劉秀花， 孔冠楠， 王莉， 宋兆齊，梁峰

(商丘師范學(xué)院 生物精煉河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南 商丘， 476000)

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木糖對(duì)產(chǎn)油假絲酵母油脂積累的影響

劉秀花， 孔冠楠， 王莉， 宋兆齊，梁峰

(商丘師范學(xué)院 生物精煉河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南 商丘， 476000)

摘要：微生物利用纖維質(zhì)材料生產(chǎn)生物燃料具有重要的意義.本實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離、篩選的一株產(chǎn)油假絲酵母進(jìn)行了油脂積累隨時(shí)間變化的觀察及木糖對(duì)菌體油脂積累影響研究.結(jié)果表明以40 g/L的葡萄糖為碳源時(shí)，假絲酵母細(xì)胞內(nèi)油脂隨時(shí)間變化先增加后減少；用不同濃度木糖代替葡萄糖，葡萄糖與木糖不同比例時(shí)碳源消耗均較大，而生物量則在碳源全為木糖時(shí)相對(duì)較少，細(xì)胞含油率在純木糖時(shí)卻最高，達(dá)到43.5%.因此木糖為碳源有利于假絲酵母油脂積累，可用此菌進(jìn)行玉米芯降解液的發(fā)酵.

關(guān)鍵詞：假絲酵母；木糖；糖消耗；生物量；油脂百分率

人類社會(huì)面臨化石能源枯竭、溫室氣體嚴(yán)重超標(biāo)、環(huán)境污染嚴(yán)重等全球問題，新能源的開發(fā)是解決目前嚴(yán)重問題的最理想的方法，綠色能源近年來生物領(lǐng)域的研究發(fā)展迅速，尤其是發(fā)現(xiàn)一些藻類、霉菌、酵母菌、細(xì)菌均存在產(chǎn)油菌種，粘紅酵母屬產(chǎn)油菌株中油脂含量最高的,能達(dá)到72%[1]，將生成的油脂轉(zhuǎn)換成生物柴油不僅有助于緩解能源問題，而且無污染；微生物油脂多是中性脂，并且微生物菌體如霉菌、酵母菌等有發(fā)酵周期短，易大批量生產(chǎn)，并可利用秸稈酸解液[2]進(jìn)行廢物利用，實(shí)現(xiàn)能源再生而成為研究熱點(diǎn).本實(shí)驗(yàn)研究假絲酵母利用葡萄糖積累油脂過程觀察，并探究假絲酵母利用木糖積累油脂的特征.

1材料與方法

1.1研究材料

供試菌種菌種，假絲酵母菌B(CandidaalbicanB).PDA培養(yǎng)基用于菌種活化和保存.GMY液體培養(yǎng)基，每升含磷酸二氫鉀8 g， 七水合硫酸鎂0.5 g， 酵母膏3 g，單糖40 g(葡萄糖或/和木糖)，pH5.5.

1.2研究方法

1.2.1蘇丹黑染色法與菌體內(nèi)油脂觀察

每24 h取出1 mL菌液于1.5 mL離心管進(jìn)行離心后加入0.5 mL蘇丹黑染液，混合均勻后靜置染色1 h，離心去染液，加水清洗，加70%酒精清洗一次，再加水清洗離心后用無菌水懸浮，進(jìn)行水裝片觀察[3].

1.2.2還原糖含量測(cè)定

還原糖含量采用DNS法[4].

1.2.3菌體生物量測(cè)定

將發(fā)酵完成的菌液4000 r/min離心5 min，收獲菌體，并無菌水洗3次，放入-20℃冷凍2 h，在冷凍干燥機(jī)中凍干24 h，取出用已恒重的稱量瓶稱重.

1.2.4油脂提取、油脂含量測(cè)定

提取油脂采用熱酸解法[5].含量測(cè)定采用質(zhì)量分析法，將提取的油脂用石油醚和乙醚轉(zhuǎn)移到小燒杯中，在105℃烘干箱中烘干2 h，放入干燥器中0.5 h后用分析天平稱重，反復(fù)幾次直到差值不超過0.01 g，利用燒杯裝油前后差值計(jì)算油重.

1.2.6菌體培養(yǎng)

用250 mL三角瓶分裝GMY液體培養(yǎng)基100 mL，經(jīng)滅菌后接種，24 h種子培養(yǎng)后，再以10的接種量轉(zhuǎn)接新鮮培養(yǎng)基內(nèi)，28 ℃，180 rpm條件下培養(yǎng)，不同時(shí)間點(diǎn)取菌體進(jìn)行顯微觀察優(yōu)質(zhì)積累情況，并收獲菌體用于生物量分析和憂患量分析.

