馬金，張艷

(1.遼寧醫(yī)藥職業(yè)學院，沈陽110101;2.遼寧中醫(yī)藥大學，沈陽110032)

【實驗研究】

益氣活血復方聯(lián)合運動訓練對心衰大鼠心室自主神經(jīng)重構作用的影響研究

馬金1，張艷2

(1.遼寧醫(yī)藥職業(yè)學院，沈陽110101;2.遼寧中醫(yī)藥大學，沈陽110032)

目的:觀察益氣活血復方聯(lián)合運動訓練對心衰大鼠心室自主神經(jīng)重構作用影響，為臨床治療提供新的理論依據(jù)。方法:將70只健康雄性大鼠按隨機數(shù)字表法分為7組各10只，采用冠脈結扎，配合力竭式游泳、減食等方法復制CHF大鼠模型，分別給予藥物治療和(或)運動訓練，治療6周后處死取材，檢測NE、ACH水平，觀察各組大鼠心肌組織形態(tài)學變化、TH、ChAT表達水平。結果:與假手術組比較，模型組大鼠血漿中NE顯著升高，ACH顯著下降;與模型組比較，各治療組血漿中NE均顯著下降，ACH明顯升高。免疫組化染色可見，與模型組比較各治療組TH熒光陽性表達量均呈下降趨勢，ChAT呈上升趨勢，以中藥聯(lián)合運動組改善最為明顯。結論:益氣活血復方聯(lián)合運動訓練通過調(diào)節(jié)心衰大鼠血漿中NE、ACH及心肌組織中TH、ChAT水平，進而對心衰大鼠起到治療作用。

益氣活血;運動訓練;心衰大鼠;自主神經(jīng)重構

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是由于任何原因引起的心肌結構和功能的變化，導致心室充盈和射血障礙而引起的一組臨床綜合征［1］。因其發(fā)病機制比較復雜，目前對其病理機制研究尚不明確，部分學者研究認為心臟交感神經(jīng)功能(cardiac sympathetic nerve function，CSNF)包括交感神經(jīng)活性(sympathetic nerve activity，SNA)和/或再攝取功能(reuptake)變化均與心肌間質(zhì)重塑存在著十分密切的關系［2］。有證據(jù)表明，治療心衰有效的藥物如ACEI和地高辛均能增加代表迷走神經(jīng)活性的RR變異性。因此，合理增加迷走神經(jīng)的張力，拮抗交感神經(jīng)興奮進行過度代償所帶來的不利因素，對于糾正CHF顯得尤為重要，故尋找能雙向調(diào)節(jié)心臟自主神經(jīng)的藥物及方法成為CHF防治領域的新熱點。本研究在前期研究基礎上，自擬益氣活血復方并聯(lián)合運動訓練治療心衰大鼠，觀察其對心室自主神經(jīng)重構的作用影響。

1 材料

1.1 實驗動物

3月齡雄性健康SD大鼠(普通級)70只，體質(zhì)量200～230 g，購于遼寧中醫(yī)藥大學動物實驗中心，適應性喂養(yǎng)1周，自由飲水與攝食。

1.2 藥物

益氣活血復方由黃芪、人參、紅花、丹參、益母草、三七粉、葶藶子等組成，按照相對密度為1.05～1.08進行煎煮、濃縮成湯液。賴諾普利片每片10 mg(上海信誼萬象藥業(yè)股份提供，國藥準字H10960265)。以上所有藥物均購自于遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥劑科。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥

