黃雪君孫冬梅陳玉興甘海寧黃 琳趙靜宇（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州，50095；廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州，50006）

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護(hù)卵顆粒對(duì)重復(fù)制動(dòng)應(yīng)激致卵巢功能減退模型大鼠的影響

黃雪君1孫冬梅1陳玉興1甘海寧1黃 琳2趙靜宇2
（1廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州，510095；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州，510006）

摘要目的：觀察護(hù)卵顆粒對(duì)重復(fù)制動(dòng)應(yīng)激致大鼠卵巢功能減退的治療作用。方法：模型組采用性周期規(guī)律的雌性SD大鼠置于特制的束縛制動(dòng)筒內(nèi)，固定身體使之不能隨意活動(dòng)，制動(dòng)應(yīng)激1次／d，連續(xù)15 d建立卵巢早衰大鼠模型，每天陰道圖片觀察大鼠動(dòng)情周期變化，造模成功后分為6組：模型對(duì)照組、補(bǔ)佳樂組、調(diào)經(jīng)促孕丸組及護(hù)卵顆粒高、中、低劑量組，另取10只作為空白對(duì)照組，連續(xù)給藥4周。給藥結(jié)束后經(jīng)開野行為測(cè)定后腹主動(dòng)脈采血，冰臺(tái)上取大鼠下丘腦，留取卵巢組織標(biāo)本。測(cè)定血清雌二醇（Estradiol in serum，E2）、促卵泡激素（Follicle-stimulating Hormone，F(xiàn)SH）、黃體生成素（Luteinizing Hormone LH）、孕酮（Progesterone，PROG）水平及檢測(cè)下丘腦多巴胺（Dopamine，DA）、去甲腎上腺素（Noradrenaline，NA）、五羥色胺（Hydroxytryptamine，5-HT）含量，觀察卵巢濕重變化及組織學(xué)改變。結(jié)果：護(hù)卵顆粒各劑量組能明顯提高重復(fù)制動(dòng)應(yīng)激致卵巢早衰大鼠的水平和垂直活動(dòng)得分，能提高卵巢早衰大鼠血清E2、PROG水平和降低FSH、LH水平，降低卵巢早衰大鼠下丘腦DA、NA及5-HT含量，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 05或P＜0. 01）。與模型組比較，護(hù)卵顆粒高、中劑量組大鼠卵巢內(nèi)各級(jí)卵泡數(shù)增多，卵巢指數(shù)增加。結(jié)論：護(hù)卵顆?？梢蕴岣呗殉补δ軠p退模型大鼠水平活動(dòng)和垂直活動(dòng)，增加E2、PROG及NA的分泌，增加卵巢指數(shù)，促進(jìn)卵巢功能減退大鼠的卵泡生長(zhǎng)，恢復(fù)受損卵巢的內(nèi)分泌功能。

關(guān)鍵詞護(hù)卵顆粒；卵巢功能減退；重復(fù)制動(dòng)應(yīng)激；開野行為

Effect of HuLuanKeLi on Diminished Ovarian Reserve Rats with Repeated Immobilization Stress

Huang Xuejun1，Sun Dongmei1，Chen Yuxing1，Gan Haining1，Huang Lin2，Zhao Jingyu2
（1 Guangdong Research Institute of Traditional Chinese Medicine（TCM）Manufacturing Technology，Guangdong Province Key Laboratory of TCM Research and Development，Guangzhou 510095，China；2 Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China）

Abstract Objective：To observe the effects of HuLuanKeLi on diminished ovarian reserve in rats of repeated immobilization. Methods：The adult female rats with regular cycle in model group were exposed to the scheduled daily repeated immobilization for 15 days，one time per day. The duration of immobilization was progressively increased with the subsequent episode. Daily vaginal smears were permfored to follow the estrous cycle in rats. After molding，60 rats were subdivided into 6 groups（n ＝10）：Model group，BuJiaLe group，TiaoJingCuYunWan group，high-dose、middle-dose and low-dose group，treated for 4 weeks respectively. After Openfield testing，blood samples were obtained from abdominalaorta，and samples of ovarian tissues were harvested. Serum levels of Estradiol（E2），F(xiàn)ollicle-stmiulating hormone（FSH），Luteinizing hormone（LH），Progesterone（PROG）and hypothalamus content of Dopamine（DA），Norepinephrine（NA），Serotonin（5-HT）were measured by ELISA，and the changes of wet weight and histology of ovary were observed. Results：Compared with the model group，HuLuanKeLi increased serum level of E2，PROG and decreased FSH，LH；and decreased hypothalamus content of DA，NA，5-HT（P＜0. 05or P＜0. 01）；and the wet weight of ovary increased in each dose of HuLuanKeLi groups. Conclusion：HuLuanKeLi can promote follicle growth in rats with premature ovarian failure，increase secretion of ovarian E2，PROG，and improve endocrine function of damaged ovaries.

