陳 靜 趙文娟 李玉卿 夏永輝 袁嘉麗（云南中醫(yī)學(xué)院，昆明，650500）

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TGF-β1、MMP-9在哮喘大鼠氣道重建模型中的表達(dá)及丹參的干預(yù)作用

陳 靜 趙文娟 李玉卿 夏永輝 袁嘉麗
（云南中醫(yī)學(xué)院，昆明，650500）

摘要目的：觀察TGF-β1、MMP-9在哮喘大鼠氣道重建模型中的動態(tài)變化，探討丹參干預(yù)氣道重建的作用機(jī)制。方法：SPF級SD成年雄性大鼠70只隨機(jī)分為正常對照組、哮喘模型組（哮喘2周組、哮喘4周組、哮喘8周組）、丹參干預(yù)組（丹參2周組、丹參4周組、丹參8周組）3個大組，7個小組。用卵蛋白（OVA）-氫氧化鋁混懸液致敏與激發(fā)建立大鼠哮喘氣道重塑模型，激發(fā)2、4、8周后處死。觀察哮喘大鼠肺組織病理變化，采用ELISA法檢測大鼠肺組織TGF-β1、MMP-9水平。結(jié)果：哮喘大鼠氣道炎性細(xì)胞浸潤及支氣管平滑肌增厚，隨著激發(fā)時間的延長逐漸加重；同時，哮喘大鼠肺組織TGF-β1、MMP-9水平逐漸升高，哮喘4周組、哮喘8周組較正常對照組顯著升高（P＜0. 05、P＜0. 001）；使用丹參干預(yù)后，丹參8周組較哮喘8周組顯著降低（P＜0. 001）。結(jié)論：氣道重建的程度隨著哮喘發(fā)作及時間推移而發(fā)生動態(tài)變化；TGF-β1、MMP-9參與哮喘氣道重建過程；活血化瘀藥丹參可通過抑制TGF-β1、MMP-9水平而干預(yù)阻斷哮喘氣道重建。

關(guān)鍵詞哮喘；氣道重建；TGF-β1；MMP-9；丹參

Expression of TGF-β1、MMP-9 in airway remodeling in Asthma Rats Model and Effects of Salvia Miltiorrhiza

Chen Jing，Zhao Wenjuan，Li Yuqing，Xia Yonghui，Yuan Jiali
（Yunnan University of TCM，Kunming 650500，China）

Abstract Objective：To observe the dynamic changes of TGF-β1 and MMP-9 in the airway remodeling of asthma rat model and explore the mechanism of salvia miltiorrhiza（Danshen）in intervening airway remodeling. Methods：Seventy healthy adult male rats were randomly divided into the normal control group，asthma model group（subdivided into two-week asthmatic group，fourweek asthmatic group and eight-week asthmatic group）and salvia miltiorrhiza group（subdivided into two-week salvia miltiorrhiza group，four-week salvia miltiorrhiza group，and eight-week salvia miltiorrhiza group）with a total of seven groups with 10 rats in each. Asthmatic airway remodeling rats model was established with ovalbumin and Al（OH）3，and rats were observed 2，4 and 8 weeks after induced model respectively. The pathological changes of the lung tissue were observed. The level of TGF-β1 and MMP-9 in lung tissue was detected by ELISA. Results：Airway inflammatory cells infiltrated in airway tissue and the thickness of bronchial smooth muscle increased. With the prolongation of the stimulating time，TGF-β1 and MMP-9 level increased gradually in the asthma model group. Compared with the normal control group，there were significant differences（P＜0. 05，P＜0. 001）in the four-week asthmatic group and eight-week asthmatic group. After salvia miltiorrhiza was applied，the TGF-β1 and MMP-9 level decreased. Compared with the eight-week asthmatic group，there were significant differences（P＜0. 001）in the eight-week salvia miltiorrhiza group. Conclusion：The changes of airway remodeling in asthma are dynamic process and TGF-β1and MMP-9 may intervene in the changes of airway remodeling process. Salvia miltiorrhiza improve the state of airway remodeling in asthmatic rats by inhibiting the level of TGF-β1 and MMP-9.

