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川芎嗪對(duì)土三七誘導(dǎo)的小鼠肝小靜脈閉塞病治療機(jī)制的研究*

陳哲1劉竟芳1朱洪怡2楊麗3霍繼榮2#

長沙市中心醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科1(410004)中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院消化內(nèi)科2湖南省人民醫(yī)院消化內(nèi)科3

背景：肝小靜脈閉塞病(HVOD)臨床上以肝腫大、黃疸、腹水和體重增加為特征，目前尚缺乏有效的治療手段。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪對(duì)土三七誘導(dǎo)的小鼠HVOD具有治療作用。目的：探討川芎嗪對(duì)土三七誘導(dǎo)的小鼠HVOD的治療機(jī)制。方法：將115只小鼠隨機(jī)分為土三七組(土三七濃縮煎液30 g·kg-1·d-1灌胃)、低劑量川芎嗪干預(yù)組(土三七濃縮煎液30 g·kg-1·d-1+川芎嗪100 mg·kg-1·d-1灌胃)、高劑量川芎嗪干預(yù)組(土三七濃縮煎液30 g·kg-1·d-1+川芎嗪200 mg·kg-1·d-1灌胃)和正常對(duì)照組(PBS 30 g·kg-1·d-1灌胃)，30 d后處死所有小鼠。行HE染色和Masson染色，以RT-PCR法和蛋白質(zhì)印跡法分別檢測(cè)肝組織中組織因子(TF)、核因子(NF)-κBp65、早期生長反應(yīng)因子-1(Egr-1) mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果：HE染色和Masson染色結(jié)果顯示川芎嗪可明顯改善HVOD小鼠肝組織病理損傷。土三七組TF、NF-κBp65和Egr-1 mRNA和蛋白表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；川芎嗪干預(yù)后，TF、NF-κBp65和Egr-1 mRNA和蛋白表達(dá)均不同程度下降(P<0.05)，以高劑量組下降更為明顯，而高劑量川芎嗪干預(yù)組與正常對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：川芎嗪可能通過下調(diào)NF-κBp65和Egr-1表達(dá)降低TF水平，阻止凝血系統(tǒng)活化，從而有效治療HVOD，且高劑量川芎嗪的療效更為確切。

關(guān)鍵詞肝靜脈閉塞性疾??；土三七；川芎嗪；組織因子；早期生長反應(yīng)蛋白質(zhì)1；NF-κBp65亞基

Mechanism of Therapeutic Effect of Ligustrazine on Hepatic Veno-occlusive Disease Induced by Sedum aizoon in Mice

CHENZhe1,LIUJingfang1,ZHUHongyi2,YANGLi3,HUOJirong2.

1DepartmentofGeriatrics,ChangshaCentralHospital,Changsha(410004);2DepartmentofGastroenterology,theSecondXiangyaHospitalofCentralSouthUniversity,Changsha;3DepartmentofGastroenterology,HunanProvincialPeople’sHospital,Changsha

Correspondence to: HUO Jirong, Email: 36444522@qq.com

Background: Hepatic veno-occlusive disease (HVOD) is a disease characterized by hepatomegaly, jaundice, ascites, weight gain and lack of effective treatment currently. Our prophase research showed that ligustrazine had therapeutic effect on Sedum aizoon induced HVOD in mice. Aims: To investigate the mechanism of therapeutic effect of ligustrazine on Sedum aizoon induced HVOD in mice. Methods: A total of 115 mice were randomly divided into 4 groups: mice in group A were intragastrically administrated with 30 mg·kg-1·d-1Sedum aizoon to induce HVOD and served as model group; mice in group B were given 30 mg·kg-1·d-1Sedum aizoon + 100 mg·kg-1·d-1ligustrazine and served as low dose ligustrazine intervention group; mice in group C were given 30 mg·kg-1·d-1Sedum aizoon + 200 mg·kg-1·d-1ligustrazine and served as high dose ligustrazine intervention group; mice in group D were given 30 mg·kg-1·d-1PBS and served as normal control group. After 30 days, all the mice were sacrificed. HE staining and Masson staining were performed for histological examination. The mRNA and protein expressions of tissue factor (TF), nuclear factor (NF)-κBp65 and early growth response factor (Egr)-1 in liver tissue were determined by RT-PCR and Western blotting, respectively. Results: HE staining and Masson staining histological examination showed that ligustrazine could obviously ameliorate the pathological injury of liver tissue in HVOD mice. Compared with group D, the mRNA and protein expressions of TF, NF-κBp65, Egr-1 were significantly increased in group A (P<0.05). After intervention with ligustrazine, the mRNA and protein expressions of TF, NF-κBp65, Egr-1 were significantly decreased (P<0.05), especially in group C, and no significant differences were found between group C and group D (P>0.05). Conclusions: Ligustrazine has therapeutic effect on HVOD, the possible mechanism is that ligustrazine could interrupt the activation of coagulation system by reducing the expression of TF via down regulating the expressions of NF-κBp65 and Egr-1, especially in high dose ligustrazine group.

