胡瑞麗，倪建平，趙 笑，趙 慶，史 斌，趙桓震，趙斌安，趙 凱

（1上海師范大學(xué)，上海200234；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，上海201106；3上海佳牧生物制品有限公司，上海201106；4寧夏大學(xué)，銀川750021；5上海斯高勒生物科技有限公司，上海200233；6上?，B玨生物科技有限公司，上海201501；7上海博滿生物科技有限公司，上海201106；8上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室，上海201106）

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豬圓環(huán)病毒2型LAMP可視化快速檢測方法的研究

胡瑞麗1，倪建平2，3*，趙 笑4，趙 慶5，史 斌5，趙桓震6，趙斌安7，趙 凱2，8**

（1上海師范大學(xué)，上海200234；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，上海201106；3上海佳牧生物制品有限公司，上海201106；4寧夏大學(xué)，銀川750021；5上海斯高勒生物科技有限公司，上海200233；6上?，B玨生物科技有限公司，上海201501；7上海博滿生物科技有限公司，上海201106；
8上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室，上海201106）

摘 要：本研究旨在建立有效的針對豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）的診斷技術(shù)及開發(fā)試劑盒。采用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法（LAMP）檢測豬圓環(huán)病毒2型（PCV2），對PCV2的ORF2基因設(shè)計出3對特異性引物，擴增PCV2基因的最佳溫度和時間優(yōu)化到59℃孵育55 min。用該方法對臨床樣品進行檢測，LAMP檢測對PCV2的檢測限為10拷貝/μL，而常規(guī)PCR檢測法的檢測限為1 000拷貝/μL，表明LAMP檢測法靈敏度高。該檢測法不會與豬圓環(huán)病毒Ⅰ型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎的豬病毒和輪狀病毒發(fā)生交叉反應(yīng)。用建立起的LAMP檢測法對1 100個臨床樣品進行檢測，950個樣品被檢測出為陽性樣品。穩(wěn)定性試驗表明該試劑盒可以耐受至少40次的反復(fù)凍融。結(jié)果顯示，該方法建立的豬圓環(huán)病毒2型診斷方法靈敏度高，特異性強，穩(wěn)定性好。

關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒2型；環(huán)介導(dǎo)等溫擴增；檢測；診斷試劑盒

**通信作者，E-mail：kzhao118＠163" com

斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥（Post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）是由豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）引起的一種重要疾病，嚴(yán)重發(fā)病地區(qū)死亡率高達(dá)40％以上，殘存下來的病豬也極少康復(fù)。由于PCV2嚴(yán)重破壞豬的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致各種疫苗接種應(yīng)答效果差，免疫失敗，并且誘發(fā)其他疾病暴發(fā)［1-3］，例如，PCV2還與豬的傳染性先天性震顫、肉芽腫性腸炎、皮炎與腎病綜合征、豬呼吸綜合征、豬繁殖障礙、滲出性表皮炎和壞死性淋巴結(jié)炎等疾病有相關(guān)性［4］；因此，PCV2感染的早期診斷成為PMWS防治的新的策略，有必要開發(fā)出一種豬PCV2的定性、定量快速檢測方法用于PMWS的防控。

目前，PCV2的診斷主要依靠免疫學(xué)檢測技術(shù)和分子生物學(xué)檢測技術(shù)。由于免疫學(xué)技術(shù)自身敏感性和特異性較差，因此分子生物學(xué)檢測技術(shù)得到了迅速的發(fā)展。1）PCR技術(shù)是一種常規(guī)的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，其中常規(guī)PCR方法是常用的［5］，然而，在用PCR對生物樣品進行檢測分析中，由于存在PCR抑制劑，這使PCR的有效性受到了抑制［6-7］；2）ELISA檢測：由于抗原抗體反應(yīng)的專一性，每種基因產(chǎn)品都要開發(fā)和建立專門的檢測試劑和方法，要建立所有基因產(chǎn)品的蛋白質(zhì)檢測法工作量很大［8-9］；3）基因芯片檢測不僅需要昂貴的芯片制作系統(tǒng)，操作復(fù)雜、費時，對操作人員的專業(yè)素質(zhì)要求比較高，容易造成樣品污染。此外，實時定量PCR是定性和定量分析PCV2［10-13］較好的檢測方法，然而，這種檢測方法對實驗人員的要求很高而且需要昂貴的專業(yè)儀器；因此，快速、靈敏并且易于操作的現(xiàn)場檢測PCV2方法成為獸醫(yī)臨床的迫切需求。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是Notomi等［14］發(fā)明的一種新型的等溫核酸擴增技術(shù)。它具有快速高效、靈敏度高、特異性強、操作簡便、無需昂貴的擴增設(shè)備、結(jié)果鑒定直觀等特點，非常適合臨床檢測和大規(guī)模檢疫工作。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增較其他核酸擴增方法具有特異性，選擇性，快速的特點［15］。通過使用前部環(huán)形引物［16］改進環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法，該方法在醫(yī)院實驗室中快速診斷和在食源性病原微生物［17］的快速檢測中是較效的工具。已有報道Chen等［18］使用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法來檢測豬圓環(huán)病毒2型。在他們的研究中，只有4個引物且沒有添加甜菜堿。本研究中，包含1對環(huán)形引物在內(nèi)的6個引物對PCV2的不同區(qū)域進行擴增，補充和擴展了以前的PCV2 LAMP檢測方法；本研究的目的是用于PCV2的LAMP檢測，方法要具有高特異性，高靈敏度，快速且簡單易行的特點。