Key Words Asthma；Airway remodeling；TGF-β1；MMP-9；Salvia miltiorrhiza

支氣管哮喘（哮喘）是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎性反應(yīng)性疾?。?］。氣道重建是哮喘的一大重要病理學(xué)特征，其本質(zhì)就是氣道纖維化和膠原沉積。氣道重建可加重氣道高反應(yīng)性，導(dǎo)致肺功能持續(xù)性與進(jìn)行性損害，從而增加了臨床上支氣管哮喘的難治性［2］。有效改善氣道重建成為哮喘防治的新方向。TGF-β1是迄今已知最強(qiáng)的致纖維化因子之一，也是導(dǎo)致哮喘氣道重建的主要調(diào)控因

1　材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級SD雄性大鼠70只，4～6周齡，體重（180±20）g（購自四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所，許可證編號：SCXK（川）2013-24，合格證號0018160）。

1. 2 試劑及儀器 雞卵清蛋白（OVA）、氫氧化鋁凝膠（Sigma公司，美國）；大鼠TGF-β1ELISA試劑盒；大鼠MMP-9 ELISA試劑盒（蘇州卡爾文生物科技有限公司）；酶標(biāo)儀（美國分子儀器公司）；壓縮霧化器（Pari Turboboy，德國）；臺式高速離心機(jī)（BECKMAN公司，美國）；自備有機(jī)玻璃霧化箱（45 cm×35 cm× 20 cm）。

1. 3 實(shí)驗(yàn)藥物 丹參，購于昆明福林堂藥業(yè)有限公司，以水煎法進(jìn)行藥液濃縮，每毫升藥液含生藥1 g，根據(jù)成人（60 kg）臨床一日用藥量換算出大鼠（200 g）等效用藥量，以上劑量均根據(jù)動物體表面積等效劑量換算。

1. 4 實(shí)驗(yàn)方法

1. 4. 1 模型制備及分組 SD雄性大鼠70只，隨機(jī)分為7組，每組10只，第1天和第14天腹腔注射OVA-氫氧化鋁混懸液2 mL致敏（OVA1 mg，氫氧化鋁100 mg，加生理鹽水至2 mL），于實(shí)驗(yàn)第21天起將大鼠置于密閉容器內(nèi)，予2%OVA生理鹽水霧化激發(fā)，30 min／次，隔天1次。正常對照組用生理鹽水代替OVA致敏和激發(fā)［7］。實(shí)驗(yàn)中觀察大鼠反應(yīng)，出現(xiàn)煩躁不安、呼吸急促深快、腹肌抽搐、煩躁嗆咳及點(diǎn)頭運(yùn)動等癥狀表明建立哮喘模型成功［8］。實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分成正常對照組、哮喘模型組（分為哮喘2周組、哮喘4周組、哮喘8周組）、丹參干預(yù)組（分為丹參2周組、丹參4周組、丹參8周組）共計3大組，7個小組。

1. 4. 2 制備組織病理切片 各組大鼠末次激發(fā)后24 h，打開胸腔取下左肺組織，中性甲醛固定，石蠟包埋后切片，HE染色光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)支氣管、血管及肺泡的病理改變。

1. 4. 3 指標(biāo)檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（ELISA）檢測各組大鼠肺組織勻漿上清液TGF-β1、MMP-9含量。參照試劑盒說明書進(jìn)行，通過標(biāo)準(zhǔn)品吸光度（A）值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計算各樣本的值。1. 5 數(shù)據(jù)收集和統(tǒng)計學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS軟件16. 0進(jìn)行統(tǒng)計分析處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。各組數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，方差齊；方差分析P＜0. 001，組間有差異，采用LSD法檢驗(yàn)，進(jìn)行多組間均數(shù)的多重比較。

