程如梅，步葉旭

（溫州醫(yī)科大學(xué) 眼視光學(xué)院，納米生物材料研究所，浙江 溫州 325027）

?

三乙烯四胺基淀粉的合成及抗癌活性

程如梅，步葉旭

（溫州醫(yī)科大學(xué) 眼視光學(xué)院，納米生物材料研究所，浙江 溫州 325027）

[摘 要]目的：設(shè)計(jì)合成高分子基多胺抗癌藥物（三乙烯四胺基淀粉，CTS），研究其對(duì)人端粒DNA d[G3（T2AG3）3]的作用機(jī)制和細(xì)胞毒性，提供高分子靶向抗癌藥物的另一種開(kāi)發(fā)思路。方法：以三乙烯四胺為出發(fā)點(diǎn)，通過(guò)環(huán)氧氯丙烷為橋梁連接到廉價(jià)淀粉上獲得化合物CTS，通過(guò)各種光譜手段對(duì)CTS進(jìn)行表征，運(yùn)用圓二色CD光譜研究其與人端粒DNA的相互作用機(jī)制，采用CCK-8方法研究CTS對(duì)人眼脈絡(luò)膜黑色素瘤（OCM-1）細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果：CTS可以誘導(dǎo)人端粒DNA形成反平行G-四鏈體，對(duì)于OCM-1細(xì)胞具有較強(qiáng)的毒性，可以抑制其生長(zhǎng)，而CTS對(duì)正常的人視網(wǎng)膜色素上皮（ARPE-19）細(xì)胞毒性極低，表明CTS可以作為以G-四鏈體為靶點(diǎn)的癌細(xì)胞潛在的靶向藥物。結(jié)論：CTS可以促進(jìn)G-四鏈體的生成，并對(duì)OCM-1細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制性，而對(duì)正常細(xì)胞影響微小。

[關(guān)鍵詞]三乙烯四胺基淀粉；G-四鏈體；CD光譜；抗癌

端粒DNA是位于染色體末端的特殊DNA結(jié)構(gòu)，高度重復(fù)的[TTAGGG]n序列具有防止染色體末端重組、融合和降解的功能[1]。端粒酶是一類(lèi)逆轉(zhuǎn)錄核糖核蛋白酶，它能夠以自身攜帶的一段RNA為模板在染色體端粒末端合成端粒DNA并逐漸加入到染色體末端[2]，以補(bǔ)足在每次細(xì)胞分裂中丟失的端粒DNA而使染色體保持穩(wěn)定。研究[3]發(fā)現(xiàn)，約90%的惡性腫瘤細(xì)胞的端粒酶都表達(dá)較高的活性，而正常體細(xì)胞內(nèi)幾乎檢測(cè)不到，因此近年來(lái)對(duì)于端粒酶活性的抑制成為了設(shè)計(jì)新型抗腫瘤藥物的靶點(diǎn)[4-5]。人端粒DNA d[G3（T2AG3）3]序列中連續(xù)鳥(niǎo)嘌呤（GGG）通過(guò)Hoogsteen氫鍵形成的平面結(jié)構(gòu)經(jīng)表面堆積后形成端粒G-四鏈體構(gòu)型[6]，這種端粒G-四鏈體結(jié)構(gòu)的DNA能夠抑制端粒酶的活性。如果藥物分子能夠穩(wěn)定G-四鏈體結(jié)構(gòu)或誘導(dǎo)其形成，則可使端粒酶難以發(fā)揮其逆轉(zhuǎn)錄酶活性合成端粒DNA，從根本上抑制端粒酶活性和阻斷端粒DNA合成，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡或死亡。

多胺化合物能與DNA產(chǎn)生較強(qiáng)作用并具有抗癌活性[7]。研究表明癌細(xì)胞表面的負(fù)電荷比正常細(xì)胞多，多胺化合物易帶上正電荷而在癌細(xì)胞表面凝集。脂肪多胺可以調(diào)控c2m yc基因表達(dá)，穩(wěn)定G-四鏈體的形成[8]。精胺也可以促進(jìn)DNA的定性排列，調(diào)控DNA的表達(dá)[9]。然而，許多多胺化合物在抑制癌細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常細(xì)胞也產(chǎn)生嚴(yán)重的傷害，多胺化合物的抗癌活性與其結(jié)構(gòu)、代謝過(guò)程、靶向性等相關(guān)[10]。本研究將多胺化合物修飾到淀粉上，合成表征了三乙烯四胺改性淀粉衍生物（CTS，分子示意見(jiàn)圖1），通過(guò)光譜發(fā)現(xiàn)了其與G-四鏈體的作用和抑制癌細(xì)胞的作用，為高分子抗癌藥物的開(kāi)發(fā)提供了另一種思路，并揭示了多胺淀粉化合物與端粒DNA的作用機(jī)制。