1 材料與方法

1．1 病毒來源

豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬圓環(huán)病毒Ⅰ型（PCV1）、豬細(xì)小毒病毒（PPV）、偽狂犬病病毒（PRV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、輪狀病毒（RV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）及豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）毒株均由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提供，所有的這些毒株用于LAMP檢測。

1．2 引物

基于PCV2（BJ0804株）ORF2基因（GenBank登錄號：EU921257" 1），按照環(huán)介導(dǎo)等溫擴增引物設(shè)計說明書PrimerExplorer V3，利用網(wǎng)頁軟件（http：//primerexplorer" jp/elamp3" 0" 0/index" html）設(shè)計出6個LAMP引物，分別是FIP、BIP、F3、B3，此外還添加了1對環(huán)形引物L(fēng)F和LB。其中的引物F3和B3還可以用于常規(guī)PCR反應(yīng)中，其靶序列長度為233 bp。設(shè)計的引物如表1。

1．3 主要試劑

Bst DNA PoLymerase、MgSO4為紐英倫（NEB）生物技術(shù)（北京）有限公司產(chǎn)品，Betaine（B2629）為Sigma公司產(chǎn)品，SYBR GreenⅠ為晶美生物工程有限公司產(chǎn)品。

1．4 病毒核酸的提取及鑒定

利用天根生化科技（北京）有限公司的DNA/RNA病毒基因組提取試劑盒（離心柱法）對DNA和RNA病毒基因組進行了提取和純化。最后加入20—35 μL DEPC水到吸附柱中，12 000 r/min離心1 min。將純化得到的DNA/RNA保存在－20℃。純化得到的RNA進行反轉(zhuǎn)錄。在20 μL反轉(zhuǎn)錄體系加入Template RNA（poly（A）＋RNA）、5×1st Strand Synthesis Buffer、dNTP Mixture、RNase Inhibitor、Oligo（dT）18或Random Primer、Reverse Transcriptase（M-MLV）（200 U/μL）和RNase-free H2O，室溫放置10 min后，放至42℃恒溫水浴鍋內(nèi)反應(yīng)1 h，反應(yīng)結(jié)束后置于冰中冷卻2 min。

1．5 病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒模板的制備

以豬圓環(huán)病毒2型BJ0804株為標(biāo)準(zhǔn)模板，F(xiàn)3和B3為上下游引物，按照PCR體系進行擴增，PCR反應(yīng)體系為25 μL體積包含：ddH2O 16" 5 μL，10×PCR buffer 2" 5 μL，dNTP 2" 0 μL，F(xiàn)3 1" 0 μL，B3 1" 0 μL，Taq ploymerase（Takara Corp"）1" 0 μL，1" 0 μL提取的DNA。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min，進入PCR反應(yīng)循環(huán)：95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進行35個循環(huán)，最后72℃總延伸5 min。

PCR產(chǎn)物的回收與純化按照Omega公司E" Z" N" A" GelExtractionKit說明書進行?；厥债a(chǎn)物與載體連接反應(yīng)參照pMD18-T vector的使用說明進行。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。采用菌落PCR法篩選陽性重組質(zhì)粒。參照3S Spin Plasmid Miniprep Kit V3" 1的說明書小量制備質(zhì)粒，并測其濃度，按照病毒學(xué)方法計算對應(yīng)的拷貝數(shù)濃度，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．6 PCV2 LAMP檢測方法的建立

