曹勇，鄭慧軍

(河南中醫(yī)學(xué)院二附院，鄭州450000)

針刺聯(lián)合醫(yī)癇丸治療顱腦外傷癲癇(風(fēng)痰上擾證)療效及對NOX2/ROS通路的影響

曹勇，鄭慧軍

(河南中醫(yī)學(xué)院二附院，鄭州450000)

目的:探討針刺聯(lián)合醫(yī)癇丸治療顱腦外傷癲癇(PTE)風(fēng)痰上擾證的療效以及NOX2/ROS通路的影響。方法:選擇顱腦外傷癲癇風(fēng)痰上擾證患者90例，按隨機數(shù)字表法分為治療組和對照組各45例;對照組采用苯巴比妥鈉肌肉注射200 mg/d，每日2次;或丙戊酸鈉片內(nèi)服，每日按體質(zhì)量15 mg/kg;癲癇發(fā)作時給予氯硝安定內(nèi)服;治療組在對照組基礎(chǔ)上采用針刺和醫(yī)癇丸(3 g/次，每日3次)，2組均治療12周。觀察2組癲癇發(fā)作持續(xù)時間和頻次;Western blot法檢測2組血清煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX2)水平;比較2組血清活性氧(ROS)、核因子-κB(NF-κB)、白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和前列腺素E2(PGE2)水平。結(jié)果:治療組治療后患者癲癇發(fā)作持續(xù)時間和癲癇發(fā)作頻次明顯少于對照組，治療組總有效率88.89%，對照組68.89%，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.27);治療組治療后患者血清NOX2和ROS水平明顯低于對照組;治療組治療后血清NF-κB、IL-1β、TNF-α和PGE2均顯著低于對照組，2組患者療程中無嚴重不良反應(yīng)。結(jié)論:在常規(guī)西藥基礎(chǔ)上，針刺聯(lián)合醫(yī)癇丸治療PTE風(fēng)痰上擾證控制癲癇發(fā)作療效明顯，抑制NOX2/ROS通路從而減緩下游炎癥反應(yīng)可能是其作用機制之一。

醫(yī)癇丸;針刺;外傷性癲癇;風(fēng)痰上擾證;氧化應(yīng)激

顱腦外傷后癲癇(posttraumatic epilepsy，PTE)是癥狀性癲癇中最常見的類型。調(diào)查顯示，超過10%的癲癇患者為PTE［1］，在顱腦原發(fā)損傷基礎(chǔ)上PTE可進一步加重患者腦組織病理損傷以及神經(jīng)細胞生化改變，惡化病情，增加傷亡風(fēng)險，對患者的生存健康構(gòu)成了嚴重影響［2］。近年來中醫(yī)藥治療PTE取得較大進展，可增強西藥治療效果，促進疾病痊愈［3］。本研究針對PTE風(fēng)痰上擾證的病機特點，采取針刺聯(lián)合醫(yī)癇丸治療，收效顯著。

醫(yī)癇丸是臨床常用抗癲癇藥物，具有祛風(fēng)化痰、定癇止搐之功。針刺是臨床治療癲癇常用療法且安全可靠，得到國內(nèi)外學(xué)者一致肯定［4］。研究表明，PTE能夠引起機體耗氧量增加，釋放大量NO，誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量炎性因子，在癲癇引起的神經(jīng)細胞損傷中發(fā)揮著重要作用［5-6］。因此，在PTE發(fā)作期抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而減少炎性因子的釋放及其誘發(fā)的炎性損傷具有重要臨床意義。本研究旨在觀察針刺聯(lián)合醫(yī)癇丸治療PTE的臨床療效以及對氧化應(yīng)激的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

表1顯示，本組研究選擇符合條件病例共90例，均為本院神經(jīng)內(nèi)科2012年10月至2014年10月收治因急性中、重度顱腦外傷引起的癲癇病例，經(jīng)中醫(yī)辨證為風(fēng)痰上擾證;所有患者按隨機數(shù)字表法分為治療組和對照組各45例，2組患者在性別、年齡、病程、格拉斯哥評分(GCS)以及發(fā)作時間上比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。

表1 2組患者一般資料比較

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 癲癇診斷標(biāo)準(zhǔn)參照國際抗癲癇聯(lián)盟關(guān)于癲癇癥和癲癇綜合征分類標(biāo)準(zhǔn)［7］制定。

