唐娟，付潔，柴際堯，唐興江

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,四川瀘州646000)

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·綜述·

誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞在阿爾茨海默病模型構(gòu)建及治療中的應(yīng)用進(jìn)展

唐娟，付潔，柴際堯，唐興江

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,四川瀘州646000)

阿爾茨海默病(AD)是一種發(fā)病隱匿的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和記憶損傷,但目前臨床上尚無(wú)有效的治療方法。通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)使體細(xì)胞重編程而得到的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSC)，因其具有類似胚胎干細(xì)胞的多種功能，可構(gòu)建AD病理學(xué)研究模型、開展AD潛在治療藥物篩選和個(gè)性化的細(xì)胞治療方案，從而為AD的治療提供了新途徑。

阿爾茨海默?。簧窠?jīng)干細(xì)胞；誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞；細(xì)胞治療

近年，阿爾茨海默病(AD)發(fā)病率逐年升高，給患者及其家庭帶來(lái)了痛苦和負(fù)擔(dān)，也對(duì)全世界健康醫(yī)療體系造成了巨大的挑戰(zhàn)，更引發(fā)了社會(huì)公眾的持續(xù)性關(guān)注。AD又稱為老年癡呆癥，是老年期最常見的癡呆類型，為一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行性退變的疾病，臨床表現(xiàn)以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和記憶損傷為主，其主要的病理特征為β-淀粉樣蛋白(Aβ)在神經(jīng)元細(xì)胞外異常沉積形成老年斑、tau蛋白異常磷酸化形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)、神經(jīng)元的丟失，但其具體病因及機(jī)制仍不完全清楚，尚有待更進(jìn)一步的探究。目前AD的診斷以臨床表現(xiàn)為主，分為癡呆前階段和癡呆階段，常以患者大腦顳葉、海馬萎縮或神經(jīng)元損傷的相關(guān)影像學(xué)表現(xiàn)和病理學(xué)標(biāo)志物作為病情的判斷依據(jù)。在治療方面，膽堿酯酶抑制劑、NMDA受體拮抗劑和腦代謝賦活劑等小分子藥物及免疫療法是目前常用的藥物和方法。但藥物只能改善AD早期的臨床癥狀，無(wú)法阻止疾病的進(jìn)展和惡化，免疫療法的不良反應(yīng)也較多，且費(fèi)用昂貴，臨床推廣困難[1]。同樣，目前尚無(wú)成熟的的病理研究模型[2]。然而，誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSC)是近年研究發(fā)現(xiàn)的具有胚胎干細(xì)胞類似功能的一種新型細(xì)胞，為AD的治療提供了新的視野，其具有以下特點(diǎn)：①增殖能力強(qiáng)，具有極高的分化潛能，且數(shù)量來(lái)源廣，可由普通的體細(xì)胞誘導(dǎo)獲得，成本低廉；②細(xì)胞免疫原性低，免疫排斥反應(yīng)低；③誘導(dǎo)靶細(xì)胞形成iPSC的過(guò)程中不會(huì)經(jīng)歷胚胎階段，不涉及倫理問(wèn)題。因此，iPSC克服了傳統(tǒng)干細(xì)胞在AD治療上的諸多難題，為在病因上根治AD提供了可能?，F(xiàn)就iPSC在阿爾茨海默病模型構(gòu)建及治療中的應(yīng)用進(jìn)展綜述如下。

1　iPSC在AD模型構(gòu)建中的應(yīng)用

阿爾茨海默病是一種發(fā)病復(fù)雜、不可逆轉(zhuǎn)的進(jìn)行性神經(jīng)退化疾病，目前尚無(wú)成熟的病理學(xué)研究模型能夠完全表現(xiàn)其發(fā)病特征。AD小鼠模型雖然具有家族性AD基因缺陷，表現(xiàn)為神經(jīng)突觸受損和記憶損傷，但是卻檢測(cè)不到淀粉樣沉積斑塊和神經(jīng)纖維纏結(jié)等病理特點(diǎn)[3]，因此無(wú)法在動(dòng)物模型上完全模擬 AD 的發(fā)病進(jìn)程。然而，家族性AD患者來(lái)源的iPSC，經(jīng)分化獲得的神經(jīng)細(xì)胞，其Aβ分泌量和磷酸化tau蛋白得到有效提高，結(jié)合體外的3D培養(yǎng)體系，更能夠促進(jìn)其體外形成Aβ斑塊和神經(jīng)纖維纏結(jié)，達(dá)到AD發(fā)病水平的特征，滿足體外研究AD發(fā)病模型的需求[3]。另外，有研究表明[4]，由1例82歲患有間歇性中風(fēng)的家族性AD患者的皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)形成iPSC，經(jīng)分化獲得的神經(jīng)細(xì)胞，與普通神經(jīng)細(xì)胞相比，其AD相關(guān)基因的表達(dá)水平發(fā)生了重大變化，具體情況與患者腦部病變細(xì)胞相似，且經(jīng)過(guò)γ分泌酶處理之后，其磷酸化tau蛋白量下調(diào)。由此證明了iPSC分化的神經(jīng)細(xì)胞可以作為體外研究AD發(fā)病和藥物篩選的病理模型。

