結(jié)直腸癌；Lgr5；β-catenin；免疫組織化學(xué)染色

【Abstract】Our study focused on expression of Lgr5 and β-catenin in normal colorectal mucosa， adenoma and colorectal cancer. Immunohistochemistry data showed that Lgr5 expression was obviously increased in adenoma and CRC tissues. The expression of Lgr5 in CRC tissue was obviously associated with lymph node metastasis， TNM staging of CRC and β-catenin expression. Lgr5 might play a key role in the genesis and development of CRC.

【Key words】Colorectal cancer； Lgr5； β-catenin； Immunohistochemistry

結(jié)直腸癌（Colorectal carcinoma，CRC）的發(fā)病率和死亡率有逐漸升高的趨勢[1]。富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受體5（Leucine-rich

repeat containing G-protein-coupled receptor 5，Lgr5）是近年來研究發(fā)現(xiàn)的結(jié)直腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物之一，與大腸癌的發(fā)生及患者的預(yù)后密切相關(guān)[2-5]。Wnt信號通路的異常激活與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，β-連環(huán)蛋白（β-catenin）是經(jīng)典Wnt信號系統(tǒng)的核心分子。有研究發(fā)現(xiàn)[4]，Lgr5是Wnt信號通路的靶基因，本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測Lgr5、β-catenin蛋白在結(jié)直腸正常黏膜、腺瘤和癌組織中的表達，探討Lgr5在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集我院病理科2002-2007年存檔的結(jié)直腸癌根治術(shù)后標(biāo)本蠟塊138例。其中男性76例，女性62例，平均年齡62.9歲（30歲～82歲）。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療。結(jié)直腸癌分期根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）/國際抗癌聯(lián)盟（UICC）結(jié)直腸癌TNM分期系統(tǒng)，其中I期患者4例、II期50例、III期82例、IV期2例。選取2007年活檢存檔的正常結(jié)腸黏膜11例，腺瘤19例。所有標(biāo)本均經(jīng)10%的中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4μm切片備用。

1.2 試劑

Lgr5兔抗人單克隆抗體（克隆號ab75732，1：400稀釋）購自Lifespan Biosciences公司，β-catenin鼠抗人單克隆抗體（克隆號CAT-5H10，1：200稀釋）購自美國Zymed Laboratories公司，EnVision免疫染色試劑盒購自Dako公司。

1.3 方法

免疫組織化學(xué)染色采用EnVision兩步法，操作步驟按照劑盒使用說明。4μm石蠟切片經(jīng)過二甲苯脫蠟、梯度酒精水化?？乖迯?fù)后，加一抗，4℃過夜，采用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育，DAB顯色。常規(guī)設(shè)陰性對照和陽性對照。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

Lgr5蛋白定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)；β-catenin蛋白以定位于細(xì)胞核伴或不伴細(xì)胞質(zhì)染色為陽性，單純細(xì)胞膜著色定義為陰性。免疫組化結(jié)果根據(jù)染色強度和染色陽性細(xì)胞的比例進行評價。染色強度分為4個等級：0（無著色）、1（淡黃色）、2（黃色）和3（棕黃色）；陽性細(xì)胞比例分為4個等級：0（<5%）、1（6%-25%）、2（26%-50%）、3（51%-75%）和4（>76%）。最終評分結(jié)果通過染色強度評分乘以陽性細(xì)胞比例獲得，最終計分9-12分記為+++（強陽性），5-8分記為++（中等強度陽性），1-4分記為+（弱陽性），0分記為-（陰性）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理。樣本率之間比較采用χ2檢驗和Fisher，s 精確檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析進行。以P值小于0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Lgr5蛋白在大腸黏膜、腺瘤和結(jié)直腸癌組織中的表達

Lgr5在正常結(jié)腸黏膜、結(jié)腸腺瘤和癌組織中的表達率分別為9.09%（1/11）、36.84%（7/19）、58%（80/138）（表1）。Lgr5在正常結(jié)腸黏膜、結(jié)腸腺瘤和癌組織中的表達具有顯著性差異（P<0.05，圖1）。

2.2 β-catenin蛋白在大腸黏膜、腺瘤和結(jié)直腸癌組織中的表達

β-catenin在正常結(jié)腸黏膜、結(jié)腸腺瘤和癌組織中的表達率分別為27.27%（3/11）、57.89%（11/19）和75.4%（104/138），β-catenin在不同組之間表達的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.3 Lgr5在結(jié)直腸癌組織中表達的臨床意義及其與β-catenin表達的相關(guān)性

在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者癌組織中Lgr5蛋白表達顯著高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（P<0.05），Lgr5蛋白表達與結(jié)直腸癌TNM分期呈正相關(guān)（P<0.05），與患者的性別、年齡、腫瘤分化程度無顯著相關(guān)性（P>0.05）（表2）。Lgr5與β-catenin蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達呈正相關(guān)（P<0.05）（表3）。

3 討論

Lgr5全稱為富含亮氨酸重復(fù)序列G-蛋白偶聯(lián)受體5，研究證實其在多種腫瘤組織中過度表達，包括肝癌、卵巢癌、食管癌等，并被證實是小腸、結(jié)腸以及毛囊干細(xì)胞的標(biāo)志物[6]。本實驗采用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測了正常大腸黏膜、結(jié)腸腺瘤及結(jié)直腸癌組織中Lgr5蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)其陽性表達率逐漸升高，說明Lgr5蛋白表達的異常升高可能是大腸癌發(fā)生過程中的早期事件。本研究證實在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期高的腫瘤組織中，Lgr5蛋白表達顯著升高，這與郝艷萍[7]、柴寧莉等[8]的研究結(jié)果一致。

Wnt/β-catenin信號通路被稱為經(jīng)典Wnt信號通路，在早期胚胎發(fā)育、成體組織穩(wěn)態(tài)維持、干細(xì)胞自我更新調(diào)控、細(xì)胞分裂以及腫瘤發(fā)生等過程中均發(fā)揮重要作用[9]。Wnt/β-catenin信號途徑的異常激活，導(dǎo)致其下游靶基因的表達增強，從而促進細(xì)胞異常增生。本研究表明Lgr5蛋白表達與β-catenin蛋白表達顯著相關(guān)，說明結(jié)直腸癌中，Wnt信號通路的異常激活，促進了靶基因Lgr5的表達，與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果為今后研究結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的機制，發(fā)現(xiàn)分子診斷標(biāo)記物提供了新的線索。

【參考文獻】

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[7]郝艷萍，胡順明，張世棟，等.干細(xì)胞標(biāo)記物L(fēng)GR5在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的表達及意義[J].山東大學(xué)學(xué)報，2009，47（8）：85-88.

[8]柴寧莉，張文成，王艷敏，等.Lgr5 和 CD44 在腸息肉和結(jié)直腸癌中的表達及意義[J].J South Med Univ.， 2013，33（7）：972-976.

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[責(zé)任編輯：王楠]