根據(jù)引物Tm值，對LAMP反應(yīng)溫度（55—60℃）進行優(yōu)化，從多次重復(fù)試驗中確定最佳退火溫度。反應(yīng)時間按30 min、45 min、60 min、90 min、120 min優(yōu)化，多次重復(fù)試驗確定最佳反應(yīng)時間。

據(jù)反應(yīng)體系優(yōu)化策略，對MgSO4、Betaine、Bst DNA PoLymerase、dNTP、3對引物等成分分別進行了優(yōu)化。MgSO4（100 nmol/μL）的體積按0"6 μL、0"8 μL、1"0 μL、1" 2 μL依次遞增。Betaine（5 μmol/μL）的體積按3 μL、4 μL、5 μL、6 μL依次遞增。Bst DNA PoLymerase（8 U/μL）體積按0"6 μL、0"8 μL、1"0 μL、1"2 μL依次遞增。dNTP（25 mmol/μL）體積按3 μL、4 μL、5 μL、6 μL依次遞增。3對引物（FIP/BIP∶F3/B3∶LF/LB）按1∶2∶2、1∶4∶4、2∶1∶2、1∶1∶2、4∶1∶4、4∶2∶1、4∶4∶1通過正交試驗進行優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)體系。

1．7 PCV2 LAMP可視化試驗

LAMP反應(yīng)結(jié)束后，加入1 μL熒光染料SYBR Green I熒光染料，觀察陰性和陽性反應(yīng)體系顏色的變化情況。

1．8 LAMP檢測豬圓環(huán)病毒2型靈敏度的試驗

取豬圓環(huán)病毒2型質(zhì)粒倍比稀釋，采用優(yōu)化的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，檢測所建立LAMP方法的靈敏度，可視化觀察反應(yīng)情況：反應(yīng)結(jié)束后，加入1 μL熒光染料SYBR Green I，觀察陰性和陽性反應(yīng)體系顏色的變化情況。

1．9 LAMP檢測豬圓環(huán)病毒2型特異性試驗

檢測豬圓環(huán)病毒2型特異性試驗分別以CSFV病毒、PRRSV病毒、PRV病毒作為樣品，同時設(shè)立陰性對照，采用上面優(yōu)化的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，檢測所建立LAMP方法的特異性。

1．10 LAMP檢測豬圓環(huán)病毒2型穩(wěn)定性試驗

將上述試劑盒貯存于－20℃，在該溫度和室溫下反復(fù)凍融10次、20次、30次和40次后，觀察結(jié)果。

1．11 PCV2 LAMP可視化快速檢測試劑盒的應(yīng)用

委托上海博滿生物科技有限公司、上海斯高勒生物科技有限公司、上海珺玨生物科技有限公司在江蘇省、浙江省、上海市畜牧養(yǎng)殖場進行了推廣應(yīng)用。

2 結(jié)果與分析

2．1 ORF2基因的PCR擴增

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分析表明，擴增出了與ORF2相應(yīng)的約223 bp大小的特異片段，與預(yù)期結(jié)果相符。

2．2 重組質(zhì)粒的篩選

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)回收純化后，與克隆載體pMD18-2T連接轉(zhuǎn)化，然后挑取單個的菌落做擴大培養(yǎng)，以擴大培養(yǎng)的菌液為模板，F(xiàn)3和B3為引物分別做菌液PCR鑒定，擴增出約為223 bp大小的特異性條帶，結(jié)果和預(yù)期擴增的片段大小相符。

2．3 優(yōu)化的LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

經(jīng)過對LAMP反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度分別進行調(diào)整，反應(yīng)條件為59℃45 min。

利用上述優(yōu)化出的最佳反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間先對MgSO4、Betaine、Bst DNA PoLymerase、dNTP成分進行優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)體系為MgSO41" 2 μL、Betaine 4" 0 μL、Bst DNA PoLymerase 1" 0 μL、dNTP 3" 0 μL。最后用優(yōu)化好的體系和反應(yīng)溫度，反應(yīng)時間對引物進行優(yōu)化，確定出最佳引物比例組合FIP/BIP∶F3/B3∶LF/LB為4∶1∶4。