Key Words HuLuanKeLi；premature ovarian failure；repeated immobilization；openfield

卵巢產(chǎn)生卵子能力減弱，卵泡質(zhì)量下降，導(dǎo)致女性生育能力下降及性激素的缺乏，稱卵巢功能減退即卵巢儲(chǔ)備功能下降（Diminished Ovarian Reserve， DOR）。DOR臨床表現(xiàn)可無癥狀，或僅表現(xiàn)為生育力的下降，或輕微的月經(jīng)改變等，若患者診斷不及時(shí)而延誤治療，容易發(fā)展為卵巢早衰（Premature Ovari-an Failure，POF），而增加了治療的難度。中醫(yī)的“肝”是機(jī)體調(diào)節(jié)心理應(yīng)激反應(yīng)的核心，在心理應(yīng)激的狀態(tài)下，最先受到影響的是人體的氣機(jī)，中醫(yī)肝主疏泄與心理應(yīng)激狀態(tài)下導(dǎo)致的神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂、免疫功能異常等密切相關(guān)。肝氣郁結(jié)證是主要中醫(yī)證型之一，中醫(yī)藥治療已經(jīng)取得較好的療效，而且副作用?。?-3］。

護(hù)卵顆粒（加減益經(jīng)顆粒）是由加減益經(jīng)湯經(jīng)現(xiàn)代工藝制成的中成藥制劑。護(hù)卵顆粒是根據(jù)《傅青主女科》的學(xué)術(shù)思想，在益經(jīng)湯的基礎(chǔ)上加減而成，應(yīng)用于DOR患者，取得了較好的療效。它由熟地黃、菟絲子、當(dāng)歸、丹參、黨參、柴胡、白芍等中藥組成，方中以熟地黃、菟絲子、杜仲補(bǔ)腎之陰陽，柴胡調(diào)達(dá)肝氣以實(shí)肝用，當(dāng)歸白芍補(bǔ)血養(yǎng)肝以養(yǎng)肝陰，全方補(bǔ)腎疏肝兼以活血健脾。本實(shí)驗(yàn)通過建立重復(fù)制動(dòng)應(yīng)激致肝郁型卵巢功能減退大鼠模型，觀察護(hù)卵顆粒對(duì)卵巢功能減退大鼠的治療作用，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　資料與方法

1. 1 一般資料

1. 1. 1 藥物 護(hù)卵顆粒（加減益經(jīng)顆粒），由廣東省中醫(yī)研究所制劑實(shí)驗(yàn)室提供，批號(hào)為131003。戊酸雌二醇片（補(bǔ)佳樂），法國(guó)DELPHARM Lille S. A. S公司產(chǎn)品，批號(hào)251A2。調(diào)經(jīng)促孕丸，北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，批號(hào)2035224。

1. 1. 2 動(dòng)物 SPF級(jí)雌性SD大鼠，體重180～220 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)生產(chǎn)合格證號(hào)和動(dòng)物合格證號(hào)分別為SCXK（粵）2008-0002 和NO 44007200010888。實(shí)驗(yàn)設(shè)施使用許可證號(hào)：SYXK（粵）2010-0059。

1. 1. 3 試劑 ELISA Kit for Rat E2，Batch No. 1406251；ELISA Kit for Rat FSH，Batch No. 1406251；ELISA Kit for Rat LH，Batch No. 1407252；ELISA Kit for Rat PROG，Batch No. 1407261；ELISA Kit for Rat Dopamine，Batch No. 1407181；ELISA Kit for Rat NA，Batch No. 1407101；ELISA Kit for Rat Serotonin，Batch No. 1407271；以上均為上海西唐生物科技有限公司產(chǎn)品。

