柴囡囡, 王朋濤， 郭　蕾， 李正炎,2

(中國海洋大學1. 環(huán)境科學與工程學院； 2.海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室， 山東 青島 266100)

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固定化三角褐指藻對海水中壬基酚的去除和降解作用研究

柴囡囡1, 王朋濤1， 郭蕾1， 李正炎1,2

(中國海洋大學1. 環(huán)境科學與工程學院； 2.海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室， 山東 青島 266100)

摘要：壬基酚是一種具有雌激素效應的內(nèi)分泌干擾物，同時具有致癌作用。壬基酚在水環(huán)境中廣泛存在，但是目前對其有效去除的技術有限。本文研究并比較了海藻酸鈉包埋固定的三角褐指藻與懸浮自由藻對海水中壬基酚的去除和降解能力，實驗設置了2個壬基酚濃度組，分別為低濃度組(1μg/L)和高濃度組(10μg/L)。結果表明：在2個濃度組中固定化藻細胞和自由藻細胞的細胞密度和葉綠素a濃度在168h的處理時間內(nèi)均呈現(xiàn)類似的增長趨勢；168h后，固定化藻細胞和自由藻細胞對壬基酚的去除率和降解率均達到95%左右。由于固定化藻珠具有易收獲、可生產(chǎn)生物能源等優(yōu)點，因此固定化三角褐指藻更適合于海水中壬基酚的去除。

關鍵詞：壬基酚； 三角褐指藻； 固定化微藻； 生物降解； 水環(huán)境

壬基酚(Nonylphenol, NP)是壬基酚聚氧乙烯醚(Nonylphenol Ethoxylates, NPEOs)的降解產(chǎn)物。NP作為分散劑、洗滌劑、增塑劑等，廣泛應用于造紙、皮革、化妝品、建材以及塑料等行業(yè)，與人們的日常生活關系密切[1]。NP及其母體化合物NPEOs主要通過污廢水排放進入環(huán)境，對許多生物產(chǎn)生不同程度的危害,主要包括生殖系統(tǒng)和生物機體發(fā)育、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)以及致癌作用等[2]，1996年美國環(huán)保署將NP列在有毒物質(zhì)控制法的條例中。中國環(huán)境中NPEOs的排放量約占世界排放量的10%[3-4]，研究表明中國近岸海水中的壬基酚已經(jīng)達到了相當高的風險水平，對海洋生物及人類產(chǎn)生了很大的威脅[5-6]。NP已經(jīng)對人類社會發(fā)展造成了顯著影響，對其降解和去除已是十分迫切?，F(xiàn)有的污水處理系統(tǒng)不能有效去除NP[7]，因此迫切需要研發(fā)更加高效去除NP的方法和技術，以降低其生態(tài)和健康風險。

海洋微藻是海洋生態(tài)系統(tǒng)中的主要生產(chǎn)者，其體積小、營養(yǎng)豐富、對環(huán)境適應能力強[8]，藻細胞中含有多種活性物質(zhì)。微藻可以有效富集、降解包括偶氮染料、烷烴、重金屬、營養(yǎng)物質(zhì)等多種污染物[9]。相對于自由懸浮藻，利用固定化微藻吸附降解有毒難降解有機污染物具有操作簡單、可耐受高濃度有毒物質(zhì)等特點。本文利用海藻酸鈉對三角褐指藻進行包埋固定，研究比較了固定化與自由藻細胞的生長和生理特征，及其對海水中NP的去除效果，為使用固定化微藻技術去除近岸海水中的NP提供了初步的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 標準品、試劑及材料

NP(標準品，Sigma-Aldrich公司，美國)配成1 g/L的單標儲備液。色譜用試劑均為色譜純級，購于美國Tedia公司，其他的化學試劑為分析純級。

三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)，由中國海洋大學海洋生命學院提供。采用f/2培養(yǎng)基[10]，將接有藻種的三角瓶置于GXZ-280B型光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度(20±3)℃，光照強度100 μmol·s-1·m-2，光暗比為12 h∶12 h。