1　材料和方法

1.1主要試劑 馬鈴薯淀粉、三乙烯四胺、環(huán)氧氯丙烷、高氯酸、氫氧化鈉、三羥甲基氨基甲烷T(mén)ris緩沖溶液、磷酸系PBS緩沖溶液和乙醇均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)上海試劑公司；PAGE純化d[G3（T2AG3）3]購(gòu)自上?；瞪镉邢薰?；含10%胎牛血清和50 μg/mL慶大霉素的DMEM/F12（1:1）完全培養(yǎng)液、含10%胎牛血清和50 μg/mL慶大霉素的1640細(xì)胞培養(yǎng)液均購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器 紅外光譜儀（Nicolet FT-IR NEXUS，溴化鉀壓片），熱重分析儀（STA 409 PC/4/H Luxx，氮?dú)鈿夥?，升溫速度?0 ℃/min），圓二色CD光譜（Jascol 810），自動(dòng)溫控細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Scientific Form），酶標(biāo)儀（Thermo Multiskan MK3）。

1.3實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人視網(wǎng)膜色素上皮（ARPE-19）細(xì)胞和人眼脈絡(luò)膜黑色素瘤（OCM-1）細(xì)胞購(gòu)自中科院細(xì)胞生物學(xué)研究所上海細(xì)胞庫(kù)。

1.4CTS的合成 取10 g淀粉置于三頸瓶中，置于20 mL水溶液中，攪拌均勻后加入環(huán)氧氯丙烷溶液1.0 mL，用高氯酸調(diào)節(jié)溶液pH至2，水浴40 ℃加熱，在磁力攪拌器上加熱攪拌10 h；所得的醚化淀粉在堿性水溶液環(huán)境中繼續(xù)與5 mL多胺溶液作用，將所得產(chǎn)物調(diào)至中性，過(guò)濾，分別用蒸餾水、乙醇洗滌3次，低溫烘干，保存，即得到CTS。

1.5CD光譜測(cè)試 所有測(cè)試均在pH=7.4的Tris/ HCl緩沖溶液中進(jìn)行，將d[G3（T2AG3）3]的濃度固定在5 μmol/L，測(cè)試前將CTS溶液和d[G3（T2AG3）3]溶液混合后放置6 h，再進(jìn)行CD光譜測(cè)定，測(cè)定200～320 nm范圍的光譜吸收。

1.6細(xì)胞毒性研究 ARPE-19細(xì)胞利用含10%胎牛血清、50 μg/mL慶大霉素的DMEM/F12（1:1）完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，OCM-1細(xì)胞利用含10%胎牛血清、50 μg/mL慶大霉素的1640細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，并置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)時(shí)加入不同濃度的樣品進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板，采用CCK-8方法測(cè)定細(xì)胞增殖[11]。

2　結(jié)果

2.1CTS表征 淀粉和CTS的紅外光譜示意見(jiàn)圖2，可以看出兩個(gè)物質(zhì)的紅外光譜比較接近，均在3 384 cm-1附近出現(xiàn)典型的發(fā)生氫鍵作用的多羥基O-H伸縮振動(dòng)峰，在931 cm-1附近出現(xiàn)葡萄糖環(huán)的C1-H完全振動(dòng)，證明了環(huán)的完整性。從熱分析（見(jiàn)圖3）看CTS的分解速率要低于原淀粉。

圖2　淀粉和CTS的紅外光譜

2.2CD光譜 圖4顯示了化合物CTS與人端粒DNA序列d[GGG（TTAGGG）3]作用。該DNA序列在Tris緩沖溶液中（無(wú)金屬離子存在下）于295 nm處出現(xiàn)正的最大吸收峰，同時(shí)在252 nm附近出現(xiàn)了另外一個(gè)正的強(qiáng)度吸收峰，強(qiáng)度稍弱，另外在240 nm附近產(chǎn)生負(fù)的最大吸收，這種特征為平行和反平行混合的G-四鏈體共存，表明了該DNA序列在無(wú)金屬離子存在時(shí)形成了2種混合的G-四鏈體，而且比例相當(dāng)。接著研究了不同濃度CTS對(duì)不含金屬離子人端粒DNA序列體系的影響。