70只健康雄性大鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術組、心衰模型組、益氣活血中藥組、運動訓練組、益氣活血中藥聯(lián)合運動訓練組、西藥組、西藥聯(lián)合運動訓練組各10只。除假手術組外，各組動物采用冠脈結扎，配合力竭式游泳、減食等方法復制CHF大鼠模型。大鼠腹腔麻醉，經(jīng)喉氣管插管術連接小動物呼吸機，頻率50～55次/min，潮氣量0.6 ml～0.9 ml，描記正常心電圖(圖1)。行開胸手術，于左冠狀動脈前降支起源點1～5 mm處用結扎左冠狀動脈主干，心電示波器顯示ST段及T波有明顯異常改變(圖2)，縫合并處青霉素鈉敷傷口。造模4周后多普勒超聲心動圖檢測，以左室射血分數(shù)小于60%作為心衰模型成功的標志，同時大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量減輕、精神萎靡、毛色無光澤列入觀察對象。除心衰模型組、假手術組給予常規(guī)等容積生理鹽水灌胃外，其余各組于造模成功后給予藥物治療。各給藥組大鼠運動訓練于造模成功后1周進行，每次50 m in。6周超聲心動圖檢測后，麻醉后腹主動脈取血，離心、取血漿同時摘取心臟組織，4%多聚甲醛固定。

圖1 大鼠行冠脈結扎術前心電圖

圖2 大鼠行冠脈結扎術后心電圖

2.2 心肌組織形態(tài)學觀察

將心臟組織于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，按蘇木素-伊紅(HE)染色常規(guī)方法進行。70%～100%梯度酒精脫水，二甲苯透明、石蠟包埋、切片(切片厚度為5 μm)、貼片、烤片后用二甲苯脫蠟，70%～100%梯度酒精復水、蘇木精染色、70%鹽酸酒精分色、伊紅復染后，再用70%～100%梯度酒精脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片石蠟包埋，光學顯微鏡下觀察心臟組織形態(tài)變化。

2.3 檢測各組大鼠血漿中NE及Ach活性

采用高效液相法檢測各組大鼠血漿中NE及Ach活性。

2.4 檢測各組大鼠心室肌組織中TH、CHAT表達水平

采用免疫組化法結合計算機成像技術檢測各組大鼠梗死區(qū)及非梗死區(qū)的心室肌組織中酪氨酸羥化酶(TH)及膽堿乙酰化酶(CHAT)表達水平。

2.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，單因素方差分析比較各組間數(shù)據(jù)差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠心肌細胞的形態(tài)學變化

圖3顯示，HE染色后，40倍光鏡下觀察各組大鼠心肌細胞組織形態(tài)學變化。結果顯示，假手術組大鼠心肌細胞排列規(guī)整，橫紋清晰，大小、形態(tài)正常，肌纖維未見空白、斷裂及缺損區(qū);心衰模型組則見心肌細胞相互交織、核固縮并出現(xiàn)部分空白區(qū)，異染色質(zhì)呈現(xiàn)團塊狀，相鄰細胞閏盤間隙明顯增寬，粒粒連接及緊密連接消失，肌原纖維排列紊亂、斷裂及缺失;經(jīng)中藥、運動及西藥干預后，各組大鼠心肌組織細胞排列比較有序，形態(tài)結構基本一致，肌纖維排列較規(guī)整，有部分斷裂及缺損，偶有空白區(qū)等情況，但以中藥聯(lián)合運動組大鼠心肌細胞組織形態(tài)基本正常。

圖3 HE染色各組慢性心衰大鼠心肌組織形態(tài)特征

3.2 各組大鼠血漿中NE及Ach的活性變化

表1顯示，與假手術組比較，模型對照組大鼠血漿中NE顯著升高(P＜0.01)，ACH顯著下降(P＜0.01);與模型對照組比較，運動組和藥物聯(lián)合運動治療組血漿中NE均顯著下降(P＜0.01)，ACH明顯升高(P＜0.01);與運動組比較，各藥物及其聯(lián)合運動治療組血漿中NE均顯著下降(P＜0.05或P＜0.01)，ACH明顯升高(P＜0.05或P＜0.01);與中藥組比較，中藥聯(lián)合運動治療組大鼠血漿中NE明顯升高(P＜0.05)，ACH明顯下降(P＜0.05)。

表1 各組大鼠血漿中去甲腎上腺素(NE)、乙酰膽堿(ACH)含量(±s)