1. 1. 4 儀器 JJ3000動(dòng)物電子稱，G＆G公司產(chǎn)品；BS224S萬分之一電子天平，德國(guó)SARTORIUS產(chǎn)品；Bio-RAD 680酶標(biāo)儀，美國(guó)伯樂公司產(chǎn)品；YD-AB型攤烘烤片機(jī)，YD62型石蠟包埋機(jī)，YD-6L型智能冰凍包埋機(jī)，浙江金華益迪產(chǎn)品；Leica RM2235輪式切片機(jī)，Leica TP 1020型全自動(dòng)脫水機(jī)，德國(guó)萊卡公司產(chǎn)品；Shandon Gemini染色機(jī)，德國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；DHG-9203型電熱恒溫干燥鼓風(fēng)干燥箱，上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠產(chǎn)品；Olympus DP2-BSW型病理圖像采集系統(tǒng)，日本奧林巴斯公司產(chǎn)品。

1. 2 方法

1. 2. 1 劑量設(shè)置 劑量換算方法參考《中藥藥理研究方法學(xué)》“體表面積比”換算動(dòng)物等效劑量［4］。護(hù)卵顆粒：臨床日用量65. 50 g生藥，大鼠等效劑量為5. 895 g生藥／kg，設(shè)為中劑量。高、中、低劑量組分別對(duì)應(yīng)護(hù)卵顆粒11. 790 g生藥／kg、5. 895 g生藥／kg、2. 9475 g生藥／kg。戊酸雌二醇片：臨床日用量1 mg，大鼠等效劑量為0. 09 mg／kg。調(diào)經(jīng)促孕丸：臨床日用量10 g，大鼠等效劑量為0. 9 g／kg。

1. 2. 2 造模方法 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，行陰道脫落細(xì)胞涂片檢查，1次／d，連續(xù)10 d，篩選出動(dòng)情期為4～5 d，并連續(xù)出現(xiàn)2個(gè)動(dòng)情周期的大鼠。將有規(guī)律性周期的雌性大鼠取10只作為空白組，其余大鼠為模型組，按照文獻(xiàn)方法［5-6］，應(yīng)激時(shí)間安排在9：00 AM～5：00 PM之間，大鼠置于特制的束縛制動(dòng)筒內(nèi)，固定身體與尾部，使之不能隨意活動(dòng)，制動(dòng)應(yīng)激1次／d，連續(xù)15 d，第1～3天每天制動(dòng)應(yīng)激2 h，以后每3 d延長(zhǎng)應(yīng)激時(shí)間1 h。

1. 2. 3 分組及給藥 應(yīng)激結(jié)束后大鼠取血測(cè)定血清E2含量，以低于180 pg／mL為造模成功，除空白組10只大鼠外，取造模成功大鼠60只隨機(jī)分為6組，分別為模型組、補(bǔ)佳樂組、調(diào)經(jīng)促孕丸組及護(hù)卵顆粒高、中、低劑量組，每組10只。護(hù)卵顆粒各劑量組及補(bǔ)佳樂、調(diào)經(jīng)促孕丸組大鼠按劑量灌胃給藥，10 mL／kg，1次／d，連續(xù)4周，空白組、模型組大鼠給予等體積蒸餾水。

1. 2. 4 檢測(cè)指標(biāo) 1）陰道脫落細(xì)胞檢查［7］：開始造模后，每天進(jìn)行大鼠陰道細(xì)胞學(xué)涂片蘇木素伊紅染色后鏡檢觀察其動(dòng)情周期變化。2）開野行為測(cè)定（Open-field）［8］：在方形木箱（80 cm×80 cm×40 cm）進(jìn)行，周壁為黑色，底面分為均勻的方格。實(shí)驗(yàn)時(shí)在安靜的房間將大鼠放在木箱正中，以大鼠三爪以上跨入鄰格的次數(shù)為水平活動(dòng)得分，兩前肢離地或攀附墻壁1 cm以上的次數(shù)為垂直活動(dòng)得分。每只大鼠每次測(cè)定時(shí)間為5 min，徹底清潔木箱后觀察下一大鼠。3）血清指標(biāo)檢測(cè)：大鼠腹主動(dòng)脈取血，分離血清，血清置于-20℃保存待測(cè)。以酶聯(lián)免疫法測(cè)定大鼠血清中E2、FSH、LH、PROG水平的變化。4）神經(jīng)遞質(zhì)的檢測(cè)：斷頭處死大鼠，冰臺(tái)上打開顱腔，取下丘腦，液氮速凍后入低溫冰箱保存。生理鹽水研磨10%勻漿，酶聯(lián)免疫法檢測(cè)下丘腦DA、NA、5-HT含量。5）卵巢稱重：完整取出大鼠卵巢及子宮，去掉筋膜及脂肪組織，電子天平稱重，將稱得的卵巢濕重、子宮濕重分別除以體重，按以下公式計(jì)算：卵巢指數(shù)＝卵巢濕重（mg）／體重（g）×100%，子宮指數(shù)＝子宮濕重（mg）／體重（g）×100%。6）卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察：稱重后置福爾馬林固定，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片，行組織形態(tài)學(xué)觀察。