2．4 PCV2 LAMP反應(yīng)可視化結(jié)果的判定

反應(yīng)結(jié)束后，加入1 μL SYBR GreenⅠ熒光染料，陽性反應(yīng)管顏色變?yōu)榫G色，陰性反應(yīng)管不發(fā)生顏色變化，為橘紅色，由此可見LAMP反應(yīng)結(jié)果易判定（圖1），易于臨床推廣。

圖1　PCV2 LAMP反應(yīng)可視化結(jié)果Fig．1 Visual result of LAMP reaction for detection of PCV2

2．5 LAMP反應(yīng)的靈敏度

對PCV2質(zhì)粒按10倍梯度稀釋成以下6組濃度的樣品（拷貝/μL）：100，101，102，103，104，105，106。進行3次重復(fù)性試驗，結(jié)果在101—106拷貝樣品均有明顯綠色，最低DNA濃度為PCV2質(zhì)粒101拷貝，即建立的PCV2的LAMP檢測下限為101拷貝。該方法能在1 h內(nèi)報告樣品的檢測結(jié)果。PCV2的LAMP檢測方法靈敏度檢測結(jié)果圖2。

2．6 LAMP特異性試驗

PCV2的LAMP檢測方法特異性檢測結(jié)果見圖3。所有供試PCV2樣品和陽性對照中顏色反應(yīng)均為綠色，而在CSFV、PRRSV、PRV樣品中顏色反應(yīng)均為橘色，說明引物特異于PCV2樣品檢測。該方法能在1 h內(nèi)報告樣品的檢測結(jié)果。

注：3次重復(fù)性試驗；01—07：梯度稀釋的PCV2 DNA質(zhì)粒1拷貝/μL，101拷貝/μL，102拷貝/μL，103拷貝/μL，104拷貝/μL，105拷貝/μL和106拷貝/μL；08：陰性對照圖2　PCV2 LAMP檢測法靈敏度Fig．2 Sensitiveness of LAMP detection of PCV2

注：3次重復(fù)性試驗；第1列：PCV2質(zhì)粒；第2列：PCV2病毒樣品；第3列：CSFV病毒樣品；第4列：PRRSV病毒樣品；第5列：PRV病毒樣品；第6列：陰性對照圖3　PCV2基因LAMP法檢測的特異性Fig．3 Specificity of LAMP reaction for detection of PCV2 gene

2．7 LAMP穩(wěn)定性試驗

該試劑盒可以耐受至少40次的反復(fù)凍融，擁有較好的穩(wěn)定性。

2．8 豬圓環(huán)病毒2型臨床樣品檢測

用該LAMP試劑盒檢測1 100個血清樣品，看是否感染PCV2。結(jié)果檢出其中有950個臨床樣品感染PCV2。

3 結(jié)論與討論

目前已有關(guān)于PCV2 LAMP檢測方法的報道，何逸民等［19］、史利軍等［20］均做了PCV2的LAMP檢測方法的研究。成熟的LAMP檢測法對PCV2檢測是特異性的，其他的病毒沒有擴增產(chǎn)物。根據(jù)PCR和LAMP引物設(shè)計的結(jié)果得知PCV2的ORF2基因具有較高的特異性。LAMP檢測法對靶序列具有高特異性是因為在起始階段，6個獨立序列（F1c，F(xiàn)2，F(xiàn)3，B1c，B2和B3）能識別靶序列［21］，之前顯示4個獨立序列（F1c，F(xiàn)2，B1c和B2）在稍后階段擴增靶序列，而常規(guī)PCR檢測法只有1對引物去識別靶序列。與之前的研究最大的不同在于本研究中加入了1對環(huán)形引物，可使反應(yīng)速度提高1/3到1/2。

優(yōu)化后的PCV2 LAMP檢測方法的檢測限為10個拷貝，比常規(guī)的PCR檢測方法靈敏很多。LAMP檢測的靈敏度與之前報道的檢測其他病毒的靈敏度是一樣的，例如豬傳染性胃腸炎冠狀病毒，H5禽流感病毒，黃頭病毒［22-24］。當(dāng)LAMP檢測開始時，需要一些措施來防止假陽性的出現(xiàn)。盡管LAMP檢測方法對檢測PCV2臨床樣品是一個有效的方法，但是在LAMP檢測方法中實驗室污染是一個容易出現(xiàn)的問題。對于臨床樣品檢測，DNA提取步驟可以省略，血清樣品也可直接用于LAMP反應(yīng)中。與常規(guī)PCR檢測法相比，LAMP檢測法的靈敏度受到臨床樣品中的各種物質(zhì)影響較小。在LAMP檢測法中，這減少了時間、降低了試驗成本并簡化了很多繁瑣的步驟。最重要的是LAMP檢測法對各種物質(zhì)的超強耐受性使得該方法在小型醫(yī)院，實驗室，私人診所和養(yǎng)殖場普及成為可能。

