崔巍巍, 高田林, 盧　應(yīng), 章培標(biāo), 劉　婭, 李　波

(1. 吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院, 2. 吉林大學(xué)第一醫(yī)院, 長春 130021;

3. 中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所, 長春 130022)

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n-Ag/AD/PLGA功能性材料的制備及生物學(xué)性能

崔巍巍1, 高田林1, 盧應(yīng)2, 章培標(biāo)3, 劉婭1, 李波1

(1. 吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院, 2. 吉林大學(xué)第一醫(yī)院, 長春 130021;

3. 中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所, 長春 130022)

摘要利用靜電紡絲技術(shù)制備了納米銀(n-Ag)/山莨菪堿(AD)/聚乳酸-乙醇酸(PLGA)功能性材料. 通過場發(fā)射掃描電子顯微鏡(ESEM)和傅里葉變換紅外光譜(FTIR)研究了材料的微觀結(jié)構(gòu)及組成, 評價了材料的體外藥物釋放、抑菌性、細(xì)胞相容性及細(xì)胞毒性. FTIR結(jié)果表明, 山莨菪堿已擔(dān)載到n-Ag/AD/PLGA材料中, 且隨著山莨菪堿含量的增加, n-Ag/AD/PLGA材料內(nèi)纖維的平均直徑逐漸增大. 藥物釋放試驗結(jié)果證明, 山莨菪堿可以逐漸釋放. 當(dāng)山莨菪堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%～5%時, n-Ag/AD/PLGA材料無毒性, 且有助于小鼠L929成纖維細(xì)胞的生長和增殖. 研究結(jié)果表明, n-Ag/AD/PLGA材料具有良好的抗菌性能和細(xì)胞相容性, 擔(dān)載的山莨菪堿可有效釋放, 為糖尿病足部感染的臨床治療提供新的人工敷料.

關(guān)鍵詞靜電紡絲; 敷料; 納米銀; 聚乳酸-乙醇酸; 山莨菪堿

糖尿病足部感染(DFIs)是一種發(fā)生在糖尿病患者踝關(guān)節(jié)以下部位, 以局部炎癥或化膿為主要特征(有時伴有全身性膿毒癥表現(xiàn))的臨床綜合征[1]. 山莨菪堿(AD)作為一種抗膽堿藥, 在臨床上用于糖尿病足部潰瘍的治療[2,3]. 研究發(fā)現(xiàn), 將敷料浸泡在含有山莨菪堿藥物的溶液中用于患者足部濕敷, 可改善患處組織血液供應(yīng), 促進局部微循環(huán), 有助于緩解靜脈淤血, 消除組織缺氧, 抑制粒細(xì)胞和血小板的聚集[4～6]. 但單純的靜脈滴注或局部涂抹均存在頻繁給藥、血藥濃度不易控制及易產(chǎn)生副作用等弊端, 可控的藥物緩釋技術(shù)有望解決這一問題.

聚乳酸-乙醇酸(PLGA)是無毒、無害且可降解的生物材料, 廣泛應(yīng)用于醫(yī)用支架材料的制備領(lǐng)域[7,8]. Zheng等[9～11]研究發(fā)現(xiàn), 采用靜電紡絲技術(shù)將PLGA與藥物共混制備具有超細(xì)纖維的可降解人工敷料, 不但有利于細(xì)胞的黏附和增殖, 而且擔(dān)載的藥物可緩慢釋放, 有助于提高藥物的生物利用率, 減少血藥濃度波動和毒副作用. 近年來, 將納米銀(n-Ag)作為抗菌成分用于功能性敷料的研制受到廣泛關(guān)注, 與其它抗菌藥物相比,n-Ag具有高活性、廣譜抗菌、抗缺氧及生理調(diào)節(jié)效能的優(yōu)點[11～13].

本文將n-Ag, AD與PLGA共混, 采用靜電紡絲法制備n-Ag/AD/PLGA復(fù)合材料, 研究了其抗菌性及生物相容性, 結(jié)果表明,n-Ag/AD/PLGA材料不僅具有良好的生物相容性和可降解性, 同時可緩慢釋放n-Ag和AD, 可實現(xiàn)廣譜抗菌、改善DFIs患者局部微循環(huán)障礙及促進潰瘍面修復(fù)和皮膚微血管再生.