Key wordsHepatic Veno-Occlusive Disease;Sedum aizoon;Tetramethylpyrazine;Tissue Factor;

Early Growth Response Protein 1;NF-kappa B p65 Subunit

肝小靜脈閉塞病(hepatic veno-occlusive disease, HVOD)指肝小葉中央靜脈和小葉下靜脈損傷導(dǎo)致管腔狹窄或閉塞而產(chǎn)生的肝內(nèi)竇后性門脈高壓癥，臨床上以肝腫大、腹水、體重增加和黃疸為特征[1]。國外臨床報(bào)道顯示HVOD多與骨髓移植前大劑量化療相關(guān)，發(fā)生率為10%~60%[2]。近年來，因誤服含吡咯烷類生物堿(pyrrolizidine alkaloids, PAs)的中草藥所致HVOD越來越受到重視，國內(nèi)臨床報(bào)道多與服用土三七有關(guān)。HVOD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，有文獻(xiàn)報(bào)道內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β等細(xì)胞因子的釋放導(dǎo)致凝血系統(tǒng)激活，可能在HVOD的發(fā)病過程中起有重要作用[3-4]。

川芎嗪是川芎的有效成分四甲基吡嗪，具有抗血小板聚集、降低血液黏滯度、改善微循環(huán)、擴(kuò)張血管、抗纖維化等作用。本課題組的前期研究[5]發(fā)現(xiàn)川芎嗪對(duì)土三七誘導(dǎo)的小鼠HVOD具有防治作用，且作用與劑量呈正相關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道，川芎嗪能有效抑制TNF-α介導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞組織因子(TF) mRNA表達(dá)[6]，而TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞TF表達(dá)主要由核因子(NF)-κB和早期生長反應(yīng)因子-1(early growth response factor-1, Egr-1)調(diào)控[7-8]。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)土三七誘導(dǎo)HVOD小鼠肝組織中TF及其轉(zhuǎn)錄因子NF-κBp65、Egr-1的表達(dá)，旨在從mRNA和蛋白水平探討川芎嗪對(duì)HVOD的治療機(jī)制，為臨床有效防治提供新靶點(diǎn)。

材料與方法

一、主要材料

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)雌性昆明小鼠115只，體質(zhì)量18~22 g，由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2. 藥物：土三七購自安徽省毫州市藥材總公司中藥公司，磨碎后水浸1 h，加適量水煎煮30 min，使?jié)饪s煎液相當(dāng)于生藥1 g/mL；川芎嗪購自河南輔仁懷慶堂制藥有限公司。

3. 主要試劑：Trizol(Sigma公司)，PCR Master Mix(Fermentas公司)，BCA蛋白定量試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，TF、NF-κBp65、Egr-1蛋白一抗(Santa Cruz公司)。

二、研究方法

1. 動(dòng)物模型和分組：小鼠正常飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組：①土三七組30只，給予土三七濃縮煎液30 g·kg-1·d-1灌胃；②低劑量川芎嗪干預(yù)組30只，給予土三七濃縮煎液30 g·kg-1·d-1+川芎嗪100 mg·kg-1·d-1灌胃；③高劑量川芎嗪干預(yù)組30只，給予土三七濃縮煎液30 g·kg-1·d-1+川芎嗪200 mg·kg-1·d-1灌胃；④正常對(duì)照組25只，給予PBS 30 g·kg-1·d-1灌胃。每周測(cè)量2次體質(zhì)量，30 d 后處死各組小鼠，取肝左葉部分組織置于液氮中保存待用。

2. 肝組織病理學(xué)評(píng)分[9]：按修改后的Deleve光鏡評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，包括中央靜脈內(nèi)皮損傷、中央靜脈內(nèi)皮下出血、肝竇內(nèi)出血、肝細(xì)胞凝固性壞死、中央靜脈內(nèi)皮下纖維化、中央靜脈外膜纖維化和肝竇纖維化7項(xiàng)，對(duì)肝組織行病理學(xué)評(píng)分。