2　iPSC在AD治療中的應(yīng)用

自從1998年，美國(guó)科學(xué)家Thomson等[5]首次在體外建立人胚胎干細(xì)胞系(ESC)[5]以來(lái)，已有多項(xiàng)研究[1,6～11]表明，運(yùn)用干細(xì)胞在體外分化獲得的神經(jīng)干/祖細(xì)胞和特異神經(jīng)細(xì)胞移植到AD小鼠病理模型中，能夠有效改善其空間記憶力和認(rèn)知功能。其治療AD可能的機(jī)制是：①干細(xì)胞分化的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮受損細(xì)胞功能或完全替代受損細(xì)胞；②分泌營(yíng)養(yǎng)因子，促進(jìn)內(nèi)源性修復(fù)；③分化而來(lái)的神經(jīng)細(xì)胞清除病發(fā)部位的神經(jīng)毒性物質(zhì)。綜上所述，干細(xì)胞具有徹底治愈AD的潛能，但是由于胚胎干細(xì)胞的稀缺性和倫理問(wèn)題限制了臨床上進(jìn)一步的應(yīng)用和發(fā)展。日本科學(xué)家山中伸彌[12,13]將4個(gè)在胚胎干細(xì)胞中高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc相繼轉(zhuǎn)入小鼠和人體的皮膚成纖維細(xì)胞，成功地將其轉(zhuǎn)變?yōu)閕PSC，解決了以上難題，從而打開了利用iPSC治療AD的新領(lǐng)域。

2.1iPSC在AD治療藥物篩選中的應(yīng)用

患者自體來(lái)源的iPSC細(xì)胞，攜帶相同的發(fā)病基因，經(jīng)過(guò)特殊培養(yǎng)條件獲得表型和功能上與AD相同的神經(jīng)細(xì)胞，可以作為體外藥物篩選的有效模型，獲得能夠改善AD癥狀的種子藥物。這項(xiàng)突破將大大加快新藥的研發(fā)速度。據(jù)報(bào)道[14]，2013年日本的iPSC細(xì)胞研究與應(yīng)用中心將從家族性AD患者身上獲得的攜帶有APP-E693突變的細(xì)胞誘導(dǎo)形成iPSC，分化為AD病理型神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞。以此細(xì)胞為藥物篩選模型，證明了二十二碳六烯酸(DHA)能夠減少由Aβ低聚物累積造成的活化氧自由基，從而緩解AD病情。

iPSC 技術(shù)為體外規(guī)?；Y選治療AD 的有效藥物提供了源源不斷的靶細(xì)胞，開辟了藥物篩選治療 AD 的新天地。但是，目前的小分子藥物只能延緩AD病情惡化，卻無(wú)法徹底治愈AD。因此，最有潛力的 AD 治愈手段，當(dāng)屬細(xì)胞再生治療。

2.2iPSC在AD個(gè)性化細(xì)胞治療方案制定中的應(yīng)用利用iPSC來(lái)源的功能正常的神經(jīng)細(xì)胞，通過(guò)基因編輯和工程改造，在體外經(jīng)過(guò)大量擴(kuò)增、特殊培養(yǎng)等處理之后，使其具有修復(fù)或替代受損細(xì)胞發(fā)揮功能的作用，能夠?qū)崿F(xiàn)治療或治愈AD等神經(jīng)退行性疾病的目的。例如，2013年，日本大學(xué)藥學(xué)院的Koutar團(tuán)隊(duì)[15]制備了一種由人體iPSC分化而且表達(dá)腦啡肽酶-2(NEP2)的巨噬細(xì)胞(iPS-ML/NEP2)，將其注射到5XAD模型小鼠的大腦中，發(fā)現(xiàn)在iPS-ML/NEP2周圍Aβ含量明顯降低，由Aβ造成的神經(jīng)毒性也隨之下降。雖然，這種細(xì)胞治療方法在動(dòng)物模型上證明其能夠緩解AD病情，減輕因Aβ沉積導(dǎo)致病情惡化的程度，但是，從最終治療原理來(lái)看，與普通藥物治療類似，依然不能根治AD。如果采用iPSC來(lái)源的功能性神經(jīng)干/祖細(xì)胞和特異神經(jīng)細(xì)胞，通過(guò)移植進(jìn)入患者腦部病變部位，替換掉受損神經(jīng)細(xì)胞，從基本治療原理而言，將有可能徹底治愈AD[16,17]。