1.2.2 風(fēng)痰火擾神證診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中醫(yī)內(nèi)科常見病診療指南·西醫(yī)疾病部分》［8］制定，證候:發(fā)則卒然昏仆，目睛上視，口吐白沫，手足抽搐，喉中痰鳴，移時蘇醒如常人，病發(fā)前多有眩暈，頭昏，胸悶乏力，痰多，心情不悅，舌質(zhì)淡紅，苔白膩，脈滑。

1.3 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn):符合以上病證診斷者;年齡18～65歲;有急性中、重型頭部外傷史;腦外傷之前無癲癇病史;發(fā)作時CT提示有異常腦電圖波;入選的患者或患者家屬知情并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):腦外傷引起嚴重腦部器質(zhì)性損傷者;妊娠或哺乳期婦女;對針刺治療過敏或體質(zhì)過敏者;合并心腦血管、肝腎以及造血系統(tǒng)等原發(fā)性疾病及精神病者;治療期間不配合用藥者。

1.4 治療方法

1.4.1 對照組采用注射用苯巴比妥鈉(上海新亞藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H31020532)肌肉注射200 mg/d，每日2次;或丙戊酸鈉片(湖南省湘中制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H43020874)內(nèi)服，每日按體質(zhì)量15 mg/kg;癲癇發(fā)作時給予氯硝安定(江蘇恩華賽德藥業(yè)有限責(zé)任公司，國藥準(zhǔn)字H32020591)內(nèi)服，開始時0.5 mg/次，每日3次，每3 d增加0.5 mg，直到發(fā)作被控制。

1.4.2 治療組在對照組用藥基礎(chǔ)上給予醫(yī)癇丸聯(lián)合針刺治療;醫(yī)癇丸(北京同仁堂制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字Z11020658)3 g/次，每日3次口服;針刺療法［8］采取瀉法，取穴長強、鳩尾、陽陵泉、筋縮、本神、風(fēng)池、太沖、豐隆、足三里、內(nèi)關(guān);眩暈者加合谷和百會穴，每日1次，每周5次，2組均連續(xù)治療12周。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 觀察治療前后2組癲癇發(fā)作頻次和持續(xù)時間。

1.5.2 2組血清煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX2)測定采用Western blot法于治療前后進行測定，常規(guī)收集患者血清，經(jīng)PBS稀釋，BCA法測定蛋白濃度，電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，用含一抗NOX2兔抗的5%牛奶稀釋(1∶500)4℃過夜孵育，TBST洗膜，5%牛奶稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(1∶1000)二抗處理2 h，免疫印跡化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，凝膠成像，β‐actin為實驗內(nèi)參，應(yīng)用Image J軟件進行灰度值分析，NOX2與β‐actin的灰度比值作為NOX2的表達量。

1.5.3 2組血清活性氧(ROS)、核因子-κB (NF-κB)、白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)和前列腺素E2(PGE2)水平采取酶聯(lián)免疫吸附法(Elisa)于治療前后檢測，試劑盒由上海西唐生物科技有限公司提供。具體方法為:混勻待測樣品和試劑，將標(biāo)準(zhǔn)品和待測品滴入微孔中，向待測品的微孔中滴入生物素標(biāo)記物，每微孔10μL，在加有標(biāo)準(zhǔn)品及待測品的微孔中滴入酶標(biāo)記物，每微孔50 μL混勻;37℃恒溫箱孵育1 h，棄微孔內(nèi)液體，每個微孔依次滴入50 μL底物Ⅰ和50 μL底物Ⅱ，混勻、避光處理15 min;每孔滴入50 μL終止液，酶標(biāo)儀測A450值。監(jiān)測2組療程中不良反應(yīng)發(fā)生情況。

1.6 療效評判標(biāo)準(zhǔn)