3. 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)肝臟TF、NF-κBp65、Egr-1 mRNA表達(dá)：從GenBank中查閱檢測(cè)指標(biāo)的mRNA全長序列，用Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)(表1)，由武漢英韋創(chuàng)津公司合成。取凍存的肝組織，Trizol二步法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：TF：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性30 s，63 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，共29個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。NF-κBp65：94 ℃預(yù)變性 1 min；94 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。Egr-1：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。β-actin：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。取PCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳；用GelDoc 2000凝膠圖像分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司)進(jìn)行掃描，BandScan 5.0軟件進(jìn)行分析， 測(cè)定產(chǎn)物條帶的吸光度值， 以β-actin為內(nèi)參，行半定量分析，目的基因條帶相對(duì)表達(dá)量=目的基因條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

表1　PCR引物和產(chǎn)物長度

4. 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)肝臟TF、NF-κBp65、Egr-1蛋白表達(dá)：取肝組織100 mg，加入組織裂解液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。每份樣品取20 g蛋白，按4∶1的比例加入5×上樣緩沖液，95 ℃變性10 min后行SDS-PAGE電泳。PVDF膜半干轉(zhuǎn)移，1~2 mA/cm2恒流1~2 h。用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h。加入一抗(TF工作濃度為1∶400，NF-κBp65 1∶500，Egr-1 1∶200，β-actin 1∶4 000)，4 ℃過夜。TBST洗膜3次，每次10~15 min。加入工作濃度為1∶10 000的HRP標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育1 h。TBST洗膜3次，每次10~15 min。加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，暗室曝光，X片顯影。采用GelDoc 2000凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描，應(yīng)用BandScan軟件進(jìn)行吸光度分析，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果

一、肝臟病理學(xué)改變

HE染色可見正常對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列；土三七組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞以及不同程度的肝竇擴(kuò)張淤血、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、肝細(xì)胞壞死等；低劑量川芎嗪干預(yù)組部分肝小葉肝竇狹窄，且可見內(nèi)皮損傷、散在肝竇淤血等表現(xiàn)；高劑量川芎嗪干預(yù)組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，可見散在的肝竇淤血和內(nèi)皮細(xì)胞損傷，未見明顯肝竇狹窄(圖1)。Masson染色見正常對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，無纖維蛋白沉積；土三七組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝竇內(nèi)、中央靜脈內(nèi)皮下和外膜均可見纖維蛋白沉積；低劑量川芎嗪干預(yù)組肝竇內(nèi)、中央靜脈內(nèi)皮下仍可見纖維蛋白沉積，但數(shù)量較土三七組明顯減少；高劑量川芎嗪干預(yù)組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝竇周圍有少量纖維蛋白沉積(圖2)。與土三七組相比，低、高劑量川芎嗪干預(yù)組肝臟炎癥、出血、纖維化等病變均有不同程度減輕。

A：土三七組；B：低劑量川芎嗪干預(yù)組；C：高劑量川芎嗪干預(yù)組；D：正常對(duì)照組

圖1各組小鼠肝臟HE染色結(jié)果(×200)

A：土三七組；B：低劑量川芎嗪干預(yù)組；C：高劑量川芎嗪干預(yù)組；D：正常對(duì)照組

圖2各組小鼠肝臟Masson染色結(jié)果(×200)

二、TF、NF-κBp65、Egr-1 mRNA和蛋白表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示土三七組小鼠肝組織中TF、NF-κBp65、Egr-1 mRNA表達(dá)較正常對(duì)照組明顯增高(P<0.05)，川芎嗪干預(yù)后肝組織中TF、NF-κBp65、Egr-1 mRNA表達(dá)較土三七組顯著下降(P<0.05)，以高劑量干預(yù)組下降更為明顯，兩干預(yù)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2、圖3)。

組 別例數(shù)TFmRNA表達(dá)蛋白表達(dá)NF-κBp65mRNA表達(dá)蛋白表達(dá)Egr-1mRNA表達(dá)蛋白表達(dá)土三七組300.96±0.22*0.86±0.14*1.10±0.31*0.79±0.14*1.12±0.12*0.83±0.10*低劑量川芎嗪組300.84±0.16*▲0.78±0.15*▲1.02±0.20*▲0.74±0.11*▲1.02±0.27*▲0.73±0.08*▲高劑量川芎嗪組300.72±0.13#▲0.61±0.13#▲0.81±0.11#▲0.63±0.15#▲0.84±0.13#▲0.58±0.13#▲正常對(duì)照組250.64±0.120.53±0.100.78±0.140.58±0.050.75±0.110.52±0.10

*與正常對(duì)照組比較，P<0.05；#與低劑量川芎嗪比較，P<0.05；▲與土三七組比較，P<0.05

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示土三七組小鼠肝組織TF、NF-κBp65、Egr-1蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組明顯增高(P<0.05)，川芎嗪干預(yù)組肝組織中TF、NF-κBp65、Egr-1蛋白表達(dá)較土三七組顯著降低(P<0.05)，以高劑量干預(yù)組降低更為明顯，兩干預(yù)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2、圖4)。