雖然，目前iPSC來(lái)源的神經(jīng)細(xì)胞還主要用于體外構(gòu)建AD病理模型，研究其發(fā)病機(jī)制和特征，以及為藥物篩選提供參考，但是，開展以iPSC為基礎(chǔ)的細(xì)胞治療研究將會(huì)成為新的方向。隨著干細(xì)胞分化技術(shù)的不斷優(yōu)化，以iPSC為起始分化細(xì)胞，能夠獲得功能性的神經(jīng)干/祖細(xì)胞、神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞類型[17,18]，通過(guò)移植到AD動(dòng)物模型大腦中，直接替換受損細(xì)胞，很有可能實(shí)現(xiàn)治療AD等相關(guān)神經(jīng)退行性疾病的目標(biāo)。

2.3iPSC在AD治療中所面臨問(wèn)題以往的研究中，由iPSC獲得的目的神經(jīng)細(xì)胞都需要經(jīng)歷干細(xì)胞的中間階段，同時(shí)，由于分化效率不高，最終獲得的是由異質(zhì)細(xì)胞和目的細(xì)胞組成的混雜細(xì)胞群，增加了細(xì)胞純化難度。針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，轉(zhuǎn)分化技術(shù)便應(yīng)運(yùn)而生。轉(zhuǎn)分化技術(shù)是指利用特殊轉(zhuǎn)錄因子，將A細(xì)胞直接誘導(dǎo)為B細(xì)胞的技術(shù)，中間過(guò)程不用經(jīng)歷iPSC階段。2010年，斯坦福醫(yī)學(xué)院的Thomas 等[19]利用3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Ascl1、Brn2、MyT1L，將小鼠成纖維細(xì)胞快速有效地誘導(dǎo)為具有功能性突觸的神經(jīng)細(xì)胞。在這個(gè)細(xì)胞誘導(dǎo)過(guò)程中，細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為目的細(xì)胞，不用經(jīng)歷干細(xì)胞的中間狀態(tài)。2012年，Lujan等[20]以Sox2-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠的成纖維細(xì)胞為靶細(xì)胞，轉(zhuǎn)入11個(gè)在神經(jīng)祖細(xì)胞里高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)縮減篩選因子的方法，最終確定3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子-Sox2、FoxG1、Brn2能夠重編程靶細(xì)胞為多能性神經(jīng)祖細(xì)胞，在體外分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和少量成熟的神經(jīng)元。轉(zhuǎn)分化技術(shù)為體外直接獲得大量神經(jīng)細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)，不僅提高了目的細(xì)胞的獲得率，而且簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)流程，降低了成本，為后續(xù)的個(gè)性化藥物篩選以及細(xì)胞治療開拓了新的途徑。

另外，iPSC存在一定致瘤幾率[21]，主要原因有以下兩點(diǎn)：①制備iPSC所使用的核心轉(zhuǎn)錄因子之一c-myc已經(jīng)被證明是成癌基因；②通過(guò)病毒轉(zhuǎn)染的方法引入外源基因，基因片段會(huì)隨機(jī)插入細(xì)胞基因組中，可能引發(fā)細(xì)胞癌變。因此，iPSC的臨床應(yīng)用首先應(yīng)該嚴(yán)格控制其致瘤風(fēng)險(xiǎn)。2013年，Hou等[22]利用4個(gè)化學(xué)小分子將小鼠成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為化學(xué)誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(CiPSC)。由于在這項(xiàng)重編程實(shí)驗(yàn)過(guò)程中只使用了安全性的化學(xué)小分子，沒(méi)有外源基因的插入，所以從理論和實(shí)踐上均不存在致瘤風(fēng)險(xiǎn)。Xiang等[23,24]利用8個(gè)化學(xué)小分子將患有家族遺傳性AD病人來(lái)源的皮膚細(xì)胞重編程為有功能的神經(jīng)細(xì)胞。

綜上所述，利用 iPSC 技術(shù)治療 AD 的研究已經(jīng)初步取得成果，進(jìn)一步加深了我們對(duì)AD 的認(rèn)識(shí)和治愈 AD 的信心。盡管iPSC在AD模型構(gòu)建和治療上仍然存在一些問(wèn)題與挑戰(zhàn)，同時(shí)細(xì)胞治療面臨的倫理問(wèn)題持續(xù)存在，但是，我們?nèi)匀怀珜?dǎo)加速推動(dòng)iPSC技術(shù)治療AD的臨床研究，這就需要進(jìn)一步提高其臨床治療的安全性，降低移植治療的意外風(fēng)險(xiǎn)，更需要科學(xué)家和臨床工作者提供大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)的支持?？傊?，運(yùn)用iPSC技術(shù)治療各類細(xì)胞及組織頑疾是大勢(shì)所趨，在功能性治愈阿爾茨海默病的道路上，必將扮演至關(guān)重要的角色。

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唐興江(E-mail：3161946txj@163.com)

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2016-03-06)