參照癲癇發(fā)作改善［9］標(biāo)準(zhǔn)和《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》中醫(yī)臨床癥狀改善標(biāo)準(zhǔn)制定。臨床痊愈:癲癇發(fā)作完全控制1年，中醫(yī)臨床癥狀、體征消失或基本消失，證候積分減少≥95%;顯效:發(fā)作頻率減少＞75%，中醫(yī)臨床癥狀、體征明顯改善，證候積分減少≥70%;有效:發(fā)作頻率減少50%～75%，中醫(yī)臨床證候、體征均有好轉(zhuǎn)，證候積分減少≥30%;無效:發(fā)作頻率減少＜50%，中醫(yī)臨床癥狀、體征無明顯改善甚或加重，證候積分減少不足30%。總有效率=基本痊愈率+顯效率+有效率。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間應(yīng)用t檢驗分析，計數(shù)資料應(yīng)用χ2檢驗處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組癲癇發(fā)作持續(xù)時間和頻次比較

表2顯示，2組患者治療后癲癇發(fā)作持續(xù)時間和癲癇發(fā)作頻次均明顯減少(P＜0.01);治療后治療組患者癲癇發(fā)作持續(xù)時間和癲癇發(fā)作頻次明顯少于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

表2 2組癲癇發(fā)持續(xù)時間和作頻次比較(±s)

表2 2組癲癇發(fā)持續(xù)時間和作頻次比較(±s)

注:與本組治療前比較:aP＜0.01;與對照組治療后比較:bP＜0.01

組別例數(shù)時間持續(xù)時間/(min/次)頻次/(次/月)對照組45治療前6.52±0.79 4.16±0.57 45治療后2.24±0.31a1.83±0.21a治療組45治療前6.94±0.88 4.33±0.51 45治療后1.39±0.17ab1.12±0.14ab

2.2 2組治療后療效比較

表3顯示，治療組總有效率88.89%，對照組68.89%，2組治療后療效比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.27，P=0.039＜0.05)。

表3 2組治療后療效比較［例(%)］

2.3 2組治療前后血清NOX2和ROS水平比較

表4顯示，2組患者治療后血清NOX2和ROS水平較治療前均顯著下降(P＜0.01);治療組患者治療后血清中NOX2和ROS水平均明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

2.4 2組血清NF-κB、IL-1β、TNF-α和PGE2水平比較

表5顯示，2組患者治療后，血清NF-κB、IL-1β、TNF-α和PGE2水平均明顯降低(P＜0.01);治療組治療后血清NF-κB、IL-1β、TNF-α和PGE2均顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

表4 2組治療前后血清NOX2和ROS水平比較(±s)

表4 2組治療前后血清NOX2和ROS水平比較(±s)

注:與治療前比較:*P＜0.01;與對照組比較:△P＜0.01

組別例數(shù)時間NOX2(灰度值比值)ROS(U/m L)對照組45治療前0.82±0.09 892.86±90.49 45治療后0.59±0.07*751.36±76.43*治療組45治療前0.85±0.11 894.17±90.84 45治療后0.34±0.05＊△586.73±59.56＊△

表5 2組血清NF-κB、IL-1β、TNF-α和PGE2水平比較(±s)

表5 2組血清NF-κB、IL-1β、TNF-α和PGE2水平比較(±s)

注:與治療前比較:*P＜0.01;與對照組比較:△P＜0.01

組別例數(shù)時間NF-κB/ng·m L－1IL-1β/pg·m L－1TNF-α/ng·L－1PGE2/ng·L－1對照組45治療前24.15±2.61 17.82±1.90 31.02±3.25 143.51±14.77 45治療后21.46±2.23*15.48±1.68*23.58±2.62*122.83±12.64*治療組45治療前24.39±2.78 17.69±1.75 30.76±3.11 141.89±14.42 45治療后19.32±12.03＊△12.35±1.46＊△17.32±1.93＊△103.46±10.37＊△

2.5 2組不良反應(yīng)情況

對照組中1例出現(xiàn)惡心、腹瀉，2例輕度頭暈、困倦，1例輕度皮疹反應(yīng);治療組中2例消化不良，1例頭暈、困倦，2例皮膚過敏。以上不良反應(yīng)經(jīng)對癥處理或停藥后癥狀均消失，所有患者治療后血常規(guī)、肝腎功能檢查均無異常。