1. 2. 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有計(jì)量資料以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間均數(shù)兩兩比較，方差齊時(shí)采用SNK法；方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3法。由SPSS 15. 0軟件完成。

2　結(jié)果

2. 1 對(duì)大鼠動(dòng)情周期的影響 通過陰道涂片觀察所得，各大鼠造模前動(dòng)情周期變化規(guī)律，周期約4～5 d。除空白對(duì)照組外其余各組大鼠自身免疫造模后大鼠出現(xiàn)動(dòng)情周期改變，停止于動(dòng)情間期；空白對(duì)照組仍有規(guī)律的動(dòng)情周期。模型對(duì)照組造模后4周內(nèi)動(dòng)情周期紊亂；補(bǔ)佳樂組、護(hù)卵顆粒高、中劑量組給藥后14～15 d出現(xiàn)完整的動(dòng)情周期；低劑量組給藥后19～20 d左右開始出現(xiàn)動(dòng)情前期，持續(xù)8～10 d，至給藥4周結(jié)束前出現(xiàn)動(dòng)情期；調(diào)經(jīng)促孕丸組給藥后15～17 d出現(xiàn)動(dòng)情周期，周期時(shí)間延長(zhǎng)。

2. 2 對(duì)重復(fù)制動(dòng)應(yīng)激大鼠開野行為的影響 由表1可見，各組大鼠Open-Field法測(cè)定水平活動(dòng)，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組的大鼠水平活動(dòng)得分顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 01），護(hù)卵顆粒高、中、低劑量組與補(bǔ)佳樂組、調(diào)經(jīng)促孕丸組大鼠水平活動(dòng)得分明顯高于模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 05或P＜0. 01）。

各組大鼠Open-Field法測(cè)定垂直活動(dòng)，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組的大鼠水平活動(dòng)得分顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 01），護(hù)卵顆粒高劑量組與調(diào)經(jīng)促孕丸組大鼠垂直活動(dòng)得分明顯高于模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 05或P ＜0. 01）。

2. 3 對(duì)大鼠血清E2、FSH、LH、PROG的影響 由表2可知，給藥4周后，模型對(duì)照組大鼠E2及PROG與空白對(duì)照組比較明顯降低，護(hù)卵顆粒各劑量組與補(bǔ)佳樂組、調(diào)經(jīng)促孕丸組大鼠E2及PROG與模型對(duì)照組比較顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 05或P ＜0. 01）。模型對(duì)照組大鼠FSH、LH與空白對(duì)照組比較明顯增高，護(hù)卵顆粒各劑量組與補(bǔ)佳樂組、調(diào)經(jīng)促孕丸組大鼠FSH與模型對(duì)照組比較顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 01），護(hù)卵顆粒各劑量組大鼠LH與模型對(duì)照組比較顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 05）。

2. 4 對(duì)大鼠垂體DA、NA、5-HT的影響 由表3可知，給藥4周后，模型對(duì)照組大鼠DA、NA、5-HT與空白對(duì)照組比較明顯增高，護(hù)卵顆粒高劑量組與補(bǔ)佳樂組大鼠DA與模型對(duì)照組比較顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 01），護(hù)卵顆粒高、中劑量組與補(bǔ)佳樂組、調(diào)經(jīng)促孕丸組大鼠NA與模型對(duì)照組比較顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 01或P＜0. 05），護(hù)卵顆粒各劑量組與補(bǔ)佳樂組、調(diào)經(jīng)促孕丸組大鼠5-HT與模型對(duì)照組比較顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 01或P＜0. 05）。