M：Marker；泳道1：土三七組；泳道2：低劑量川芎嗪干預(yù)組；泳道3：高劑量川芎嗪干預(yù)組；泳道4：正常對(duì)照組

圖3各組小鼠肝臟TF、NF-κBp65、Egr-1 mRNA表達(dá)的電泳圖(RT-PCR法)

1 Da=0.992 1 u

A：土三七組；B：低劑量川芎嗪干預(yù)組；C：高劑量川芎嗪干預(yù)組；D：正常對(duì)照組

圖4各組小鼠肝臟TF、NF-κBp65、Egr-1蛋白的表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)

討論

土三七又名菊葉三七，產(chǎn)于四川、云南、廣東、江蘇、湖南等地，具有破血散瘀、止血、消腫等功效，是民間常用的治療跌打損傷和骨折的中草藥。近年來，有關(guān)誤服土三七導(dǎo)致HVOD的報(bào)道不斷增多，這可能與土三七中含有PAs相關(guān)。目前HVOD尚缺乏有效的治療手段，臨床多以對(duì)癥支持治療為主。有文獻(xiàn)報(bào)道，重組組織型纖溶酶原激活物(t-PA)、低分子量肝素、激素等對(duì)HVOD有一定的療效[10-11]，但部分患者會(huì)出現(xiàn)致命性出血等并發(fā)癥。去纖苷是近年的研究熱點(diǎn)[12-13]，其可通過促進(jìn)內(nèi)皮表面前列腺素E2(PGE2)、前列環(huán)素(PGI2)、血栓調(diào)節(jié)蛋白的產(chǎn)生，降低凝血酶和纖溶酶原激活物抑制因子1(PAI-1)水平，增加內(nèi)源性t-PA表達(dá)，從而達(dá)到保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、抑制纖維蛋白沉積的作用。對(duì)于重癥HVOD患者，應(yīng)考慮肝移植，但總體預(yù)后不佳。

HVOD的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。近年研究表明，凝血系統(tǒng)活性的改變?cè)贖VOD的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。PAs本身并無毒性，進(jìn)入機(jī)體經(jīng)肝臟代謝后，生成具有烯丙醇酯結(jié)構(gòu)的代謝產(chǎn)物，后者在體內(nèi)可產(chǎn)生細(xì)胞毒性，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷，釋放TNF-α、IL-1β、內(nèi)皮素-1(ET-1)等細(xì)胞因子。TNF-α、IL-1β具有促凝活性，可促進(jìn)TF、PAI-1等凝血活性物質(zhì)釋放[14-15]，從而導(dǎo)致機(jī)體處于高凝狀態(tài)。此外，血小板活化和纖維化相關(guān)因子，如轉(zhuǎn)化生長因子β1、Ⅲ型前膠原肽表達(dá)增多，最終導(dǎo)致受累小靜脈纖維沉積、閉塞，發(fā)生HVOD。TF是機(jī)體內(nèi)活性最強(qiáng)的促凝物質(zhì)之一，同時(shí)也是外源性凝血系統(tǒng)的啟動(dòng)因子[16]。在血管壁受損或某些病理性刺激下，如內(nèi)毒素、免疫復(fù)合物、補(bǔ)體成分等可刺激體內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞表達(dá)TF。體內(nèi)TF的表達(dá)主要受三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白-1、Egr-1和NF-κB調(diào)控。文獻(xiàn)[7-8]報(bào)道，TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞TF表達(dá)主要由NF-κB和Egr-1調(diào)控。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)土三七組小鼠TF、NF-κBp65、Egr-1 mRNA和蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組均明顯增加。不同劑量川芎嗪干預(yù)后，小鼠肝組織中TF、NF-κBp65、Egr-1 mRNA和蛋白表達(dá)均有所下降，以高劑量川芎嗪干預(yù)組下降更為明顯，且與正常對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示川芎嗪對(duì)土三七誘導(dǎo)的小鼠HVOD具有較好的治療作用，高劑量(200 mg·kg-1·d-1)更為有效。川芎嗪治療HVOD的機(jī)制可能與TF表達(dá)下調(diào)有關(guān)，通過下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子NF-κBp65和Egr-1表達(dá)，降低TF水平，從而抑制機(jī)體內(nèi)凝血系統(tǒng)的活化，達(dá)到有效治療HVOD的目的。

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(2015-06-13收稿；2015-06-30修回)

*基金項(xiàng)目：湖南省科技廳資助(2009FJ3102)

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2016.01.005

#本文通信作者，Email: 36444522@qq.com