2結(jié)果與分析

2.1菌體內(nèi)油脂積累過程及發(fā)酵液中殘?zhí)橇孔兓?/p>

為了研究假絲酵母B利用葡萄糖積累油脂情況，從液體培養(yǎng)第1 d開始，采取蘇丹黑染色法觀察菌體油質(zhì)積累情況，同時(shí)采用DNS法測(cè)定殘?zhí)牵瑏砀櫽^察油脂積累過程和殘?zhí)亲兓P(guān)系.如圖1所示，深藍(lán)色的部分是被蘇丹黑染色的油脂，由圖1可知菌體可呈現(xiàn)假絲狀，芽殖.

圖1　酵母菌體內(nèi)油脂顯微圖片F(xiàn)igure 1　the micrographs of lipid body in yeast cells (A～H：1～8day)

從圖1A到圖1C可以看出，菌體由細(xì)長(zhǎng)到個(gè)別體積變大，再到多個(gè)細(xì)胞體積變大；油脂從小塊兒到幾乎充滿菌體，是一個(gè)菌體和油脂的生長(zhǎng)過程.從圖1D到圖1F可以看出多數(shù)菌體被油脂幾乎充滿，油脂累積處在高峰.從圖1G到圖1H可以看出，膨大的菌體內(nèi)部被染色的油脂顏色淡化，甚至消失，油脂被利用.

每天檢測(cè)發(fā)酵液中殘?zhí)橇?，其變化如圖2所示.由圖2可知每升培養(yǎng)液中由最初的40 g，隨培養(yǎng)時(shí)間的增加逐漸減少，培養(yǎng)到第3、4 d時(shí)，糖消耗近一半，到第7、第8否d近乎消耗完全.由圖1和圖2顯示結(jié)果可知，綜合菌體內(nèi)油脂積累變化和發(fā)酵液中糖消耗量變化.在限氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，在菌株開始培養(yǎng)時(shí)油脂即開始積累，并隨著碳源的消耗，在培養(yǎng)第3 d，碳源消耗近半時(shí)，菌體體積變大，油脂持續(xù)生長(zhǎng)近乎充滿菌體，在培養(yǎng)到5、6 d時(shí)，多數(shù)菌體體積增加，油脂近乎充滿菌體，糖穩(wěn)步消耗，油脂積累處在高峰期；最后在培養(yǎng)7、8 d時(shí)碳源消耗殆盡，菌體內(nèi)油脂染色顏色開始變淺，菌體在培養(yǎng)基中糖不足時(shí)開始消耗體內(nèi)積累脂類.

2.2木糖對(duì)假絲酵母積累油脂的影響

基于對(duì)玉米芯降解液進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)生物柴油的目的，用玉米芯降解物木糖作為碳源探究假絲酵母利用木糖對(duì)油脂積累的影響；設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)是在限氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，碳源是葡萄糖與木糖比例為1∶0、1∶1、0∶1三組，考慮到生產(chǎn)周期不宜過長(zhǎng)，以及節(jié)約經(jīng)濟(jì)成本，則每組均從第3 d開始收獲菌體并提油直到第7 d為止研究殘?zhí)橇?、生物量及含油百分率的變化情況.

2.2.1不同木糖比殘?zhí)橇侩S時(shí)間變化

基于此假絲酵母為工程菌，存在木糖代謝途徑，即假絲酵母利用碳源轉(zhuǎn)化為油脂，因此每天對(duì)發(fā)酵液中殘?zhí)橇窟M(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖3所示，在每組糖比例下，隨時(shí)間增長(zhǎng)，各組糖含量均在減少，減少趨勢(shì)一致，消耗程度相當(dāng)，即在總糖為40 g/L時(shí)，到第7 d時(shí)均消耗近半，說明此株酵母菌可同時(shí)利用木糖與葡萄糖用于生長(zhǎng)代謝.

圖2　殘?zhí)橇侩S時(shí)間變化　　　　　　　　 圖3 不同比例葡萄糖和木糖培養(yǎng)條件下殘?zhí)橇侩S時(shí)間變化　　　　　　Figure 2 Residual sugar changes over time 　　　　　　　　　　 Figure 3　The change of sugar consumption over time

2.2.2不同木糖比例下對(duì)生物量的影響

假絲酵母利用葡萄糖和木糖生長(zhǎng)繁殖，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，碳源不斷消耗，菌體不斷增多，生物量形成情況如圖4所示，當(dāng)碳源全為葡萄糖時(shí)，每天收獲生物量均較多，葡萄糖∶木糖為1∶1時(shí)次之，當(dāng)為全木糖時(shí)，收獲生物量有明顯差異，即最少.有圖4顯示，假絲酵母利用以上三組不同糖比例時(shí)，糖消耗不存在顯著性差異，因此假絲酵母利用糖類除用于生長(zhǎng)外，更多的用于其他代謝.