3 討論

PTE屬于中醫(yī)學(xué)“癇證”“羊角風(fēng)”等范疇?！侗静菥V目》曰:“腦為元神之府”，其病位在肝，但與心、脾、腎等緊密相關(guān)。癲癇的證候因素研究發(fā)現(xiàn)，癲癇病實證以痰凝、風(fēng)淫、火熱和血瘀為主，虛證以氣虛、陰虛和血虛為主;臨床對癲癇辨證治療時要注意痰凝、風(fēng)淫、火熱和血瘀等因素，同時兼顧氣、陰和血的不足［10］?！夺t(yī)學(xué)綱目·癲癇》記載:“癲癇者，痰邪逆上也”，提出“治痰為主”的法則。此外，顱腦外傷性損害可直接引起腦挫裂傷、腦出血，因此在整個PTE治療過程中，活血化瘀治療是重要的環(huán)節(jié)之一［11］。

本研究中醫(yī)癇丸由生白附子、天南星、半夏、豬牙皂、僵蠶、烏梢蛇、蜈蚣、全蝎、白礬、雄黃、朱砂組成，功用祛風(fēng)化痰、定癇止搐，是臨床用于癲癇發(fā)作時治療的中成藥?！夺樉募滓医?jīng)》提出:“治之，補其不足，瀉其有余，調(diào)其虛實，以通其道，而去其邪。”因此，筆者對PTE風(fēng)痰上擾證進行針刺治療中主要以瀉法為主，方中鳩尾為任脈絡(luò)穴，可激發(fā)督脈經(jīng)氣、振奮陽氣、升清降濁，達到豁痰開竅的作用;長強為督脈起始穴，具有祛風(fēng)和調(diào)整一身陰陽之功;風(fēng)池穴是為陽維脈、陽蹺脈與手足少陽經(jīng)脈之交會穴，升發(fā)陽經(jīng)之氣，使髓海得養(yǎng)則神識漸清。研究發(fā)現(xiàn)，針刺風(fēng)池能解除頸項痙攣，消除炎癥，促進血液回流入腦［12］。風(fēng)池屬足少陽膽經(jīng)，肝與膽相表里，故能疏肝利膽，使風(fēng)陽不起而泄肝火、清利頭目［12］。筋縮是治療癲痛之要穴，主治脊強、痙攣等癥;本神為足少陽膽經(jīng)之腧穴，針刺可吸濕降濁、寧神開竅;太沖穴是肝經(jīng)原穴，能補益肝腎，旨在滋水涵木、平肝息風(fēng);足三里為胃經(jīng)下合穴，豐隆是足陽明胃經(jīng)絡(luò)穴，兩穴合用健脾化濕、祛痰化濁;內(nèi)關(guān)為手厥陰心包經(jīng)絡(luò)穴，可安神定志、鎮(zhèn)驚開竅，諸穴合用化痰開竅、平肝息風(fēng)，兼可活血化瘀。

本研究結(jié)果顯示，在西藥治療基礎(chǔ)上用針刺聯(lián)合醫(yī)癇丸治療可明顯減少癲癇發(fā)作持續(xù)時間及發(fā)作頻次。治療36周后療效分析發(fā)現(xiàn)，針刺聯(lián)合醫(yī)癇丸治療患者的總有效率88.89%，明顯優(yōu)于對照組68.89%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.27，P＜0.05)。以上結(jié)果均提示，PTE風(fēng)痰上擾證采用針刺聯(lián)合醫(yī)癇丸治療值得臨床推廣。

PTE患者顱腦損傷常致顱內(nèi)壓升高，誘發(fā)局部腦組織缺血、缺氧反應(yīng)，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，使大腦皮質(zhì)神經(jīng)元異常放電誘發(fā)癲癇發(fā)作［13］;NOX2為多個亞單位構(gòu)成的酶復(fù)合體，具有氧化活性，是機體產(chǎn)生ROS的主要途徑之一。研究顯示，機體NOX2的含量與神經(jīng)元的增殖、凋亡等聯(lián)系密切。NOX2表達異?；蜻^表達可通過刺激ROS異常升高而引起神經(jīng)細胞氧化損傷［14］。本研究結(jié)果顯示，針刺聯(lián)合醫(yī)癇丸治療后患者血清中NOX2和ROS水平均明顯降低，且低于單純西藥治療，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。提示針刺聯(lián)合醫(yī)癇丸對PTE風(fēng)痰上擾證的臨床治療效果可能與其抗氧化應(yīng)激作用相關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，機體NOX2受刺激表達升高后，其與細胞色素b558結(jié)合形成復(fù)合酶，釋放超氧陰離子，后者進入細胞內(nèi)產(chǎn)生ROS，ROS可激活NF-κB，然后通過多條信號傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)大量神經(jīng)免疫炎性因子釋放，如TNF-α、PGE2和IL-1β等［15］，這些炎性因子可加劇腦內(nèi)炎性反應(yīng)，不斷損傷神經(jīng)細胞，加重PTE發(fā)病過程［16］。為進一步驗證并探討本作用的可能機制，本研究觀察了針刺聯(lián)合醫(yī)癇丸治療對NOX2-ROS通路下游相關(guān)炎性因子的變化。結(jié)果顯示，針刺聯(lián)合醫(yī)癇丸治療患者血清NF-κB、IL-1β、TNF-α和PGE2均顯著降低且低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。以上結(jié)果均提示，針刺聯(lián)合醫(yī)癇丸治療可能通過抑制NOX2/ROS通路，從而減緩下游炎性因子反應(yīng)造成的損害達到治療效果。上述均為正向治療研究結(jié)果，對NOX2/ROS通路進行拮抗或激動，對本研究結(jié)果是否能達到預(yù)期效果，在組織學(xué)和形態(tài)學(xué)等方面結(jié)果是否一致，均有待于進一步的動物實驗證實。