表1 各組大鼠血漿中去甲腎上腺素(NE)、乙酰膽堿(ACH)含量(±s)

注:與假手術組比較:*P＜0.01;與模型對照組比較:#P＜0.01;與運動組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01;與中藥組比較:pP＜0.05

組別鼠數(shù)去甲腎上腺素(pg/mL)乙酰膽堿(pg/mL)假手術組10 362.4±44.1 395.0±98.5模型對照組10 1192.0±77.7*140.4±9.1*運動組10 615.0±69.3#194.8±20.5#中藥組10 586.4±66.4#△204.9±19.8#△中藥+運動組10 502.0±86.7#△△p287.9±26.3#△△p西藥組10 578.8±52.2#△220.2±21.1#△△西藥+運動組10 553.5±57.1#△△235.2±29.9#△△

3.3 各組大鼠心肌組織中酪氨酸羥化酶(TH)、乙酰膽堿轉移酶(ChAT)表達水平

表2圖4、5顯示，免疫組化染色可見，與假手術組比較，模型對照組TH熒光陽性表達量增加(P＜0.05)，ChAT熒光陽性表達減弱(P＜0.05)。各治療組與模型組比較，TH熒光陽性表達量均呈下降趨勢(P＜0.05)，ChAT熒光陽性表達呈上升趨勢，以中藥聯(lián)合運動組改善最為明顯。

4 討論

慢性心衰(CHF)因其治療棘手，致殘及死亡率高，一直是困擾臨床醫(yī)生的重大問題。作為臨床多種心血管疾病的終末期表現(xiàn)，對于CHF病理機制的研究及有效治療方法，一直是國內(nèi)外醫(yī)學界長期探討的熱點問題之一［3］。隨著人口老齡化的進展，以及與心力衰竭相關疾病的原發(fā)病如高血壓、冠心病、高脂血癥、糖尿病等發(fā)病率的快速增加，CHF發(fā)病率呈明顯上升趨勢。在我國，冠心病已成為慢性心衰患者的主要病因(尤其是急性心肌梗死后誘發(fā)的慢性心衰)，與發(fā)達國家情況類似。CHF的患病率為2.1%，65歲以上人群患病率為7.4%，80歲以上更是高達10%，而5年生存率僅為50%［4］。預計到2030年，我國老齡人口的比例將達到30%，CHF致死和致殘的比例將會更高。CHF在我國的醫(yī)療支出很大，已成為衛(wèi)生資源及國民經(jīng)濟的沉重負擔。因此，預防和治療CHF、提高患者生活質(zhì)量已成為醫(yī)務工作者亟待解決的問題。

表2 各組大鼠心肌組織中酪氨酸羥化酶(TH)、乙酰膽堿轉移酶(ChAT)表達水平(±s)

注:與假手術組比較:*P＜0.01;與模型對照組比較:#P＜0.01;與運動組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01;與中藥組比較:pP＜0.05

組別鼠數(shù)酪氨酸羥化酶(平均光密度)乙酰膽堿轉移酶(平均光密度)假手術組5 0.154±0.033 0.289±0.011模型對照組5 0.331±0.019*0.141±0.025*運動組5 0.254±0.015#0.179±0.018#中藥組5 0.247±0.011#△0.209±0.019#△中藥+運動組5 0.200±0.015#△△p0.250±0.010#△△p西藥組5 0.226±0.012#△0.219±0.010#△西藥+運動組5 0.224±0.014#△△0.248±0.010#△△