1.2 微藻固定化和去固定化

將進入對數(shù)生長期的三角褐指藻(初始細胞密度為2.7×106cell·mL-1)離心濃縮(5000r/m，10min)，棄去上清液后用無菌過濾海水重復離心2次，最后將藻細胞懸浮在無菌過濾海水中，按一定比例(體積比4∶3)與2.5% (g/g)海藻酸鈉溶液均勻混合，用蠕動泵(BT100-2J型，保定蘭格恒流泵有限公司)勻速(3.2mL/min)滴入2.5%預冷的氯化鈣溶液，產(chǎn)生均勻的固定化藻珠，藻珠直徑為(3.0±0.2) mm，在氯化鈣溶液中進一步硬化(4 ℃，至少24 h)[11]?？瞻缀Ｔ逅徕c珠的制備用無菌海水替代細胞懸浮液，其余與上述步驟基本相同。經(jīng)硬化，2種藻珠在實驗前均用無菌海水清洗2次。

取一定數(shù)量藻珠放入5%的檸檬酸鈉溶液中，充分振蕩即可實現(xiàn)藻細胞的去固定。所有實驗過程均在無菌條件下完成。

1.3 實驗設計

將NP單標儲備液稀釋為1μg/L (低濃度組)和10μg/L (高濃度組)。每組分別按下列條件進行培養(yǎng)(1)固定化藻珠組：加入160個藻珠(初始葉綠素a濃度為0.4mg/L)；(2)自由藻細胞組：加入一定體積的藻懸浮液(葉綠素a濃度與固定化藻珠組相同)；(3)固定化空白珠組：加入160個空白珠；(4)對照組：不加任何藻或空白珠的壬基酚溶液設置為空白對照。每組設置3個平行，實驗周期為168h，每隔一定時間取樣測定藻細胞數(shù)量、葉綠素a濃度和NP殘余量。

1.4 微藻生長和生理特征

分別在第24、96和168h，從各處理組中隨機取出5mL溶液和15個藻珠。

將取出的15個藻珠隨機分成3組，并分別浸沒在5mL 5%檸檬酸鈉溶液中脫固定。第一組用來測定藻細胞密度，使用血球計數(shù)板在光學顯微鏡(Optika Microscopes，意大利)下計數(shù)2次。第二組用來測定葉綠素a濃度[12]，脫固定后藻液置于離心管中，在5 000r/m下離心10min, 棄去上清液，加入5mL 95% 甲醇混勻，水浴(60 ℃)加熱5min后再次離心10min后取上清液，使用紫外分光光度計(TU-1810型，北京普析通用儀器有限公司)以95%甲醇溶液作空白，分別在665和652nm波長下測定吸光度，并按照下式計算提取液中葉綠素a濃度Ca：Ca=16.29 ×A665- 8.54 ×A652。

1.5 NP的測定

所取的5mL溶液和第三組藻珠用來測定NP殘余量(包括被海藻酸鈉吸附的NP、藻細胞對NP的吸收/吸附量以及殘留在培養(yǎng)液中的NP)。針對固定化藻珠組，藻珠脫固定后離心15min，上清液用于測定吸附在海藻酸鈉中的NP，沉淀的藻泥用于測定藻細胞的吸收/吸附量。針對自由藻細胞組，5mL藻液先在4 ℃下離心15min，上清液用于測定溶液中的NP殘余量。對于固定化空白珠組，5mL溶液用于測定溶液中NP的殘余量，空白珠脫固定化后用于測定海藻酸鈉中NP的吸附量。

溶液中的NP用液-液萃取法提取，即水樣中先加入50 μL 2mg/L的替代標準(庚基苯酚)和少量NaCl(經(jīng)450 ℃馬弗爐下灼燒6h)，用5mL二氯甲烷重復萃取2次，再氮吹，最后加衍生化試劑(BSTFA)和內(nèi)標用正己烷定容到0.5mL[13]。沉淀的藻泥用5mL二氯甲烷萃取，先用液氮凍融2次，再用細胞破碎儀破碎2次(每次5min，期間工作3s，間隔3s)，其后處理方法同上。