在基于LAMP技術(shù)的豬PCV2現(xiàn)場可視化定性快速檢測方法中，優(yōu)化之后的LAMP檢測法能對PCV2進行可視化、現(xiàn)場快速檢測。與常規(guī)的PCR檢測方法相比，LAMP檢測法具有省時、低成本和易于操作等優(yōu)點。與他人建立的PCV2 LAMP檢測方法相比，LAMP反應(yīng)體系中添加了甜菜堿，可以加快解鏈速度。在引物中增加了環(huán)形引物，可使LAMP反應(yīng)時間減少一半。另外，不用提取樣品中的PCV2病毒DNA，可直接將豬血清作為模板進行LAMP反應(yīng)，因為LAMP檢測法對生物樣品的耐受性要優(yōu)于其他檢測方法，故在LAMP中可以省去DNA提取步驟［25］。儀器設(shè)備簡單，只需1臺水浴鍋，兩把移液器、1臺掌式離心機、1臺漩渦振蕩器，不需要PCR儀、電泳儀和凝膠成像儀，養(yǎng)殖戶只需花費1000多元錢就可以添置進行LAMP操作的所有設(shè)備，耗材便宜，不需提取樣品中的PCV2病毒DNA，直接將豬血清作為模板進行LAMP反應(yīng)，避免了DNA抽提試劑盒的使用，降低了成本；易于操作，一般人員只需稍加訓(xùn)練就可操作，所需時間少，于1 h內(nèi)就可完成試驗。因此養(yǎng)殖戶自己可以進行現(xiàn)場可視化快速檢測PCV2。

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（責(zé)任編輯：程智強）

Visual rapid detection of porcine circovirus type 2 by a loop-mediated isothermal amplification assay

HU Rui-li1，NI Jian-ping2，3*，ZHAO Xiao4，ZHAO Qing5，SHI Bin5，ZHAO Huan-zhen6，ZHAO Bin-an7，ZHAO Kai2，8**（1Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China；2Biotech Research Institute，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201106，China；3Shanghai Jiamu Biological Products Company Limited，Shanghai 201106，China；4Ningxia University，Yinchuan 750021，China；5Shanghai Scholar Biotech Company Limited，Shanghai 200233，China；6Shanghai Junjue Biotech Company Limited，Shanghai 201501，China；7Shanghai Bio-Full Biotech Company Limited，Shanghai 201106，China；8Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding，Shanghai 201106，China）

Abstract：In order to establish effective diagnostic technique and diagnostic kit for porcine circovirus type 2 （PCV2），a loop-mediated isothermal amplification（LAMP）assay was used to detect PCV2，three pairs of specific primers were designed for PCV2’s ORF2 gene，and the time and temperature conditions for amplification of PCV2 gene were optimized to be 55 min at 59℃" Testing clinical samples by this method showed that the detection limit for PCV2 was 10 copies/μL，whereas the conventional PCR detection limit was 1 000 copies/μL，indicating that the LAMP method was highly sensitive" The detection did not cross-react with PCV1，porcine reproductive and respiratory syndrome virus，porcine epidemic diarrhea virus，transmissible gastroenteritis’pig virus and rotavirus" When 1 100 samples were tested by the established LAMP method，950 samples were detected to be positive" The stability test showed that this kit could endure at least 40-time reiterative freeze-thaw" The above results indicated that thebook=24,ebook=29established method and diagnostic kit had high sensitiveness，strong specificity and good stability"

Key words：Porcine circovirus type 2；Loop-mediated isothermal amplification；Detection；Diagnostic kit

作者簡介：胡瑞麗（1989—），女，在讀碩士，研究方向：基因工程。E-mail：hrly524＠163" com；Tel：021-62203047

基金項目：上海市閔行區(qū)重大產(chǎn)業(yè)化專項（2014MH076）

收稿日期：2015-12-28

文章編號：1000-3924（2016）01-023-06

中圖分類號：S852" 65

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

*并列第一作者：倪建平（1963—），男，研究員，研究方向：畜牧獸醫(yī)。E-mail：nijianping＠126" com；Tel：021-37195863