圖4 各組模型大鼠心肌組織TH免疫組化檢測結果

心臟自主神經(jīng)(交感-迷走神經(jīng)網(wǎng)絡)對心臟正常生理功能的維持起著重要的調(diào)節(jié)作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，許多心臟疾病伴有自主神經(jīng)重構現(xiàn)象，這種神經(jīng)分布異常與心律失常發(fā)生、疾病預后都有密切關聯(lián)［5-6］。Inoue H等研究認為，心室肌迷走神經(jīng)纖維的分布受缺血損傷的影響，缺血區(qū)域迷走神經(jīng)活動減弱，交感神經(jīng)活動增強［7］。Rossil等［8］利用傳統(tǒng)的病理學及現(xiàn)代分子生物學技術證實，心肌梗塞后梗塞區(qū)周圍部分存活心肌出現(xiàn)不均勻的去迷走神經(jīng)支配。這種不均勻的去迷走神經(jīng)支配最早發(fā)生在冠狀動脈閉塞后5～2 0 m i n，伴隨著時間的延長，將會發(fā)生更完全的去迷走神經(jīng)支配。但有關心肌梗塞后所致CHF自主神經(jīng)重構的研究尚屬空白。本研究在前期研究基礎上，通過觀察益氣活血復方聯(lián)合運動訓練對心衰大鼠心室自主神經(jīng)重構作用影響，為指導臨床選擇安全、有效、價廉的康復治療方法提供理論基礎。

圖5 各組模型大鼠心肌組織ChAT免疫組化檢測結果

中醫(yī)學認為，慢性心衰的主要病機為本虛標實，“陽氣虧虛”為本，“血瘀、痰濁、水?！睘闃?。心病久延，心氣不足，運血無力，血液瘀滯;氣虛及陽，陽氣虧虛不能溫化水濕，水濕痰濁內(nèi)停，根據(jù)“虛則補之”的原則，采用益氣溫陽法恢復陽氣，調(diào)整臟腑功能。益氣活血復方由黃芪、人參、紅花、丹參、益母草、三七粉、葶藶子等組成，全方以益氣活血藥配伍為基礎，益氣藥補益心、肺、脾之氣，糾正人體臟氣虛衰;活血藥活血通脈，諸藥配伍益氣以助氣行，氣行則血行，血行瘀消水散，各盡其責，相互配伍，達到益氣活血、強心通脈之效。同時有研究認為，運動對提高CHF患者生活質(zhì)量及生存率具有重要意義。

交感神經(jīng)遞質(zhì)NE是以酪氨酸為原料，經(jīng)酪氨酸輕化酶(tyrosinehydroxylase，TH)的催化作用最終合成，應用免疫組織化學方法，以TH作為標志物，最終顯示出的心臟免疫陽性神經(jīng)纖維即為交感神經(jīng)。膽堿乙?；?CHAT)被認為是乙酰膽堿存在的特異性標記酶。Marvin等［9］認為，CHAT的活性水平完全可以代表迷走神經(jīng)分布。本研究以TH、CHAT、血漿中神經(jīng)遞NE與Ach含量為觀測指標，從形態(tài)學和神經(jīng)活性方面探討CHF大鼠自主神經(jīng)(交感神經(jīng)和迷走神經(jīng))活性、分布及密度情況，觀察CHF大鼠自主神經(jīng)再生及益氣活血復方聯(lián)合運動訓練對自主神經(jīng)重構的保護作用。

研究結果顯示，與假手術組比較，模型對照組大鼠血漿中NE顯著升高(P＜0.01)，ACH顯著下降(P＜0.01);與模型對照組比較，各治療組血漿中NE均顯著下降(P＜0.01或P＜0.05)，ACH明顯升高(P＜0.01或P＜0.05)，以中藥聯(lián)合運動組改善最為明顯。免疫組化染色可見，與假手術組比較，模型對照組TH熒光陽性表達量增加(P＜0.05)，ChAT熒光陽性表達減弱(P＜0.05)。與模型組比較，各治療組TH熒光陽性表達量均呈下降趨勢(P＜0.05)，ChAT熒光陽性表達呈上升趨勢，以中藥聯(lián)合運動組改善最為明顯。本次結果表明，心衰狀態(tài)下，大鼠心肌組織中TH水平增高，提示心臟交感神經(jīng)密度增加，血漿NE水平升高，說明交感神經(jīng)重攝取功能下降;ChAT為副交感神經(jīng)合成神經(jīng)遞質(zhì)的限速酶，可反映副交感神經(jīng)的活性，ACH和ChAT水平下降表明交感神經(jīng)密度減少，表達水平降低［10］。本研究結果表明，益氣活血復方聯(lián)合運動訓練可通過調(diào)節(jié)心衰大鼠血漿中NE、ACH水平以及心肌組織中TH、ChAT水平，調(diào)節(jié)心室自主神經(jīng)平衡，進而對心衰大鼠起到治療作用。

［1］Thorn T，Haase N，Rosamond W，et al.Heart disease and stroke statistics-2006 update:a report from tlle American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee［J］.Circulation，2006，l13(85)151-158.