NP的定量分析采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(G1701DA，安捷倫科技公司，美國)，色譜柱為HP-5(30m×0.25mm×0.25μm)，采用選擇離子模式定量，進樣器和檢測器的溫度分別為280和300 ℃。測定過程升溫程序如下：初始溫度80 ℃，停留2min后，以20 ℃/min的速率升到100 ℃，再以10 ℃/min的速率升到200 ℃，最后以20 ℃/min的速率升到280 ℃，停留3min。

NP去除率和降解率的計算公式如下：

NP去除率(%) = (初始NP-培養(yǎng)液中殘余NP)/初始NP × 100%，

(1)

NP降解率(%)=(初始NP-培養(yǎng)液中殘余NP-藻細胞吸收/吸附NP-海藻酸鈉吸附NP)/初始NP×100%，

(2)

固定化藻珠組的NP生物降解率(%)=固定化藻珠組NP降解率-固定化空白珠組NP降解率，

(3)

自由藻細胞組的NP生物降解率(%)=自由藻細胞組NP降解率-對照組NP降解率。

(4)

1.6統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析，運用參數(shù)方差分析和多重比較檢驗不同處理組中NP濃度的差異顯著性，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著[14]。

2結果和討論

2.1 固定化對藻細胞生長生理活性的影響

處理過程中固定化藻和自由藻的生長情況如圖1。隨著處理時間的延長，2種處理藻的細胞密度與葉綠素a濃度均呈現(xiàn)上升趨勢；在2種NP濃度(1、10μg/L)暴露下，固定化藻組中細胞密度的比生長速率分別為1.10和1.30d-1，均低于自由藻細胞組(分別為1.64、1.51d-1)；在實驗時間內(nèi)，固定化藻的細胞密度均低于自由藻，而葉綠素a濃度正好相反。由表1可知，固定化藻細胞中葉綠素a的含量明顯高于自由藻細胞，處理24h后兩組有明顯差異(P<0.05)。處理168h后，在低濃度和高濃度組固定化藻細胞中葉綠素a含量分別是自由藻細胞的2和1.5倍。

((a)(b)-NP初始濃度為1 μg/L的低濃度組；(c)(d)-NP初始濃度為10 μg/L的高濃度組。(a)(b)-Initial concentration of NP was 1 μg·L-1for low pollution load;(c)(d)-Initial concentration of NP was 10 μg·L-1for high pollution load.)

圖1自由藻細胞組和固定化藻珠組中三角褐指藻的生長曲線

Fig.1Growth curves ofPhaeodactylumtriconutumin free and alginate-immobilized microalgal cultures

上述結果表明在逆境條件下固定化藻細胞密度低于自由藻細胞，這是由于藻珠本身的光穿透力、營養(yǎng)吸收過程以及O2和CO2的擴散等因素造成的[15-17]。但是，經(jīng)過168 h的處理固定化藻細胞密度接近9×106cells/mL，說明三角褐指藻在固定化小球中依然可以生長良好。Trevan和Mak研究表明固定化可以提高三角褐指藻的合成代謝，改善了藻對遮蔭、光限制條件的不適應性，提高了固定化藻細胞中葉綠素a的濃度[18]。海藻酸鈉本身一般不會影響營養(yǎng)物質(zhì)的擴散，但營養(yǎng)物質(zhì)和CO2會先被海藻酸鈉球體最外層的藻細胞吸收，導致里層的藻細胞可吸收的營養(yǎng)源變少，從而導致固定化藻組中大部分藻細胞集中在藻珠表面[19-20]。

