李玉文 董在坤 邢春偉

（唐山市漢沽管理區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河北唐山 301501）

淺談奶牛結核病診斷技術及應用進展

李玉文 董在坤 邢春偉

（唐山市漢沽管理區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河北唐山 301501）

奶牛結核病是由結核分枝桿菌引起的人畜共患傳染病，其傳播流行影響畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展和人類的健康。結核病的早期預防與陽性牛淘汰措施仍是控制疫情的主要手段。近年來，隨著細菌學檢測和血清檢測技術的不斷發(fā)展，結核病診斷方法有了很大進展，本文就結核病的診斷技術進行綜述。

奶牛結核??；診斷；檢測

近年來，由于奶產(chǎn)品消費逐步加大，隨著全國大市場、大流通的進一步形成，奶牛交易頻繁，奶牛結核病的發(fā)生呈逐步上升趨勢，嚴重影響著動物源性公共衛(wèi)生安全，極大危險著人民群眾的身體健康，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為B類動物疫病，我國將其列為二類動物疫病。奶牛結核病的診斷大體上可歸為兩類：一是臨床癥狀診斷；二是實驗室診斷，包括細菌學檢測，如涂片鏡檢、細菌培養(yǎng)、動物實驗等；免疫學檢測；分子生物學診斷技術等。傳統(tǒng)的細菌學方法由于繁瑣費時，檢出率低，靈敏度差，已不能滿足當前疫病診斷的需要。目前世界各國都在致力于研究開發(fā)奶牛結核病診斷的快速方法，并已經(jīng)建立了一些快速、準確、可靠的新型檢測技術，有些技術已經(jīng)在生產(chǎn)實踐中得到了廣泛的應用。

1 細菌學檢測

細菌學檢測的方法有涂片鏡檢、細菌培養(yǎng)等。臨床上樣品中的牛分枝桿菌可通過涂片抗酸染色、鏡檢并通過細菌培養(yǎng)做出確認。涂片抗酸染色法所需材料設備簡單，操作方法簡便，是較為普遍應用的方法。由于此方法檢出的細菌只能說明有抗酸桿菌存在，而且也不能準確的鑒定出結核分枝桿菌和非典型分枝桿菌，因此，其缺乏特異性。細菌培養(yǎng)需在37℃培養(yǎng)3～8周才可生長。菌落形態(tài)粗糙，中心隆起，周圍大而邊緣不規(guī)則，菌落顏色微白。細菌培養(yǎng)法到目前為止仍被認為是確診結核的黃金標準。但牛結核分枝桿菌生長緩慢，有10～20%的病例結核菌培養(yǎng)失敗。同時由于各種條件的影響，陽性率較難提高。

2 血清學檢測

2.1 牛型結核菌素皮內變態(tài)反應（PPD）

PPD是目前公認最有效的方法，也是被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）確定的法定的檢測方法，也是被世界各國接受和采用的方法。它主要是用提純的PPD進行牛皮內接種，于72～120h后觀察有無熱、痛、腫脹等反應，對可疑的奶牛需60d后再次復檢。該方法檢出率和準確率都比較高。PPD作為皮膚實驗最大的缺點就是容易出現(xiàn)假陽性和假陰性反應。當感染副結核分枝桿菌等環(huán)境分枝桿菌時則可能呈現(xiàn)假陽性反應，即PPD中大多數(shù)蛋白質與其他分枝桿菌和一些無關細菌的相同。對因感染其他分枝桿菌而致敏的動物沒有特異性，不能判斷病情，而且BCG疫苗中含有與PPD相同的抗原成分，因而PPD皮內變態(tài)試驗不能鑒別是免疫動物還是感染動物。在一些國家，使用比較結核菌素試驗（即比較皮內試驗），在頸部一側的不同部位，同時注射牛型PPD和禽型PPD以判斷動物對兩種PPD的不同反應，能夠提示被檢奶牛是被牛型分枝桿菌感染還是非特異的DTH反應。所以以PPD作為診斷工具的TST反應很難將結核菌顯性感染和隱形感染以及BCG免疫的個體反應分開來。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

此類方法是利用抗原抗體反應檢測針對牛結核分枝桿菌抗原的循環(huán)抗體。目前用于檢測的抗原有PPD、ESAT-6、CFP10、MPB59、MPB64、MPB70、MPB80、MPB83、Ag85、LAM（脂阿拉伯甘露聚糖）、LPS（脂多糖）等。ELISA中也可以利用免疫過氧化物酶，這種方法與傳統(tǒng)的ELISA方法相比檢測速度更快、成本更低、操作更簡便。