2. 5 對(duì)大鼠卵巢指數(shù)、子宮指數(shù)的影響 由表4可知，大鼠給藥4周后，模型對(duì)照組大鼠卵巢指數(shù)與空白對(duì)照組比較明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 01）。護(hù)卵顆粒各劑量組與補(bǔ)佳樂組、調(diào)經(jīng)促孕丸組大鼠卵巢指數(shù)與模型組比較顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 05）。各給藥組與空白對(duì)照組及模型對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0. 05）。

表1　護(hù)卵顆粒對(duì)重復(fù)制動(dòng)應(yīng)激大鼠水平活動(dòng)、垂直活動(dòng)的影響（±s，n＝10）

表1　護(hù)卵顆粒對(duì)重復(fù)制動(dòng)應(yīng)激大鼠水平活動(dòng)、垂直活動(dòng)的影響（±s，n＝10）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0. 05，**P＜0. 01；與模型對(duì)照組比較，＃P＜0. 05，＃＃P＜0. 01。

組別　　劑量　　水平活動(dòng)得分　　垂直活動(dòng)得分空白對(duì)照組-69. 60±6. 69　32. 20±10. 23模型對(duì)照組　-　32. 00±7. 60**　13. 40±5. 50**補(bǔ)佳樂組　0. 09 mg／kg　41. 00±8. 41**?！?7. 60±4. 72**調(diào)經(jīng)促孕丸組　0. 9 g／kg　53. 40±10. 97**＃＃　22. 60±8. 17*＃護(hù)卵顆粒高劑量組　11. 79 g／kg生藥　63. 70±11. 03＃?！?9. 60±5. 10＃＃護(hù)卵顆粒中劑量組　5. 895g／kg生藥　60. 30±13. 38＃＃　25. 10±9. 31＃＃護(hù)卵顆粒低劑量組　2. 9475 g／kg生藥　47. 80±10. 70**＃?！?1. 80±6. 48*＃

表2　護(hù)卵顆粒對(duì)卵巢功能減退模型大鼠E2、FSH、LH、PROG的影響（±s，n＝10）

表2　護(hù)卵顆粒對(duì)卵巢功能減退模型大鼠E2、FSH、LH、PROG的影響（±s，n＝10）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0. 05，**P＜0. 01；與模型對(duì)照組比較，＃P＜0. 05，＃＃P＜0. 01。

組別　　劑量　E2（pg／mL）　FSH（ng／mL）　LH（ng空白對(duì)照組　-　273. 01±60. 72　1. 06±0. 52　1. 45±0模型對(duì)照組　-　116. 27±58. 82**　3. 76±0. 75**　4. 38±1補(bǔ)佳樂組　0. 09 mg／kg　210. 24±49. 68＃　2. 26±0. 58**＃?！?. 46±0調(diào)經(jīng)促孕丸組　0. 9 g／kg　181. 68±53. 30*?！?. 82±0. 58**＃?！?. 04±1護(hù)卵顆粒高劑量組　11. 79 g生藥／kg　 239. 25±91. 27＃?！?. 35±0. 55**＃?！?. 66±1護(hù)卵顆粒中劑量組　5. 895 g生藥／kg　 211. 68±73. 47?！?. 39±0. 33**＃?！?. 44±0護(hù)卵顆粒低劑量組　2. 9475 g生藥／kg　 198. 12±52. 64＃　2. 77±0. 41**＃?！?. 60±0 ／mL）　PROG（ng／mL）. 60　424. 71±47. 85 . 92*　286. 19±79. 72**. 99　363. 76±69. 72＃. 06　377. 85±63. 50＃. 04＃　384. 69±75. 66＃. 53?！?67. 84±48. 56＃. 76＃　356. 80±83. 75＃

表3　護(hù)卵顆粒對(duì)卵巢功能減退模型大鼠DA、NA、5-HT的影響（±s，n＝10）

表3　護(hù)卵顆粒對(duì)卵巢功能減退模型大鼠DA、NA、5-HT的影響（±s，n＝10）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0. 05，**P＜0. 01；與模型對(duì)照組比較，＃P＜0. 05，＃＃P＜0. 01。