表1　低濃度組和高濃度組中固定化藻細胞與自由藻細胞中葉綠素a含量的比較

2.2 固定化藻珠處理組和自由藻處理組不同組分中NP的殘余量

對照組實驗結果表明NP在海水溶液中的自然降解率為30%左右。由表2可知，在低濃度和高濃度NP處理組中，隨著處理時間的延長固定化藻組和自由藻組中殘余在藻細胞中的NP含量均逐漸減少，說明藻細胞對NP有較高的降解能力。對于固定化空白珠組，2個濃度組中海藻酸鈉球體對NP均有較強的吸附能力。前人研究表明，海藻酸鈉球體對NP的吸附過程類似于對營養(yǎng)物質(zhì)的吸附，是一個簡單的物理化學過程，可以在較短時間內(nèi)完成[11]。Lang等的研究表明，NP與海藻酸鈉球體間的高分子間作用(氫鍵結合、疏水作用等)可以有效促進其對NP的吸收[21]。

表2　各處理組中NP在溶液、藻細胞以及海藻酸鈉中的殘余量

注：1. ND：未檢出；2. NA：無效值；3. 小寫字母代表在0.05水平下各處理組間的差異顯著性。1.ND：not detected；2.NA：not applicable；3.small letters mena significant difference at 0.05 level with each treatment

2.3 固定化藻細胞和自由藻細胞對NP的去除作用

固定化藻細胞對NP的去除過程包括海藻酸鈉球體的吸附、藻細胞吸收/吸附、藻細胞生物降解以及非生物降解過程，除了海藻酸鈉的吸附過程，自由藻細胞和固定化藻細胞去除NP的途徑相同。

2.3.1 吸收/吸附過程對NP的去除作用由圖2可知，2種NP初始濃度下，處理24 h后自由藻細胞中NP均出現(xiàn)了明顯的降低，去除率接近80%，其他兩個處理組去除率較低；96 h后，固定化藻珠組和自由藻細胞組對NP的去除已基本完成(都在90%左右)；處理168 h后,固定化空白珠組中NP也出現(xiàn)明顯的降低，去除率達到85%以上。

2.3.2 固定化藻細胞和自由藻細胞對NP的降解作用由圖2可知，自由藻細胞和固定化藻細胞對NP的降解率遠高于固定化空白珠。168 h后，固定化藻細胞組和自由藻細胞組中NP降解率均在95%以上，而固定化空白珠組只有40%左右。

固定化藻珠組的降解過程包括藻細胞的生物降解和非生物降解，而自由藻細胞的降解過程包括藻細胞的生物降解和自然降解。光照條件下藻對NP的生物降解作用主要包括3種情況：(1)藻光照后分泌的物質(zhì)或部分破碎后釋放的物質(zhì)會產(chǎn)生氫氧自由基和其他活性氧物質(zhì)從而促進NP的降解；(2) 藻光照后吸收的光能量轉給藻表面的NP，促進NP直接降解；(3)光照會促使部分藻類細胞壁破碎，破碎細胞中會有脂類物質(zhì)釋放到水中，這些脂類物質(zhì)也可能引發(fā)NP的降解[22]。根據(jù)表2以及公式(3)和(4)，可得固定化藻細胞處理168 h后，低濃度組和高濃度組中NP的生物降解率分別為60%和49%，自由藻細胞處理組中NP的生物降解率分別為70%和65%。

此外，固定化藻珠具有易于收獲、操作簡便、不易被雜菌污染等優(yōu)點，還可將收獲的藻珠進行資源化處理，如提取脂質(zhì)生產(chǎn)生物柴油、高蛋白飼料、沼氣等，具有一定的經(jīng)濟價值[31]。

因此，用固定化三角褐指藻去除污水中的NP是可行的。但是，在應用于實際污水處理之前仍需開展小試、中試等，以完善相關處理條件。

((a)(b)-NP初始濃度為1 μg/L的低濃度組(c)(d)-NP初始濃度為10 μg/L的高濃度組(小寫字母代表0.05水平下各處理組間的差異顯著性。small letters mean significant difference at 0.05 level with each treatment.(a)(b)-Initial concentration of NP was 1 μg·g-1for low pollution load;(c)(d)-Initial concentration of NP eas 10 μg·g-1for high pollution load.)

