李秀榮李慧杰許艷艷（山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，濟南，5004；山東中醫(yī)藥大學，濟南，5004）

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納米雄黃抑制人乳腺癌MCF-7細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機制探討

李秀榮1李慧杰1許艷艷2
（1山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，濟南，250014；2山東中醫(yī)藥大學，濟南，250014）

摘要目的：觀察納米雄黃對乳腺癌MCF-7細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，并探討其相關(guān)機制。方法：體外培養(yǎng)乳腺癌MCF-7細胞，不同濃度納米雄黃溶液干預，并設立對照組，免疫組化實驗檢測各組細胞E-cad、HIF-1α表達情況，RT-PCR檢測SnailmRNA表達情況。結(jié)果：各納米雄黃組E-cad表達陽性率均明顯高于對照組（P＜0. 01），而HIF-1α表達陽性率均低于對照組（P＜0. 01）；對照組、納米雄黃低、中、高劑量組、阿霉素組的SnailmRNA相對表達量依次為（52. 16±3. 87）、（30. 10±2. 48）、（47. 08±3. 45）、（41. 42±4. 35）、（36. 07±2. 45）。結(jié)論：納米雄黃可通過上調(diào)E-cad表達、下調(diào)HIF-1α 及Snail mRNA表達逆轉(zhuǎn)乳腺癌MCF-7細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)揮抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用。

關(guān)鍵詞納米雄黃；乳腺癌；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；腫瘤轉(zhuǎn)移

The Mechanism of Nanometer Realgar to Inhibit the Epithelial Mesenchymal Transition of Breast Cancer MCF-7 cells

Li Xiurong1，Li Huijie1，Xu Yanyan2
（1 The Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji'nan 250014，China；2 Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji'nan 250014，China）

Abstract Objective：To explore the effect of nanometer realgar affecting epithelial mesenchymal transition of the breast cancer MCF-7 cells and its possible mechanism. Methods：Breast cancer MCF-7 cells were cultured in vitroand and use different doses of nanometer realgar to intervene. A control group was made. To test the expression of E-cad and HIF-1α，RT-PCR to detected the expression of Snail mRNA. Results：Compared with the control group，the E-cad positive rates of the nanometer realgar group were higher than the control group（P＜0. 01）；the HIF-1α positive rates of the nanometer realgar group were less than the control group （P＜0. 01）；the control group，nanometer realgar low，medium and high dose groups，doxorubicin group of Snail mRNA relative expression levels were（52. 16±3. 87），（30. 10±2. 48），（47. 08±3. 45），（41. 42±4. 35），（36. 07±2. 45）respectively. Conclusion：Nanometer realgar can inhibit the migration and invasion of breast cancer MCF-7 cells，and it has anti-tumor metastasis. Nanometer realgar can resist tumor through reversing EMT by raising the level of E-cad and reducing the level of HIF-1α and Snail mRNA.

Key Words Nanometer realgar；Breast cancer；EMT；Metastasis

乳腺癌作為女性最常見的惡性腫瘤，在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率約占新發(fā)病例的23%，死亡率高達14%，侵襲轉(zhuǎn)移是其預后不良的主要原因之一，盡管乳腺癌綜合治療療效不斷改進，但抗侵襲轉(zhuǎn)移方面仍不盡人意［1］。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial Mesenchymal Transition，EMT），是指上皮細胞在特殊的生理和病理情況下向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化的現(xiàn)象，在腫瘤的擴散轉(zhuǎn)移及多種慢性疾病的發(fā)生進展中起到重要作用［2］。前期研究發(fā)現(xiàn)，納米雄黃可有效抑制腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移，為此，我們研究觀察了納米雄黃對乳腺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，進而探討其對乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用。

1　材料與方法

1. 1 細胞株 乳腺癌MCF-7細胞，山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中心實驗室惠贈。

1. 2 主要試劑 DMEM／F12培養(yǎng)基（賽默飛世爾生物化學制品有限公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），胰蛋白酶、兔抗人E-cad多克隆抗體、兔抗人HIF-1α多克隆抗體、免疫組化DAB顯色試劑盒、濃縮型SABC試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），Tritonx-100、總RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒（北京Solarbio科技生物公司），Snail基因引物、β-actin內(nèi)參引物（上海生物技術(shù)有限公司）。

1. 3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱、超純水系統(tǒng)（Heraeus公司），超凈工作臺（Thermo Forma公司），倒置相差顯微鏡（Olympus公司），細胞培養(yǎng)瓶、細胞培養(yǎng)板、無菌過濾器、凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Alpha公司）、Spectrophotometer（上海元析儀器有限公司）、PCR儀（英國Thermo Hybaid公司）、梯度PCR儀（德國Biometro公司）。