［2］Lee AP，Ice R，Blessey R，et al.Long term effects of physical training on coronary patients with impaired ventricular function［J］.Circulation，1979，60(7):1519-1526.

［3］Ries C，Petrides PE.Cytokine regulation of matrix metalloproteinases activity and is regulatory dysfunction in disease［J］.Biol Chem，1995，376:345-355.

［4］張艷，楊碩，龐敏，等.益氣活血復方對慢性心衰大鼠心肌組織AngⅡ及PKC的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2008，23(11): 999-1001.

［5］Qin F，Vulapalli R S，Stevens S Yetal.Loss of cardi acsympathetic neurotransmitters in heart failure and NE infusion is associated with reduced NGF［J］.Am J Physiol Heart Circ Physio，l，2002，282:363-371.

［6］NicholasRS，winter J，BergmannWPet al.Peripheral inflammation increases the capsaicin sensitivity of dorsal root ganglion neurons in a growth factor-dependentmanner［J］.Neuroscience，1999，91:1425-1433.

［7］Inoue H，Zipes D P.Time course of denervation of efferent sympthetic and vagalnerves after occlusion of the coronary artery in the canine heart［J］.Circ Res，1988，62(6):1111-1120.

［8］Rossi L.Alterations of cardiac innervation in evolving myocardial infarction and transplanted hearts［J］.Ital Heart J，2003，4(7): 448-453.

［9］Marvin W J，Ruth K H，Roskosk L M，etal.Ontogenesis of dlolinergie innervationin the rot heart［J］.CirRes，1980，46:690-696.

［10］李曉，楊金龍，馬度芳，等.桂枝湯桂芍不同比例配伍對糖尿病模型大鼠心臟自主神經(jīng)病變的影響［J］.中國中西醫(yī)結合雜志，2015，35(6):741-745.

Effect of Supplementing Qi and activating blood circulation combined with exercise training on ventricular autonomic nerve remodeling in heart failure rats

MA Jin1，ZHANG Yan2
(1.Liaoning Vocational College of Medicine，Shenyang 110101，China; 2.University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China)

Objective: Observation of the Yiqihuoxue Compound and exercise training in heart failure rat ventricular remodeling affecting the autonomic nervous system，provide a new theoretical basis for clinical treatment．Methods: 70 healthy male rats were randomly divided into seven groups of 10．Using coronary artery ligation，with the formula Swimming exhaustive，less food and other methods to copy CHF rats model．After they were given medical treatment and (or) exercise training for 6 weeks，they were sacrificed．NE，ACH levels，morphological changes in myocardial tissue of rats，TH，ChAT expression levels in each group were observed．Results: Compared with the sham group，NE was significantly higher in rat plasma in the model group，decreased ACH was significantly; Compared with the model group，plasma NE of the treatment group were significantly decreased，ACH was significantly higher．Immunohistochemical staining showed that，compared with the model group，TH expression amount of fluorescence in each treatment group were decreased，ChAT rise，to improve joint motion，TCM group is the most obvious．Conclusion: Yiqihuoxue compound combined with adjusting the joint exercise training in heart failure．Rat plasma NE，ACH and myocardial tissue TH，ChAT levels play a therapeutic effect on rats with heart failure．

Benefiting qi for activating blood circulation;Sports training;Heart failure in rats;Autonomic nerve reconstruction

R285.5

:B

:1006-3250(2016)05-0617-04

2015-10-24