圖3　淀粉和CTS的熱重分析圖

圖4　多種體系中G-四鏈體的CD光譜

由圖5可以看到，隨著CTS濃度的增大，體系在252 nm處的正的吸收逐漸減弱，當(dāng)CTS的濃度增大到DNA的5倍時(shí)，在252 nm處的吸收為0，而在260 nm處出現(xiàn)了明顯的負(fù)的吸收，濃度繼續(xù)增大，260 nm處負(fù)的吸收繼續(xù)增強(qiáng)，在CTS濃度為DNA的10倍時(shí)達(dá)到最大，而后濃度增大觀察不到明顯的變化，說(shuō)明體系達(dá)到飽和。而260 nm處的負(fù)的吸收是反平行G-四鏈體的典型特征。這表明CTS可以誘導(dǎo)反平行G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成。

2.3細(xì)胞毒性 為了進(jìn)一步研究CTS對(duì)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的作用，利用ARPE-19細(xì)胞和OCM-1細(xì)胞調(diào)查研究淀粉、醚化淀粉、CTS對(duì)不同細(xì)胞的毒性。各個(gè)樣品的濃度均為200 μg/mL。ARPE-19細(xì)胞的毒性結(jié)果見(jiàn)圖6A，相比于其他樣品，無(wú)論24 h還是48 h，淀粉在ARPE-19細(xì)胞的孵化中都表現(xiàn)出最高的存活率，CTS在ARPE-19細(xì)胞的孵化中細(xì)胞存活率仍達(dá)到80%以上，而醚化淀粉的存活率反而是最低的。我們進(jìn)一步調(diào)查了不同濃度CTS對(duì)OCM-1細(xì)胞的毒性影響。圖7結(jié)果顯示，當(dāng)CTS濃度低于100 μg/mL時(shí)，體現(xiàn)出較低的細(xì)胞毒性。當(dāng)濃度高至200 μg/mL時(shí)，分別孵化24 h和48 h后發(fā)現(xiàn)，OCM-1細(xì)胞的存活率分別低于50%和40%，隨著濃度的加大，OCM-1細(xì)胞的存活率進(jìn)一步降低。對(duì)正常細(xì)胞影響較小，CTS顯示了較高的生物相容性，而對(duì)癌細(xì)胞具有一定的靶向性，對(duì)OCM-1細(xì)胞的抑制作用比較明顯。與淀粉和醚化淀粉相比，CTS的這種抑制作用和其中的多胺基基團(tuán)密不可分。

圖5　不同濃度CTS存在下人端粒DNA序列d[GGG（TTAGGG）3]形成的G-四鏈體的CD光譜圖

3　討論

CTS和淀粉的最大區(qū)別在于CTS具有多個(gè)氨基，而淀粉沒(méi)有氨基，因此其光譜和熱行為發(fā)生了變化。從紅外光譜（見(jiàn)圖2）看出淀粉在1 656 cm-1的峰為結(jié)合水的δH2O彎曲振動(dòng)峰，而CTS在1 645 cm-1振動(dòng)峰顯得稍弱，且向低頻移動(dòng)，歸屬為δN-H和δH2O彎曲振動(dòng)峰。CTS還有一處典型的變化，就是位于1 231 cm-1處的νC-N。而熱分析（見(jiàn)圖3）表明淀粉和CTS的熱分解過(guò)程均可以分為四個(gè)過(guò)程。第一階段失重發(fā)生在50～110 ℃之間，為化合物失去結(jié)晶水的過(guò)程。第二階段失重發(fā)生在220～260 ℃區(qū)間，部分羥基發(fā)生了斷裂脫水[12]。第三階段則發(fā)生了高分子鏈的斷裂和葡萄糖單元環(huán)的剪切裂解，處于260～380 ℃之間[13]。最后發(fā)生高分子材料的碳化[14]。CTS的分解速率要低于淀粉，可能是由于氨基的加入，增加了分子鏈之間的作用，比如氫鍵增強(qiáng)了鏈的纏繞，使得分解速率下降。而最后的CTS的碳化率低于淀粉，原因仍在于引入了氨基，在高溫下容易生成氮氧化物揮發(fā)掉。多胺基的引入，增強(qiáng)了CTS與其他分子產(chǎn)生氫鍵的能力，因此我們將CTS與富含鳥(niǎo)嘌呤的端粒DNA來(lái)作用，研究形成G-四鏈體的可能性以及抑制腫瘤的特性。