圖2　哮喘2周組（HE×200）

圖3　哮喘4周組（HE×200）

圖4　哮喘8周組（HE×200）

圖5　丹參2周組（HE×200）

圖6　丹參4周組（HE×200）

圖7　丹參8周組（HE×200）

2　結(jié)果

2. 1 組織病理學(xué)改變 正常對照組：氣道周圍無炎性細(xì)胞浸潤，支氣管管腔規(guī)則，氣道黏膜上皮及肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔窄，氣道平滑肌薄，肺泡腔透亮，無上皮脫落損傷，黏膜無水腫。（圖1）。哮喘模型組：2周組支氣管可見黏液栓，氣道有損傷，肺泡間隔不同程度增寬，部分?jǐn)嗔?，氣管與血管周圍有炎性細(xì)胞浸潤（圖2）；4周組可見杯狀細(xì)胞增生，基底膜增厚，肺泡間隔不同程度增寬，輕度充血水腫，氣管周圍炎性細(xì)胞浸潤（圖3）；8周組大量密集炎性細(xì)胞浸潤，可見黏液栓，肺泡融合、不同程度斷裂，平滑肌增生（圖4）。丹參干預(yù)組：2周組大鼠支氣管壁周圍有少量炎性細(xì)胞浸潤，氣道平滑肌增厚不明顯，伴黏液分泌，基底膜稍增厚（圖5）；4周組增生細(xì)胞減少，肺泡大小相似，充血、水腫減輕，少量炎性細(xì)胞浸潤（圖6）；8周組支氣管管壁趨于正常，上皮結(jié)構(gòu)較完整，管壁未見增厚，浸潤的炎性細(xì)胞減少，無明顯炎性滲出（圖7）。

2. 2 大鼠肺組織勻漿TGF-β1及MMP-9含量測定

檢測結(jié)果顯示，哮喘4周組、哮喘8周組肺組織TGF-β1及MMP-9與正常對照組比較均有顯著升高（P＜0. 05），其中哮喘8周組升高最明顯（P＜0. 001）；隨著激發(fā)時間的延長，哮喘8周組TGF-β1 及MMP-9含量顯著高于哮喘2周組、哮喘4周組（P ＜0. 05）；使用丹參干預(yù)后，丹參2周組、丹參4周組肺組織TGF-β1及MMP-9含量較對應(yīng)時間的哮喘組有所降低，但差異統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0. 05），丹參8周組肺組織TGF-β1及MMP-9含量與哮喘8周組比較顯著降低（P＜0. 001）。

表1　各組大鼠肺組織勻漿TGF-β1及MMP-9含量（±s）

表1　各組大鼠肺組織勻漿TGF-β1及MMP-9含量（±s）

注：△與正常對照組比較，P＜0. 05；□與正常對照組比較，P＜0. 001；◇與哮喘2周組比較，P＜0. 05；☆與哮喘4周組比較，P＜0. 05；▲與哮喘2周組比較，P＞0. 05；■與哮喘4周組比較，P＞0. 05；◆與哮喘8周組比較，P＜0. 05；★與哮喘8周組比較，P＜0. 001。

組別　　鼠數(shù)　TGF-β1（ng／mL）　MMP-9（ng／mL）正常對照組10　 1. 05±0. 25　1. 99±0. 29哮喘2周組　9　 1. 41±0. 47△　2. 29±0. 51哮喘4周組　7　 1. 45. 9±0. 32△　2. 43±0. 40△哮喘8周組　7　 1. 99±0. 18□◇☆　3. 01±0. 31□◇☆丹參2周組　8　 1. 31±0. 36▲　1. 93±0. 30▲丹參4周組　7　 1. 33±0. 19■　2. 06±0. 49■丹參8周組　7　 1. 37±0. 30◆　2. 10±0. 20★F 5. 394　7. 037 P ＜0. 001　　＜0. 001

3　討論

氣道重塑是哮喘的重要病理特征，是哮喘發(fā)展到一定階段氣道出現(xiàn)的不可逆改變，也是哮喘難治的重要原因。目前，哮喘治療主要是控制癥狀、抗炎、免疫療法，從改善氣道重建的角度進(jìn)行哮喘治療的藥物很少，作用也不理想，因此，從氣道重建的調(diào)控因子入手，用藥物控制細(xì)胞因子的含量從而干預(yù)氣道重建，是治療難治性哮喘的一個新思路。