綜上所述，在西醫(yī)用藥基礎(chǔ)上，針刺聯(lián)合醫(yī)癇丸治療PTE風(fēng)痰上擾證療效明顯，其作用機制可能與其降低NOX2和ROS水平，通過抑制NOX2/ROS通路從而降低氧化應(yīng)激對神經(jīng)細胞產(chǎn)生的損傷。本研究選擇病例均為本院患者，納入的病例量相對較小，對結(jié)果可能產(chǎn)生一定的偏倚，因此確切結(jié)論有待于進一步的多中心、大樣本量研究證實。

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Effect of Acupuncture Combined with Medicine in Treatment of Posttraumatic Epilepsy with Syndrome of Wind-phlegm Invading Upward on NOX2 /ROS Pathway and Efficacy Research

CAO Yong，ZHENG Hui-jun
(The Second affiliated hospital of Henan Chinese Medicine college，Henan Zhengzhou，450000，China)

Objective: To discuss effect and possible mechanism of acupuncture combined with medicine in treatment of posttraumatic epilepsy (PTE) with syndrome of wind-phlegm invading upward and influence on NOX2 /ROS pathway．Method: Ninty patients of posttraumatic epilepsy with syndrome of wind-phlegm invading upward were selected and randomly divided into treatment group and control group of 45 cases each by randomized digital table．Patients in control group were injected with phenobarbital sodium muscle injection (200 mg / d，bid) or taken valproate orally (15 mg / kg，per day) ．Clonazepam was given for oral administration when epileptic seizure．On the basis of control group，patients in treatment one received therapy of acupuncture combined with Yixian pills orally(3 g / time，tid) ．Courses of treatment for two groups were 12 weeks．Epileptic seizure frequency and time of duration were observed in two groups．Serumlevels of adenine dinucleotide phosphate oxidase(NOX2) were detected by Western blotting method．Serumlevels of reactive oxygen species(ROS) ，nuclear factor-κB(NF-κB) ，interleukin(IL) -1β，tumor necrosis factor-α(TNF-α) and prostaglandin E2 (PGE2)were compared．Results: Epileptic seizure frequency and time of duration in treatment group were significantly lower than control group after treatment respectively．The total effective rate for treatment group was 88. 89% ，better than control group with 68. 89% with significant differences(χ2= 4. 27) ．Serumlevels of NOX2 and ROS in treatment group were obviously lower than control one after treatment．Serumlevels of NF-κB，IL-1β，TNF-α and PGE2 in treatment group were obviously lower than control group after treatment．No serious adverse reaction was in both groups during treatment．Conclusion: Based on routine western medicine，acupuncture combined with medicine in treatment of PTE with syndrome of wind-phlegm invading upward brought about a striking effect on controlling epileptic attack．Inhibiting NOX2 /ROS pathway and slowing downstream inflammatory response maybe one of the mechanisms．

Yixian pills;acupuncture;posttraumatic epilepsy;syndrome of wind-phlegm invading upward;oxidative stress

R247

:B

:1006-3250(2016)05-0674-04

2015-11-09

曹勇(1975-)，男，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事神經(jīng)外科的臨床與研究。