A：ARPE-19細(xì)胞；B：OCM-1細(xì)胞圖6　200 μg/mL不同樣品的溶液對(duì)不同細(xì)胞毒性的結(jié)果

圖7　不同濃度的CTS化合物對(duì)OCM-1細(xì)胞的毒性

G-四鏈體是一種特殊的DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，它是在特定的條件下形成的，因此研究小分子與G-四鏈體相互作用首先需要確認(rèn)G-四鏈體結(jié)構(gòu)的存在。CD光譜被廣泛用來(lái)研究G-四鏈體的熱力學(xué)行為。CD光譜顯示該DNA序列在無(wú)金屬離子存在時(shí)形成了2種混合的G-四鏈體，平行G-四鏈體在260 nm有正的最大cotton吸收，而在240 nm有負(fù)的最大cotton吸收，而反平行G-四鏈體在295 nm有正最大的cotton吸收，260 nm有負(fù)的最大cotton吸收，這種特殊的cotton效應(yīng)使我們很容易將G-四鏈體同其他DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)相區(qū)別[15]。圖4表明當(dāng)體系中存在0.1 mol/L 的Na+時(shí)，DNA體系在295 nm處出現(xiàn)正的最大吸收，同時(shí)在265 nm處出現(xiàn)了負(fù)的最大吸收，為典型的反平行G-四鏈體的特征。在0.1 mol/L的K+存在下，體系在290 nm處出現(xiàn)正的最大吸收，235 nm有負(fù)的最大吸收，在260 nm附近出現(xiàn)一對(duì)正的肩峰，這表明G-四鏈體是以平行和反平行混合的形式存在的，比較與無(wú)金屬離子的情況，反平行的比例大一些；當(dāng)在含0.1 mol/L K+的體系中同時(shí)加入2.5 μmol/L的CTS后，體系的cotton吸收發(fā)生明顯的變化，260 nm附近的一對(duì)肩峰強(qiáng)度明顯減弱，這表明了CTS誘導(dǎo)G-四鏈體發(fā)生變化，朝著反平行的G-四鏈體方向變化，因此CTS能夠與G-四鏈體產(chǎn)生相互作用。

細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示了淀粉、醚化淀粉、CTS 對(duì)ARPE-19細(xì)胞和OCM-1細(xì)胞不同的細(xì)胞毒性結(jié)果。ARPE-19細(xì)胞在醚化淀粉中較低的細(xì)胞存活率，可能與醚化淀粉有未反應(yīng)的環(huán)氧基團(tuán)有關(guān)，經(jīng)過(guò)胺化后環(huán)氧基打開(kāi)，降低了環(huán)氧基攻擊細(xì)胞的DNA、蛋白的不良反應(yīng)。而對(duì)于腫瘤細(xì)胞，醚化淀粉由于環(huán)氧基的存在，也對(duì)腫瘤細(xì)胞造成一定的損傷，使得48 h后的存活率幾乎降低到50%。但CTS對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響更大，可以使得OCM-1細(xì)胞的存活率下降到35%，這可能是由CTS與DNA的相互作用引起。

綜上所述，我們合成得到了一種潛在的抗癌高分子藥物CTS，與淀粉和醚化淀粉相比，其主要顯現(xiàn)的官能團(tuán)為三乙烯四胺，造成了CTS對(duì)OCM-1細(xì)胞較強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制性，而對(duì)正常細(xì)胞影響不大。CTS可以誘導(dǎo)人端粒DNA形成反平行的G-四鏈體，從而預(yù)防了腫瘤細(xì)胞的快速增殖，為高分子抗癌藥物的開(kāi)發(fā)提供了另一種思路。

參考文獻(xiàn)：

[1]BOCHMAN M L,PAESCHKE K,ZAKIAN V A.DNA secondary structures:stability and function of G-quadruplex structures [J].Nat Rev Genet,2012,13(11):770-780.

[2]CHOW T T,ZHAO Y,MAK S S,et al.Early and late steps in telomere overhang processing in normal human cells:the position of the fi nal RNA primer drives telomere shortening [J].Genes Dev,2012,26(11):1167-1178.