TGF-β是哮喘氣道重建的主要調(diào)控因子，其中以TGF-β1活性最強(qiáng)，作為促纖維化的關(guān)鍵因子，TGF-β1促進(jìn)平滑肌細(xì)胞和杯狀細(xì)胞肥大增生，增加膠原和纖連蛋白合成并促進(jìn)氣道膠原沉積和基底膜增厚，促進(jìn)結(jié)締組織蛋白合成從而導(dǎo)致官腔狹窄和和不可逆的肺功能改變［9-10］。MMP-9是特異性降解ECM的鋅依賴性蛋白酶家族，作為與哮喘氣道重塑關(guān)系最為密切的基質(zhì)金屬蛋白酶，MMP-9主要負(fù)責(zé)降解ECM，哮喘狀態(tài)下，MMP-9的過度表達(dá)不僅能導(dǎo)致ECM結(jié)構(gòu)重建，而且還能誘導(dǎo)嗜酸粒細(xì)胞遷移并影響氣道平滑肌細(xì)胞增殖與遷移，進(jìn)而誘發(fā)哮喘氣道重建［11-12］。因此，抑制TGF-β1和MMP-9表達(dá)可減輕哮喘氣道重建［13-14］。

哮喘在中醫(yī)屬“哮病”范疇，傳統(tǒng)上認(rèn)為，宿痰伏肺是哮喘的夙根，但現(xiàn)代中醫(yī)從痰的產(chǎn)生機(jī)制和臨床實(shí)踐分析，認(rèn)為痰瘀密切相關(guān)，相互影響。各種原因?qū)е卵３绅?，津聚為痰，產(chǎn)生瘀血、痰濁等病理產(chǎn)物，痰濁、瘀血有形之邪阻滯肺絡(luò)，搜逐不易，致肺管狹窄，使無形之氣不能宣降，痰瘀互結(jié)，氣道狹窄，更致津血運(yùn)行受礙，使病情遷延，纏綿難愈［15-16］。曹世宏認(rèn)為，肺燥陰傷和肺氣虛冷是哮喘的主要病機(jī)，但兩者均可導(dǎo)致瘀血，瘀血一旦形成又可影響氣機(jī)的宣暢，陰津陽氣難以布達(dá)，使肺纖維化形成加重。因此，活血化瘀是治療器官纖維化的重要方法。

本研究在深入探討哮喘氣道重建中醫(yī)病因病機(jī)的基礎(chǔ)上，利用中藥多靶點(diǎn)、多調(diào)控途徑的特點(diǎn)和優(yōu)勢，選擇活血化瘀藥丹參對哮喘氣道重建進(jìn)行干預(yù)。藥理作用研究表明丹參可活血化瘀，對抗氧自由基，改善微循環(huán)［17］，有利于及時清除氣道上的炎性因子及免疫復(fù)合物；同時丹參可抑制成纖維細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡，減少膠原合成和分泌的作用。本研究檢測哮喘氣道重建不同階段的病理特征及在氣道重建的不同階段給予丹參干預(yù)后的大鼠肺組織TGF-β1、MMP-9的動態(tài)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，隨著激發(fā)時間延長和哮喘發(fā)作次數(shù)的增加，炎性反應(yīng)反復(fù)刺激，肺組織TGF-β1、MMP-9的分泌逐漸升高，大鼠肺組織病理變化趨于嚴(yán)重，氣道重建越明顯；經(jīng)丹參干預(yù)后，肺組織TGF-β1、MMP-9隨著干預(yù)時間的延長逐漸下降；大鼠肺組織炎性細(xì)胞浸潤減少，支氣管管壁和平滑肌增生程度減輕，氣道重建逐漸改善；這表明TGF-β1、MMP-9是哮喘氣道重建的重要調(diào)控因子，監(jiān)測TGF-β1、MMP-9的表達(dá)可幫助我們了解氣道重建的發(fā)生時間及發(fā)展程度；另一方面，活血化瘀藥丹參干預(yù)或阻斷哮喘氣道重建的機(jī)制可能是通過抑制TGF-β1、MMP-9表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。

參考文獻(xiàn)

［1］栗麗麗，師強(qiáng)華，梁淑芬.支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.中醫(yī)臨床研究，2014，6（36）：27-29.

［2］Makinde T，Murphy RF，AgrawalDK. The regulatory role of TGF-beta in airway remodeling in asthma［J］. Immunol Cell Biol，2007，85（5）：348-356.

［3］Kenyon N J，Ward R W，McGrew，et al. TGF-beta1 causes airway fibrosis and increased collagenⅠandⅢmRNA in mice［J］. Thorax，2003，58（9）：772-777.

［4］Watson AM，Benton AS，Rose MC，F(xiàn)reishtat RJ. Cigarette smoke alters tissue inhibitor of metalloproteinase 1 and matrix metalloproteinase 9 levels in the basolateral secretions of human asthmatic bronchial epithelium in vitro［J］. J Investig Med，2010，58（5）：725-729.