1實驗部分

1.1試劑與儀器

PLGA[n(LA)∶n(GA)=80∶20], 黏均分子量85000, 由中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所合成; Poviargol納米銀(n-Ag), 粒徑60 nm, 俄羅斯科學(xué)院惠贈; 改良的伊格爾培養(yǎng)基(DMEM), Gibco公司; 細(xì)菌培養(yǎng)基(LB), Lennox公司; 標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(FBS), 北京元亨金馬生物技術(shù)開發(fā)有限公司; 胰蛋白酶, Gibco公司; 噻唑蘭(MTT), Solarbio公司; 瓊脂粉, 長春寶泰克生物科技公司; 氯仿, 純度99%, 北京化工廠; 山莨菪堿(AD)注射液, 濃度10 mg/mL, 天津藥業(yè)集團新鄭股份有限公司; 金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)和大腸桿菌(8099), 長春寶泰克生物科技公司.

高壓靜電發(fā)生器, 蘇州市吳縣東諸金屬涂裝設(shè)備廠; XL30 ESEM-FEG型場發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡(ESEM), 美國FEI公司; Infinite M200型多功能酶標(biāo)儀, 美國TECAN公司; CO2培養(yǎng)箱, Sanyo公司; 2000型傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR), 美國PerkinElmer公司.

1.2n-Ag/AD/PLGA材料的制備

將n-Ag均勻分散在氯仿中, 制成n-Ag質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的溶液A; 將PLGA溶解于溶液A中, 使PLGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%, 得到溶液B; 將不同質(zhì)量的山莨菪堿分散在溶液B中, 得到n-Ag/AD/PLGA靜電紡絲混合溶液C, 山莨菪堿在溶液C中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%, 5%和10%, 室溫下攪拌過夜. 靜電紡絲噴絲口直徑0.4 mm, 噴絲口和收集屏之間距離23 cm, 兩者之間施加30 kV靜電場電壓, 電紡絲溫度20 ℃, 8 h后在收集屏上得到n-Ag/AD/PLGA材料, 真空干燥48 h.

1.3n-Ag/AD/PLGA材料的藥物釋放

用全波長酶標(biāo)儀, 通過全波長掃描的方法檢測山莨菪堿的最大吸收波長, 繪制山莨菪堿溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線; 取100 mgn-Ag/AD/PLGA, 浸沒于10 mL的磷酸緩沖液(PBS)中, 于37 ℃以60 r/min的速度振蕩固定孵育, 分別于不同的觀察時間點取出1 mL的待測釋放液, 測量其吸光度值[14].

1.4n-Ag/AD/PLGA材料的抗菌性實驗

采用改良的K-B技術(shù)[15]評價n-Ag/AD/PLGA材料的抗菌性. 實驗前在LB培養(yǎng)基中進行菌種活化, 于37 ℃以90 r/min的速度振蕩12 h, 在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿表面滴加150 μL已活化的細(xì)菌菌液, 均勻涂抹, 晾干后, 將直徑為1 cm的圓形材料固定于瓊脂表面, 于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察抑菌情況.

1.5山莨菪堿的細(xì)胞增殖實驗

復(fù)蘇培養(yǎng)小鼠L929成纖維細(xì)胞系, 將L929細(xì)胞接種于96孔板, 細(xì)胞濃度為1×104Cell/孔, 于37 ℃和5% CO2條件下培養(yǎng)12 h; 除去培養(yǎng)液, 加入含有山莨菪堿的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng), 濃度分別為0.125, 0.25, 0.5, 1和2 mg/mL, 于24和96 h利用MTT法測定山莨菪堿對細(xì)胞增殖能力的影響, 細(xì)胞相對增殖率(RGR)按下式[16]計算:RGR(%)=(AExp/AControl)×100%式中:AExp為實驗組的吸光度值;AControl為空白對照組的吸光度值.

1.6n-Ag/AD/PLGA材料的細(xì)胞增殖及浸提液的細(xì)胞毒性實驗

將L929細(xì)胞以1×105Cell/孔的濃度接種于靜電紡絲的n-Ag/AD/PLGA材料表面, 在37 ℃, 5% CO2條件下培養(yǎng), 用MTT法分別在24和96 h測定細(xì)胞在材料表面的生長及增殖情況. 根據(jù)GB/T16886.5[17]對材料浸提液進行細(xì)胞毒性評價.

1.7統(tǒng)計學(xué)分析

用ImageJ軟件計算纖維的平均直徑, 用SPSS16.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析, 所有數(shù)據(jù)均以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示, 組間比較采用單因素方差分析, 當(dāng)P<0.05時, 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.

2結(jié)果與討論

2.1n-Ag濃度的選擇

Fig.1　Antibacterial test results against E. coli(A) and S.aureus(B) on n-Ag/PLGA fibers with different contents of n-Ag after 24 h incubation Mass fration of n-Ag(%): a. 0; b. 2; c. 4; d. 8.