[3]DINSHAW J P,ANH T P,VITALY K.Human telomere,oncogenic promoter and 5’-UTR G-quadruplexes:diverse higher order DNA and RNA targets for cancer therapeutics[J].Nucleic Acids Res,2007,35(22):7429-7455.

[4]LIU T,LIANG X,LI B,et al.Telomerase reverse transcriptase inhibiton stimulates cyclooxygenase 2 expression in cancer cells and synergizes with celocoxib to exert anti-cancer effects [J].Br J Cancer,2013,108(11):2272-2280.

[5]MOCELLIN S,POOLEY K A,NITT D.Telomerase and the search for the end of cancer[J].Trends Mol Med,2013,19(2):125-133.

[6]BIFFI G,TANNAHILL D,MCCAFFERTY J,et al.Quantitative visualization of DNA G-quadruplex structures in human cells [J].Nat Chem ,2013,5(3):182-186.

[7]MELCHIORRE C,BOLOGNESI M L,MINARINI A,et al.Polyamines in drug discovery:from the universal template approach to the multitarget-directed ligand design strategy[J].J Med Chem,2010,53(16):5906-5914.

[8]LIU J,GUO L,YIN F,et al.Characterization and antitumor activity of triethylene tetramine,a novel telomerase inhibitor [J].Biomed Pharmacother,2008,62(7):480-485.

[9]IGARASHI K,KASHIWAGI K.Modulation of cellular function by polyamines[J].Int J Biochem Cell Biol,2010,42(1):39-51.

[10]WONG P E,TETLEY L,DUFES C,et al.Polyamine azacyclic compounds demonstrate anti-proliferative activity in vitro but fail to control tumour growth in vivo[J].J Pharm Sci,2010,99(11):4642-4657.

[11]褚茂平,胡晨,周愛(ài)華,等.川崎病血清特異相關(guān)miR-23a對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)及遷移的影響[J].溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2015,45(5):321-326.

[12]ATHWALE V D,LELE V.Thermal studies on granular maize starch and its graft copolymers with vinyl monomers[J].Starch,2000,52(6-7):205-213.

[13]ZHANG X,GOLDING J,BURGAR I.Thermal decompositon chemistry of starch studied by 13C high resolution solidstate NMR spectroscopy[J].Polymer,2002,43(22):5791-5796.

[14]LIU X,YU L,LIU H,et al.In situ thermal decomposition of starch with constant moistrue in a sealed system[J].Polym Degrad Stability,2008,93:260-262.

[15]WILLIAMSON J R,RAGHURAMAN M K,CECH T R.Monovalent cation-induced structure of telomeric DNA:the G-quartet model[J].Cell,1989,59(5):871-880.

（本文編輯：吳昔昔）

·消 息·

Synthesis of triethylenetetramine-starch and its antitumor effects

CHENG Rumei,BU Yexu.School ofOphthalmology & Optometry,Wenzhou Medical University,Institute of Advanced Materials for Nano-Bio Applications,Wenzhou,325027

Abstract:Objective:To design and synthesize the potential antitumor drug,CTS (triethylenetetraminestarch).Its interactions with the human telomere DNA (d[G3(T2AG3)3series]) and cytotoxicity to OCM-1 tumor cells are investigated.As a consequence,it provides a new strategy to develop targeted antitumor drugs.Methods:The triethylenetetramine reacted with the epichlorohydrin crosslinked-starch (CS) to produce the CTS.It was characterized by various methods.The circular dichroism (CD) spectra were used to clarify the interaction mechanism between the CTS and human telomere DNA.Its cytotoxity to OCM-1 cells was determined by CCK-8 method.Results:The antiparallel G-quadruplex could be induced and stabilized by CTS.This may be the reason that CTS inhibited the growth of OCM-1 cells,and moreover it showed very low cytotoxicity to ARPE-19 human cells.Such observations indicated that CTS was a promising antitumor drug.Conclusion:The CTS can stabilize the G-quadruplex and has higher cytotoxicity to OCM-1 cells.It has insignifi cant effects on the growth of normal human cells.

Key words:triethylenetetramine-starch; G-quadruplex; CD spectra; antitumor

作者簡(jiǎn)介：程如梅（1978-），女，河北邯鄲人，助理研究員，博士。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（21405115）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科研項(xiàng)目（2015KYB254）；溫州市科技局科技計(jì)劃項(xiàng)目（Y20120218）；溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院項(xiàng)目（YNCX2014 08）。

收稿日期：2015-09-01

[中圖分類(lèi)號(hào)]R979.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.01.004