組別　　劑量　DA（pg／mL）　NA（ng／mL）　5-HT（ng／mL）空白對(duì)照組-42. 42±10. 93　4. 88±1. 35　25. 94±3. 55模型對(duì)照組　-　87. 47±19. 69**　13. 66±3. 43**　50. 77±7. 69**補(bǔ)佳樂組　0. 09 mg／kg　45. 21±6. 88＃?！?. 46±1. 64＃?！?4. 48±2. 34**＃＃調(diào)經(jīng)促孕丸組　0. 9 g／kg　73. 97±17. 73**　8. 57±2. 47*?！?9. 88±6. 00**＃護(hù)卵顆粒高劑量組　11. 79 g生藥／kg　52. 32±11. 82＃?！?. 66±1. 88*＃＃　34. 56±5. 54*＃＃護(hù)卵顆粒中劑量組　5. 895 g生藥／kg　64. 54±20. 08　7. 73±2. 72＃?！?7. 27±7. 00**＃護(hù)卵顆粒低劑量組　2. 9475 g生藥／kg　80. 90±22. 84**　10. 64±3. 61*　39. 64±5. 78**＃

表4　護(hù)卵顆粒對(duì)卵巢功能減退模型大鼠卵巢指數(shù)的影響（±s，n＝10）

表4　護(hù)卵顆粒對(duì)卵巢功能減退模型大鼠卵巢指數(shù)的影響（±s，n＝10）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0. 05，**P＜0. 01；與模型對(duì)照組比較，＃P＜0. 05，＃＃P＜0. 01。

組別　　劑量　　卵巢指數(shù)mg／g%　　子宮指數(shù)mg／g%空白對(duì)照組-50. 70±3. 43　211. 84±64. 40模型對(duì)照組　-　39. 32±3. 63**　165. 59±38. 78補(bǔ)佳樂組　0. 09mg／kg　46. 96±6. 40＃　207. 08±60. 78調(diào)經(jīng)促孕丸組　0. 9g／kg　45. 15±4. 67?！?96. 69±67. 04護(hù)卵顆粒高劑量組　11. 79g生藥／kg　47. 09±5. 13?！?02. 16±32. 55護(hù)卵顆粒中劑量組　5. 895g生藥／kg　46. 87±6. 51?！?95. 61±52. 41護(hù)卵顆粒低劑量組　2. 9475g生藥／kg　45. 24±5. 92＃175. 65±25. 15

圖1　護(hù)卵顆粒卵巢功能減退模型大鼠卵巢結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)影響（HE，×100）

2. 6 對(duì)大鼠卵巢結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)變化 空白對(duì)照組卵巢可見各級(jí)卵泡及黃體分布，形態(tài)正常，成熟卵泡體積較大，卵泡液較多。模型對(duì)照組卵巢生長(zhǎng)卵泡減少，原始卵泡較多，黃體數(shù)量少，閉鎖卵泡多。補(bǔ)佳樂組與調(diào)經(jīng)促孕丸組初級(jí)卵泡、生長(zhǎng)卵泡增多，成熟卵泡可見。護(hù)卵顆粒高、中劑量組生長(zhǎng)卵泡較模型對(duì)照組增多，出現(xiàn)較大直徑的卵泡，閉鎖卵泡減少。護(hù)卵顆粒低劑量組生長(zhǎng)卵泡、成熟卵泡可見。結(jié)果見圖1。

3　討論

社會(huì)、心理因素對(duì)女性生殖健康的影響越來越受到關(guān)注，婦女易受身心應(yīng)激的影響而導(dǎo)致月經(jīng)失調(diào)閉經(jīng)等婦科疾病發(fā)生。有調(diào)查研究心理因素是導(dǎo)致DOR及POF的中藥原因之一，且長(zhǎng)期的社會(huì)心理壓力可能比短期的壓力更能影響卵巢的功能［9-10］。肝主謀慮，性喜條達(dá)而惡抑郁，肝健則情志調(diào)暢，肝與情志密切相關(guān)。陳修園在《婦科要旨·種子篇》中云：婦人無子，皆由經(jīng)水不調(diào)，經(jīng)水所以不調(diào)者，皆由內(nèi)有七情之傷，外有六淫之感，或氣血偏盛，陰陽相乖所致。有學(xué)者提出心理應(yīng)激從中醫(yī)臟象理論分析當(dāng)主要責(zé)之于肝［11］，肝氣郁結(jié)證的客觀化研究也提示［12］，肝氣郁結(jié)證存在心理應(yīng)激的障礙病理機(jī)制，涉及神經(jīng)內(nèi)分泌等調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。軀體和心理應(yīng)激均能在下丘腦-垂體-卵巢軸（Hypothalamicpituitary-ovarianaxis，HPO）水平抑制或損害女性卵巢功能，導(dǎo)致女性生殖內(nèi)分泌功能紊亂或下降，甚至卵巢早衰。肝郁主要由應(yīng)激產(chǎn)生的一系列神經(jīng)內(nèi)分泌的變化來體現(xiàn)的，尤其是HPO在卵巢內(nèi)分泌活動(dòng)的周期性變化調(diào)控中居關(guān)鍵地位，并可能以單胺類遞質(zhì)的調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)在情志與生殖內(nèi)分泌之間呈雙向調(diào)節(jié)作用。

