馬玉英

（寧夏賀蘭縣農(nóng)牧漁業(yè)局動物衛(wèi)生監(jiān)督所，寧夏銀川 750001）

嚴重發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（SFTSV）總抗體檢測試劑盒（ELISA）的研制

馬玉英

（寧夏賀蘭縣農(nóng)牧漁業(yè)局動物衛(wèi)生監(jiān)督所，寧夏銀川 750001）

為建立檢測嚴重發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（SFTSV）血清總抗體的雙抗原夾心ELISA方法并進行初步試用。通過原核表達得到SFTSV-NP重組蛋白，以該蛋白作為ELISA的包被和酶標記抗原，確定抗原的最佳包被濃度和血清稀釋度，優(yōu)化各項試驗條件，在此基礎(chǔ)上研制試劑盒，并對試劑盒的重復(fù)性、特異性等方面進行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗原最適包被濃度為4.0μg/ml，血清的最佳稀釋濃度為1∶40，重復(fù)性試驗表明批內(nèi)和批間的變異性都低于10%。該試劑盒敏感性高、特異性強、重復(fù)性良好，可應(yīng)用于SFTSV的研究和臨床檢測。

嚴重發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒；抗體；酶聯(lián)免疫吸附試驗

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、血清

SFTSV毒株、陽血清均由江蘇疾病預(yù)防控制中心病原微生物研究所保存。

1.1.2 引物、原核表達載體

引物、原核表達載體pET28a-NP均由江蘇疾病預(yù)防控制中心病原微生物研究所構(gòu)建。

1.1.3 試劑及主要儀器

病毒TRNA提取試劑TRIzol、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、等購自大連寶生物工程有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）、弗氏完全、不完全佐劑購自美國Sigma公司；PCR儀：德國Biometra公司產(chǎn)品；恒溫儀、離心機：德國Eppendorf公司產(chǎn)品；DEM一Ⅱ自動酶標洗板機：北京拓普生產(chǎn)；MODEL680型酶標儀；96孔可拆式ELISA酶標板：丹麥NUNC公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 制備重組抗原

根據(jù)Trizol試劑說明書從血清中提取總RNA，通過RT-PCR技術(shù)擴增出SFTSV-NP基因，分別用限制性內(nèi)切酶BamHI、EcoRI酶切上述擴增片段與質(zhì)粒pMD18-T，回收目的基因和載體片段，進行連接反應(yīng)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)宿主菌E.coliDE3，挑取經(jīng)酶切鑒定的單個白色菌落，37℃培養(yǎng)至OD600nm為0.4～0.6時，加ITPG37℃誘導(dǎo)6h，收集菌體，純化目的蛋白，具體操作步驟參考文獻。

1.2.2 酶標記抗原

對表達純化的NP重組蛋白采用過碘酸鈉法標記辣根過氧化物（HRP），經(jīng)Supperdex200分子篩分離純化。

1.2.3 ELISA各項試驗條件的優(yōu)化

（1）酶標抗原的最佳使用濃度

將酶標抗原進行不同濃度的稀釋，各取1滴加入系統(tǒng)采用的1ml底物液中，迅速混勻后觀察顏色變化，在1～1.5min內(nèi)出現(xiàn)明顯顏色變化的二抗?jié)舛?，也就是最佳的酶標抗原使用濃度?/p>

（2）在已確定的各種條件下，選擇適合的封閉液和稀釋液

分別用5～10%脫脂奶粉、5～10%馬血清、1%白明膠、1% BSA作封閉液；用1～5%脫脂乳、3～5%馬血清、0.1%白明膠、0.1%BSA作稀釋液，測450nm的OD值，選本底低、P/N值大、OD值最高者為最適。

（3）各個步驟作用時間的選擇（選擇本地值低、P/N比值最高者為最適作用時間）

包被條件：其他條件不變，選擇4℃過夜、37℃作用1h后4℃過夜、37℃作用2h，這3個梯度；

封閉時間：設(shè)0.5h、1h、2h、4h，共4個梯度；

血清樣品反應(yīng)時間：設(shè)10min、20min、30min、40min，共4個梯度；

酶標抗原作用時間：設(shè)30min、1h、2h，共3個梯度；

顯色時間：設(shè)顯色時間分別為5min、8min、10min、12min、14min，共5個梯度。

（4）臨界值的確定

隨機挑取SFTSV抗體陽性血清20份，抗體陰性血清80份，以優(yōu)化的抗原包被量和血清工作濃度對血清進行ELISA檢測，測定450nm的OD值，計算陰性血清的平均OD值（）和標準偏差（SD），求得陰陽性判定界限±3SD。

2 結(jié)果

2.1 重組抗原制備

原核表達質(zhì)粒pET28a-NP轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3）后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得表達蛋白與預(yù)期大小相符。表達產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化后純化獲得了較高純度的目的蛋白。

2.2 ELISA各項試驗條件優(yōu)化結(jié)果

從方陣滴定法檢測結(jié)果表1可以看到，隨著包被抗原濃度的減少和血清稀釋倍數(shù)的增加，血清的OD值不斷降低，當抗原包被濃度在4μg/ml，血清稀釋倍數(shù)為1：40時，陽性血清的OD值在1.0左右，且陰性血清的OD值低，陽性陰性血清比值（P/N）高。一般情況下，ELISA檢測儀在檢測OD值為1.0左右時誤差最小，反應(yīng)最靈敏，以此為根據(jù)我們選擇4μg/ml的抗原包被量為最適包被濃度，而被檢血清的最佳稀釋為1：40。

2.3 ELISA判定標準的確定

實驗測得陰性血清OD450nm均值范圍為0.12±0.03，在此基礎(chǔ)上確定該ELISA試劑盒的判定標準為S/N＞2.1，且陽性血清A450nm＞0.25時則待檢血清SFTSV總抗體為陽性。

2.4 特異性試驗

對其有出血熱癥的陽性血清和20份陰性血清進行檢測，結(jié)果均為陰性，沒有出現(xiàn)交叉反應(yīng)。

2.5 敏感性試驗

通過檢測倍比稀釋的陽性血清，結(jié)果顯示當血清稀釋濃度達到1：640時，按以上判定標準判定仍為陽性，說明該試劑盒的靈敏度為1：640.

3 結(jié)語

本試驗使用重組蛋白NP作為包被抗原和酶標記抗原，建立了雙抗原夾心ELISA法，并對其反應(yīng)條件進行優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上研制出ELISA試劑盒。通過對試劑盒的檢測表明其特異性良好，未于布尼亞其他病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，并且ELISA方法的成功建立克服了其他檢測法存在的缺點，該試劑盒的檢出率高，費用少，對儀器及檢驗員的要求不高，為試劑盒的推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

［1］ 劉雅婷，張文超，李正躍，等.布尼亞病毒科全基因組序列比對分析［J］.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，23（3）：315-320.

［2］ 陶文元，陶欣.新型布尼亞病毒感染致發(fā)熱伴血小板減少綜合征8例報告［J］.江蘇大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2011，21（1）：91-92.