2.3 r-干擾素試驗

將試驗牛血樣的淋巴細胞加入特異性PPD一起孵育16-24h，由于致敏的淋巴細胞能夠釋放出r-干擾素，因此可用INF-r-ELISA進行定量測定。通過對結核桿菌和非結核分枝桿菌分子生物學的研究表明ESAT-6蛋白僅存在于結核桿菌復合體及少數(shù)致病性結核分枝桿菌中，90%以上的分枝桿菌不具有ESAT-6蛋白，因而將ESAT-6蛋白作為刺激抗原來檢測釋放到血中的INF-r水平是診斷牛結核病的較好方法。免疫學試驗證明在ESAT-6蛋白上存在著T細胞和B細胞抗原表位，能夠誘導強的細胞免疫和體液免疫應答，這極大地推動了以ESAT-6作為診斷試劑的研究價值。r-干擾素試驗優(yōu)于結核菌素試驗的一個特點就是，即使動物體內抗原很少也能被檢出，且可重復檢查。由于接種了BCG使PPD試驗很難對結核分枝桿菌的感染作出診斷，因此，迫切需要建立一個新的細胞免疫應答的檢測方法，而全血INF-r檢測方法很有可能成為替代傳統(tǒng)的結核菌素皮內試驗的結核病臨床輔助診斷方法。

2.4 淋巴細胞增生實驗

致敏的外周血淋巴細胞（PBL）在特異性抗原（如PPD、MPB70、MPB64等）刺激下，可使抗原特異性T淋巴細胞亞群發(fā)生增生反應。通過測定外周血循環(huán)中的增生淋巴細胞的比例可了解淋巴細胞增生的程度，間接反映淋巴細胞被特異性抗原致敏的情況，從而分析動物抗體對于牛分枝桿菌的細胞免疫狀態(tài)。淋巴細胞增生實驗主要是測定全血樣品對結核菌素PPD抗原的細胞反應，因其費用較高，難于大面積使用。總的來講，血清學試驗的低敏感性歸因于分枝桿菌感染引起的抗體免疫反應是細胞免疫占主導而非體液免疫。因此，血清學試驗最好是作為細胞學試驗的補充而不是替代。

3 分子生物學技術

3.1 PCR技術

聚合酶鏈式反應（PCR）對人結核和牛結核的診斷有很高的應用價值。應用PCR可檢測出250fg分枝桿菌純化DNA菌細胞的敏感度為50個菌，且整個檢測過程僅需2d，蔡宏等用基因探針原位雜交技術檢測用福爾馬林固定、石蠟包埋組織中的牛分枝桿菌，在幾天內就可獲知分析結果。該法省去了為從組織中提取結核菌而進行的組織研磨處理結核桿菌DNA提取等繁瑣步驟，敏感度為104～105個細菌/ml。

3.2 RFLP技術和Spoligotyping技術

RFLP技術和Spoligotyping技術主要用于結核病流行病學，對結核菌型的鑒定有重要意義。該方法只需少量的DNA直接利用細菌裂解產(chǎn)物進行鑒定，不需要對細菌進行培養(yǎng)來提取DNA。

4 奶牛結核病快速診斷技術

由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所研究開發(fā)2種能夠特異性鑒別奶牛結核病原的方法，能夠檢測到50pg的牛分枝桿菌的DNA，只需3h即可獲得鑒定結果。1）PCR檢測方法選擇結核分枝桿菌復合體中的特有基因esat-6基因為PCR擴增的目的基因，通過特異性和敏感性分析，建立以esat-6為目的基因的PCR檢測方法，該方法具有快速、敏感和特異的特點，其敏感性和特異性到達了國外同類產(chǎn)品的檢測水平；2）ELISA檢測方法將多種特異性較高的抗原以串連融合的形式在大腸桿菌中，實現(xiàn)了高效表達，生產(chǎn)出牛結核病診斷抗原，通過對臨床樣品的檢測結果顯示，本研究建立的ELISA方法能夠快速檢測出結核陽性病牛，具有很好的特異性和開發(fā)前景。

5 結語

牛結核病的控制和永久根除需要政府部門和廣大獸醫(yī)工作者的共同努力下才能實現(xiàn)。提高診斷技術和研究更有效的疫苗是實現(xiàn)結核病根除的有效方法。近年來隨著分子生物學技術的發(fā)展，已經(jīng)有亞單位疫苗、活載體疫苗和新型DNA疫苗的問世，為牛結核病的檢測和預防提供了一條嶄新的途徑。

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