1. 4 納米雄黃及溶液制備 雄黃購于陜西康惠制藥有限公司，后由山東龍脈科技發(fā)展有限公司龍脈精研機研磨納米化，再由濟南微納顆粒儀器股份有限公司光子相關(guān)納米激光粒度分析儀檢測鑒定。實驗時用10%KCl飽和硝酸溶液溶解，NaOH調(diào)pH至7. 0，PBS定容，配制成濃度為600 μg／mL的納米雄黃溶液，過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 5 實驗分組 共分5組，對照組（10%胎牛血清）、阿霉素組（2 μg／mL）、納米雄黃低劑量組（30 μg／mL）、納米雄黃中劑量組（60 μg／mL）、納米雄黃高劑量組（90 μg／mL）。

1. 6 免疫組化實驗 常規(guī)培養(yǎng)細胞，制備細胞懸液，接種于盛有蓋玻片的六孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)細胞；待細胞成功爬片后，換液，按實驗分組干預，繼續(xù)培養(yǎng)；24 h后PBS清洗，95%乙醇固定；0. 5%Trion X-100室溫卵育15 min；3%H2O2室溫卵育15 min；山羊血清封閉液封閉；一抗稀釋液，濕盒4度過夜；二抗稀釋液，37℃培養(yǎng)箱濕盒卵育30 min；SABC 37℃培養(yǎng)箱濕盒卵育；DAB染色，蘇木素輕度復染，鹽酸乙醇脫色，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。觀察時選擇陽性細胞較集中的區(qū)域，采集約3～5個光鏡視野輸入HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)進行定量分析。

1. 7 RT-PCR實驗 常規(guī)培養(yǎng)細胞，制備細胞懸液，平均分瓶繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞長滿80%按實驗分組干預，48 h后按RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，紫外分光光度儀測定RNA純度及濃度以判定其質(zhì)量，按試劑盒說明書逐步合成cDNA、擴增PCR，制膠、上樣，水平電泳，完畢后將膠板至0. 5 μg／mL EB溶液中室溫染色20 min，Alpha凝膠成像系統(tǒng)攝取圖像，系統(tǒng)分析，計算相對表達量。

1. 8 統(tǒng)計學處理 實驗所得數(shù)據(jù)均運用SPSS 18. 0進行統(tǒng)計分析。

2　結(jié)果

2. 1 納米雄黃對E-cad、HIF-1α表達的影響 與對照組相比，各濃度納米雄黃組、阿霉素組的E-cad表達陽性率均明顯高于對照組（P＜0. 01），而HIF-1α表達陽性率均低于對照組（P＜0. 01）。與阿霉素組相比，各濃度納米雄黃組的E-cad表達陽性率均低于阿霉素組（P＜0. 01），而HIF-1α表達陽性率高于阿霉素組（P＜0. 05或P＜0. 01）。納米雄黃組隨濃度的增加，E-cad表達陽性率明顯升高、HIF-1α表達陽性率則逐步降低。結(jié)果表明：納米雄黃可上調(diào)E-cad表達、降低HIF-1α表達，隨濃度增加作用增強。

表1　E-cad、HIF-1α表達陽性率（±s）

表1　E-cad、HIF-1α表達陽性率（±s）

注：單因素方差分析，與對照組比較，*P＜0. 05、**P＜0. 01，與阿霉素組比較，△P＜0. 05、△△P＜0. 01。

組別　　個數(shù)　E-cad陽性率（%）　HIF-1α陽性率（%）對照組619. 52±1. 79　68. 25±3. 81納米雄黃低劑量組　6　28. 49±2. 55**△△　62. 45±3. 56**△△納米雄黃中劑量組　6　41. 37±3. 11**△△　56. 98±3. 46**△△納米雄黃高劑量組　6　46. 51±1. 71**△△　48. 97±4. 06**△阿霉素組　6　56. 70±3. 40**　43. 94±2. 68**納米雄黃＋阿霉素組　6　61. 58±4. 51**△△　35. 79±2. 68**△△

2. 2 納米雄黃對Snail mRNA表達的影響 與對照組相比，各藥組Snail mRNA相對表達量均低于對照組（P＜0. 05或P＜0. 01），與阿霉素組比較，各濃度納米雄黃組Snail mRNA相對表達量均高于阿霉素組（P＜0. 01），且各納米雄黃組隨濃度的升高，Snail mRNA相對表達量逐漸降低。結(jié)果表明：納米雄黃可抑制Snail mRNA在乳腺癌MCF-7細胞中的表達，隨濃度增加其抑制Snail mRNA表達的作用增強。見表2。

表2　Snail mRNA的相對表達量（±s）

表2　Snail mRNA的相對表達量（±s）

注：單因素方差分析，與對照組比較，*P＜0. 05、**P＜0. 01，與阿霉素組比較，△P＜0. 05、△△P＜0. 01。

組別　　個數(shù)　RATIO（%）對照組652. 16±3. 87阿霉素組　6　30. 10±2. 48**納米雄黃低劑量組　6　47. 08±3. 45*△△納米雄黃中劑量組　6　41. 42±4. 35**△△納米雄黃高劑量組　6　36. 07±2. 45**△△