［5］Mehra D，Sternberg DI，et al. Altered lymphocyte trafficking and diminished airway reactivity in transgenic mice expressing human MMP-9 in a mouse model of asthma［J］. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2010，298（2）：189-196.

［6］牛建昭，賁長恩.器官纖維化基礎(chǔ)及中醫(yī)藥防治［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：11.

［7］趙文娟，韓妮萍.生三七粉調(diào)節(jié)哮喘小鼠氣道炎癥及Th亞群相關(guān)細(xì)胞因子的實(shí)驗(yàn)研究［J］.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2014，9（12）：1296-1299.

［8］Eynott P R，Nath P，Leung S Y，et al. Allergen-induced inflammuition and airway epithelial and smooth muscle cell proliferation：role of Jun N-terminal kinase［J］. Br J Pharmmeol，2003，140（8）：1373-1380.

［9］Donnell MP. Renal tubulointerstisial fibrosis new thoughts on its development and progression［J］. Postgrad Med，2010，122（4）：208-219.

［10］Itoigawa Y，Harada N，Harada S，et al. TWEAK enhances TGF-β-induced epithelial-mesenchymal transition in human bronchial epithelial cells［J］. Respir Res，2015，16：48.

［11］Piirila P，LauhioA，Majuri MI，et al. Matrix metalloproteinases-7，-8，-9 and TIMP-1 in the follow-up of diisocyanate-induced asthma［J］. Allergy，2010，65：61-68.

［12］Ma HP，Li W，Liu XM. Matrix metalloproteinase 9 is involved in airway inflammation in cough variant asthma［J］. Exp Ther Med，2014，8（4）：1197-1200.

［13］彭光耀，劉鑫，黃艷，等. TGF_1_Smads通路在哮喘大鼠氣道重塑模型中的動態(tài)變化［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2010，31（5）：557-560.

［14］McMillan SJ，Xanthou G，Lloyd CM. Manipulation of allelgen-induced airway remodeling by treatment with anti-TGF-beta antibody：effect on the smad signaling pathway［J］. J Immunol，2005，174（9）：5774-5780.

［15］田金娜，李建保.丹龍定喘湯對哮喘小鼠氣道重塑及血清TGF-β1的影響研究［J］.四川中醫(yī)，2012，30（4）：17-19.

［16］陳昕芳.活血化瘀法治療哮喘發(fā)作期研究［J］.長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2013，29（2）：236-237.

［17］陳媛媛，郭芳，王文軍，等.丹參聯(lián)合川芎嗪對肺纖維化大鼠肺組織JAKl、STATl、ICAM-1表達(dá)的影響［J］.瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2012，35（1）：6-13.

（2015 -06 -30收稿 責(zé)任編輯：王明）

通信作者：袁嘉麗（1963. 03—），女，博士，教授，研究生處處長，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)免疫學(xué)，E-mail：yjl6688767＠sina. combook=104,ebook=109子［3］。MMP-9是降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，在生理和病理情況下有利于組織重構(gòu)［4-5］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為氣道纖維化雖有多種病機(jī)，但大多數(shù)醫(yī)家都認(rèn)同在不同證型的纖維化中瘀血都成為了重要病理產(chǎn)物。因此，活血化瘀是治療器官纖維化的大法［6］。本實(shí)驗(yàn)通過組織病理分析和ELISA法檢測哮喘氣道重建不同階段的病理特征及在氣道重建的不同階段給予丹參干預(yù)后的大鼠氣道TGF-β1、MMP-9的動態(tài)變化。

作者簡介：陳靜（1978. 08—），女，碩士，講師，形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室主任，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)免疫學(xué)，E-mail：sunnychenj＠163. com

基金項(xiàng)目：云南省教育廳重大專項(xiàng)項(xiàng)目（編號：ZD2013010）；云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目（編號：2013Y241）；云南省高校中醫(yī)藥調(diào)節(jié)機(jī)體微環(huán)境應(yīng)用基礎(chǔ)研究科技創(chuàng)新團(tuán)隊項(xiàng)目

中圖分類號：R285. 5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

doi：10. 3969／j. issn. 1673 -7202. 2016. 03. 029