圖2固定化藻細胞和自由藻細胞對NP的去除率和降解率

Fig.2Removal and degradation of NP by free and alginate-immobilizedPhaeodactylumtriconutumcells

3結語

利用海藻酸鹽固定化三角褐指藻，固定化后藻的葉綠素a濃度有所提高。本文研究結果表明自由藻細胞和固定化三角褐指藻均能有效去除海水中的NP。處理96h后，低濃度組(1μg/L)和高濃度組(10μg/L)中NP去除率已接近100%；處理168h后NP降解率也達到95%以上。固定化藻珠具有操作簡單、易于收獲、耐雜菌污染等優(yōu)點，可見該技術應用于廢水處理，不僅可以解決藻水分離的難題，且藻類經(jīng)固定化后其代謝活性大大提高。因此固定化三角褐指藻在去除沿岸海水中的壬基酚具有潛在應用前景。

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責任編輯徐環(huán)

Removal and Degradation of Nonylphenol in Seawater by Immobilized MicroalgaePhaeodactylumttricornutum

CHAI Nan-Nan1, WANG Peng-Tao1, GUO Lei1, LI Zheng-Yan1,2

(Ocean University of China 1.College of Environmental Science and Engineering; 2.The Key Laboratory of Marine Environmental Science and Ecology, Ministry of Education, Qingdao 266100, China)

Abstract:Nonylphenol (NP) is a typical endocrine disruptor with estrogenic effects and it is widely distributed in aquatic environment. NP causes serious harm to physiology of various aquatic organisms, including reproduction, endocrine, immune, carcinogenesis and genetic toxicity. However, the technique research of NP removal in aquatic environment is limited. The efficiency of nonylphenol removal and degradation with alginate-immobilized microalgae Phaeodactylum triconutum is studied in comparison with its free microalgal cultures. Two initial concentrations of nonylphenol were set up in the experiment, i.e., 1μg/L and 10μg/L for low and high pollution load, respectively. The results show that both in the immobilized and free culture groups under two concentration conditions, cell density and chlorophyll a content showed a similar increasing pattern with seven days of treatment time; the removal and degradation percentage of NP in the immobilized and free culture groups reached about 95% over a treatment period of 168 h. With the convenience of handling and producing bio-energy, the immobilized microalgal system therefore provides a feasible tool for nonylphenol removal in seawater. Meanwhile, this study provided the scientific basis for removal and purification research of NP in natural water.

Key words:nonylphenol; Phaeodactylum triconutum; microalgal immobilization; biodegradation; aquatic environment

中圖法分類號：X703

文獻標志碼：A

文章編號：1672-5174(2016)01-116-07

作者簡介：柴囡囡(1990-)，女，碩士生，主要研究方向為水污染控制。E-mail：cnnkuaile2012@sina.com

收稿日期：2014-11-05；

修訂日期：2014-12-09

*基金項目：國家水體污染控制與治理科技重大專項(2013ZX07202-007)資助

DOI:10.16441/j.cnki.hdxb.20140363

引用格式：柴囡囡, 王朋濤， 郭蕾, 等.固定化三角褐指藻對海水中壬基酚的去除和降解作用研究[J].中國海洋大學學報(自然科學版)， 2016， 46(1)： 116-122.

CHAI Nan-Nan, WANG Peng-Tao, GUO Lei, et al. Removal and degradation of nonylphenol in seawater by immobilized microalgaePhaeodactylumtricornutum[J].Periodical of OceamVniersity of China,2016,46(1): 116-122.

Supported by Major Science and Technology Program for Water Pollution Control and Treatment(2013ZX07202-007)

**通訊作者：E-mail：zhengyan@ouc.edu.cn