本實(shí)驗(yàn)采用重復(fù)制動(dòng)應(yīng)激建立肝郁型卵巢功能減退大鼠模型，慢性制動(dòng)應(yīng)激使動(dòng)物自由行動(dòng)受限，情緒受抑，比較接近中醫(yī)“情志不遂”的病因。模型組大鼠水平活動(dòng)及垂直活動(dòng)減少，動(dòng)情周期紊亂，血清中E2、PROG的含量顯著降低，F(xiàn)SH、LH水平明顯升高，下丘腦DA、NA、5-HT含量升高，提示應(yīng)激狀態(tài)下升高DA、NA、5-HT影響了中樞性腺對(duì)激素的分泌，引起了大鼠內(nèi)分泌功能受損，說明造模成功。慢性應(yīng)激能使大鼠活動(dòng)減少，血清E2水平降低及FSH水平升高，能使大鼠卵巢各級(jí)卵泡數(shù)及黃體數(shù)減少［5，13-14］。在行為學(xué)研究中，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)常用來考察動(dòng)物在新奇環(huán)境中的活動(dòng)度、探究行為、恐懼緊張狀態(tài)及警覺性，肝郁證動(dòng)物活動(dòng)度明顯減少［15］。HPO軸應(yīng)激性紊亂與下丘腦-垂體-腎上腺軸（Hypothalamic - pituitary - adrenal Axis，HPA）軸應(yīng)激性亢進(jìn)密切相關(guān)，心理應(yīng)激能激活HPA軸，并在下丘腦、垂體、卵巢3個(gè)水平影響女性生殖內(nèi)分泌功能［16］，而兒茶酚胺類和5-HT被認(rèn)為是應(yīng)激最重要的神經(jīng)遞質(zhì)［17-18］。FSH水平升高在卵巢功能下降時(shí)出現(xiàn)，它隨卵巢功能及受孕能力的降低而升高［19］。E2可能是比FSH更早反應(yīng)卵巢功能下降的指標(biāo)［20］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，護(hù)卵顆粒各劑量組均能增加大鼠水平活動(dòng)和垂直活動(dòng)得分，明顯降低下丘腦DA、NA、5-HT含量，并明顯地升高DOR大鼠血清中E2、PROG的含量，降低FSH、LH水平，提示護(hù)卵顆粒可能通過參與調(diào)節(jié)HPO的內(nèi)分泌功能，調(diào)節(jié)紊亂的單胺類遞質(zhì)水平，促進(jìn)卵巢分泌E2，抑制下丘腦和垂體FSH和LH的分泌。病理結(jié)果亦表明，護(hù)卵顆粒各劑量組生長(zhǎng)卵泡數(shù)和成熟卵泡數(shù)增多，閉鎖卵泡明顯減少。

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（2015 -05 -13收稿 責(zé)任編輯：張文婷）

中圖分類號(hào)：R285. 5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10. 3969／j. issn. 1673 -7202. 2016. 03. 035

通信作者：孫冬梅（1969—），女，碩士，博士生導(dǎo)師，主任中藥師，研究方向：從事中藥配方顆粒劑及中藥新藥研發(fā)，E-mail：tcmgdp＠163. com

作者簡(jiǎn)介：黃雪君（1981—），女，博士，副主任中藥師，研究方向：從事中藥藥理及毒理研究，Tel：（020）83576735，E-mail：sharon510＠126. com

基金項(xiàng)目：廣州市越秀區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2013-CY-003）