3　討論

腫瘤轉(zhuǎn)移是一個多步驟、多因素參與的復雜過程，依賴于腫瘤細胞與促腫瘤細胞生長、侵襲、轉(zhuǎn)移等內(nèi)環(huán)境因素的相互作用，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移則會加速腫瘤患者死亡的進程，因此，研究腫瘤轉(zhuǎn)移及其相關(guān)機制顯得尤為重要［3］。Theiry和Weinberg早在2002年提出了惡性腫瘤細胞轉(zhuǎn)移前會發(fā)生EMT的觀點，認為EMT的發(fā)生可使腫瘤細胞獲得間質(zhì)細胞所具有的運動和侵襲能力，成為其進入血道、淋巴道進行遠處轉(zhuǎn)移的前提［4］。在EMT過程中伴有多個細胞分子標志改變，其中E-cadherin的減少或丟失不僅是EMT最重要的標志性變化，也是促進腫瘤轉(zhuǎn)移的重要表現(xiàn)［5］。缺氧誘導因子1（hypoxia inducible factor 1，HIF1）是缺氧條件下傳遞缺氧信號、介導缺氧效應的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，通過結(jié)合缺氧反應元件激活下游眾多靶基因參與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移［6］。Snail是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，依賴C-末端的鋅指結(jié)構(gòu)域和N-末端的SNAG（Snail／Gfi）結(jié)構(gòu)域調(diào)控靶基因的表達，其異常表達與侵襲型腫瘤密切相關(guān)［7］。越來越多的證據(jù)表明，HIF介導的低氧信號傳導途徑及微環(huán)境中氧分水平變化是誘發(fā)調(diào)節(jié)EMT的重要機制，且研究發(fā)現(xiàn)Snail、Twist、ZEB等轉(zhuǎn)錄因子可結(jié)合到編碼E-cadherin的啟動子上阻滯基因轉(zhuǎn)錄，進而下調(diào)E-cadherin表達，是腫瘤EMT分子調(diào)控機制網(wǎng)絡的關(guān)鍵樞紐［8-9］。研究E-cadherin、HIF、Snail等分子標志對研究EMT機制具有重要意義。

“毒聚”貫穿惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的始終，癌毒之邪其性走串，易乘虛鴟張而余薪復燃，四行旁竄，殘余毒邪與人體正氣相爭，正勝邪退，疾病趨于穩(wěn)定好轉(zhuǎn)；正不抑邪，腫瘤則復發(fā)轉(zhuǎn)移；加之外感六淫、七情內(nèi)傷、過勞以及治療時攻伐太過等多種因素影響，可進一步加重正氣虧虛，蟄伏之余毒、伏邪乘虛而進，導致腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移［10］。乳腺癌屬本虛標實之證，多因氣機失調(diào)，日久氣血凝滯，經(jīng)絡不通，久則毒聚為瘤，攻毒治法是其主要治法之一。雄黃具有解毒、殺蟲、燥濕、祛痰、截瘧等作用，是攻毒治法的代表藥物之一，現(xiàn)代藥理表明其具有活躍的抗腫瘤效用，且隨著納米醫(yī)藥技術(shù)的發(fā)展，雄黃納米化后解決了難溶問題，提高了生物利用度與藥效，增強了對瘤細胞的靶向性，降低了不良反應［11-12］。前期研究發(fā)現(xiàn)納米雄黃可有效抑制肺癌A549細胞及皮膚磷癌A431細胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移［13-14］，亦可抑制乳腺癌MCF-7的惡性生物學行為，但其機制有待進一步探討［15］。而本研究發(fā)現(xiàn)，納米雄黃可通過上調(diào)E-cad表達、下調(diào)HIF-1α表達，抑制Snail mRNA表達逆轉(zhuǎn)乳腺癌MCF-7細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進而發(fā)揮抗乳腺癌轉(zhuǎn)移作用，且隨濃度增加作用增強。另有文獻報道，可見，納米雄黃是抗腫瘤轉(zhuǎn)移的有效藥物之一，攻毒治法可作為防治腫瘤轉(zhuǎn)移的選擇。

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（2015 -07 -01收稿 責任編輯：王明）

中圖分類號：R273

文獻標識碼：A

doi：10. 3969／j. issn. 1673 -7202. 2016. 03. 033

通信作者：李秀榮（1963. 01—），女，醫(yī)學博士，主任醫(yī)師，博士研究生導師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合腫瘤防治研究，E-mail：2008lihuijie＠163. com

基金項目：山東省自然科學基金資助項目（編號：ZR2010HL050）