經(jīng)F檢驗(yàn)，三組不同糖比例下生物量收獲從第3 d開始到第7 d，其中前兩組是第4、5 d不存在顯著性差異，但較第3 d有顯著性差異；第6、7 d不存在顯著性差異，但較第4、5 d有顯著性差異；而第三組是，第3、4、5 d不存在顯著性差異，第6、7 d亦不存在顯著性差異，但第6、7 d較前3 d有顯著性差異.說明葡萄糖存在時(shí)在前期生長(zhǎng)有助于菌體快速增殖，而全木糖時(shí)，菌體增殖較慢.

2.2.3不同糖比例對(duì)細(xì)胞含油量影響

由于菌體利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)除生長(zhǎng)外，大部分碳源用于積累油脂，在不同木糖比例下，油脂積累情況如圖5所示，由圖5可知，油脂百分含量在三組糖比例中從1∶0到1∶1到0∶1呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，即當(dāng)全為木糖時(shí)，每天相比較含油百分比均較高，在三組中油脂積累最好的時(shí)間第6 d時(shí)，全木糖的高達(dá)43.5%.另外，在前兩組中第3、4 d含油百分比均較低，并不存在顯著性差異，第5、6、7 d含油百分比達(dá)到高峰期，與前兩天相比有顯著性差異；而在第三組中第3 d含油百分比較低，從第4 d開始油脂積累較多，即第4、5、6、7 d較第3 d有顯著性差異，且第6 d為最佳油脂積累時(shí)期，此時(shí)由圖3、4可以看出糖消耗近半，生物量為5.6 g/L.

圖4　三種條件下生物量隨時(shí)間變化　　　　　　　　圖5　不同糖比例菌體油脂百分率隨時(shí)間變化Figure.4 The change of biomass over time in different 　　　　　　　Figure.5 The change of oil percentage of yeast over time in different 　　　　　　　proportion of sugar　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　proportion of sugar

3結(jié)論

此假絲酵母B油脂積累從對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期開始，在穩(wěn)定期油脂積累一直處于上升狀態(tài)，油脂在較長(zhǎng)一段時(shí)期處于積累高峰期，菌體可利用性強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)室其它實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證在發(fā)酵條件是180 rpm，28 ℃，250 mL三角瓶中裝液量50 mL，接種量10%，可使油脂積累達(dá)到50%；油脂產(chǎn)量達(dá)4.74 g/L；在用不同濃度木糖替代葡萄糖時(shí)，菌體仍生長(zhǎng)良好，但卻積累油脂百分比更高，并在最佳培養(yǎng)天數(shù)6 d時(shí)，油脂百分比高達(dá)43.5%.這在微生物能源方面有較好的發(fā)展前景，如利用一些農(nóng)作物秸稈，食物殘?jiān)纫恍╇y利用的生物質(zhì)，經(jīng)處理制成發(fā)酵液供給此菌體或其它一些真菌發(fā)酵產(chǎn)生油脂，并通過轉(zhuǎn)酯反應(yīng)生成柴油，可以緩解能源問題.

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[責(zé)任編輯：徐明忠]

Xylose impact on oil Candida lipid accumulation

LIU Xiuhua，KONG Guannan，WANG Li,SONG Zhaoqi,LIANG Feng

(Biorefinery Engineering Lab of Hena Province, Shangqiu Normal University, Shangqiu 476000, China)

Abstract:Microorganism use of cellulosic materials to produce biofuels has the vital significance.This experiment in laboratory, screening of strain isolated oil Candida for lipid accumulation of observation over time and xylose research effects on bacteria lipid accumulation.The results showed that 40 g/L glucose as carbon source, Candida yeast cells grease increase first and then decrease along with time variation; With different concentration of xylose do carbon source instead of glucose, glucose and xylose consumption were all bigger, and the biomass in carbon source for xylose is relatively small, all lipid percentage of cells in pure xylose was the highest, up to 43.5%.Therefore xylose do carbon source benefits Candida lipid accumulation, the bacteria for corncob degradation liquid fermentation are available.

Key words:Candida;xylose;sugar consumption;biomass;kipid percentage

中圖分類號(hào)：O657.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-3600(2016)03-0048-04

作者簡(jiǎn)介:劉秀花(1963-)，女，河南新鄉(xiāng)人，商丘師范學(xué)院教授，主要從事微生物資源、酶制劑、生物能源方面的研究.

基金項(xiàng)目：河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)資助項(xiàng)目(No.132102310039、142102310044)

收稿日期：2015-12-23