Cui等[11]發(fā)現(xiàn), 當(dāng)n-Ag粉體在PLGA纖維膜中質(zhì)量分?jǐn)?shù)達到1%以上時, 對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性大腸桿菌具有抗菌活性, 隨著濃度升高, 抗菌性能增強; 但當(dāng)n-Ag含量達到5%和10%時, PLGA纖維膜具有輕微的細(xì)胞毒性. 本文選取n-Ag粉體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0, 2%, 4%和8%的n-Ag/PLGA靜電紡絲材料進行靜態(tài)抑菌環(huán)實驗. 結(jié)果表明(圖1), 單純PLGA靜電紡絲材料對細(xì)菌無抗菌效果, 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的n-Ag/PLGA靜電紡絲材料抑菌效果不明顯, 而當(dāng)n-Ag質(zhì)量分?jǐn)?shù)達到4%時, 靜電紡絲材料具有明顯的抑菌效果. 由于n-Ag質(zhì)量分?jǐn)?shù)達到5%時,靜電紡絲材料具有輕微細(xì)胞毒性.因此, 本文制備n-Ag/AD/PLGA靜電紡絲材料時, 選擇n-Ag在紡絲溶液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%, 既具備良好的抗菌性, 又無細(xì)胞毒性.

2.2n-Ag/AD/PLGA材料的微觀結(jié)構(gòu)

由ESEM結(jié)果(圖2)可見,n-Ag/AD/PLGA靜電紡絲材料內(nèi)部纖維互相交錯,形成遍布微孔的孔狀結(jié)構(gòu). 不同山莨菪堿含量的材料平均直徑不同,n-Ag/PLGA材料的平均直徑為(1.21±0.47) μm. 而隨著山莨菪堿濃度的增加(1%, 5%和10%),纖維的平均直徑呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢[(0.78±0.43), (0.82±0.35)和(1.31±0.49) μm]. 可見當(dāng)山莨菪堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達到10%時纖維的直徑最大.

Fig.2　ESEM images of n-Ag/AD/PLGA electrospun fibers(* P<0.05) 　Mass fraction of AD in n-Ag/AD/PLGA(%): (A) 0; (B) 1; (C) 5; (D) 10.　 (E) Average diameters of (A—D).

Fig.3　FTIR spectra of PLGA(a), n-Ag/PLGA(b) 　and n-Ag/AD/PLGA fibers(c)

靜電紡絲纖維直徑的改變和表面形貌的變化與電紡絲溶液的濃度、藥物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和電壓等因素有關(guān)[12]. 山莨菪堿的加入影響了PLGA在共混液中的濃度, 從而使纖維直徑變細(xì), 而隨著山莨菪堿含量的逐漸增加, 溶液電導(dǎo)率增加, 使射流穩(wěn)定長度變短; 同時, 由于藥物不溶于有機溶劑, 隨著藥物含量的增加, 加速了噴口阻塞速度, 影響噴口對纖維的拉神, 從而使纖維的直徑逐漸增大.

2.3n-Ag/AD/PLGA的體外釋放性能

Fig.4　Cumulative release curve of n-Ag/AD/PLGA　fibers with different contents of AD　Mass fraction of AD(%): a.1; b. 5; c. 10.

圖4給出n-Ag/AD/PLGA中山莨菪堿體外累計釋放曲線圖. 由圖4可以看出, 在釋放初期, 1%和5%的藥物釋放速度穩(wěn)定, 2 d后釋放速度明顯加快, 96 h時山莨菪堿幾乎全部釋放; 而山莨菪堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時, 在釋放初期釋放速度較快, 但沒有明顯的突釋現(xiàn)象, 隨著時間的延長, 藥物釋放逐漸平緩, 到192 h時, 山莨菪堿的釋放量達到約92.98%.

2.4n-Ag/AD/PLGA的抗菌性

靜態(tài)抑菌環(huán)實驗結(jié)果見圖5. 單純PLGA靜電紡絲纖維膜無抑菌效果, 而n-Ag/AD/PLGA均對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有良好的抑菌性, 說明山莨菪堿的加入并不影響n-Ag的抑菌活性.

Fig.5　Antibacterial test results against E. coli (A) and S. aureus(B) on fibers with different contents of 　AD after 24 h incubation and average diameters of inhibition ring(* P<0.05)(C)　a. PLGA; mass fraction of AD(%) in n-Ag/AD/PLGA: b. 0, c. 1, d. 5, e. 10.

Fig.6　MTT test of the cytotoxicity of different 　electrospun fibers(* P<0.05)　a. PLGA. Mass fraction of AD in n-Ag/AD/　PLGA(%): b. 0; c. 1; d. 5; e. 10.

2.5n-Ag/AD/PLGA的細(xì)胞毒性及細(xì)胞增殖情況

n-Ag/AD/PLGA浸提液的細(xì)胞毒性如圖6所示, 當(dāng)n-Ag 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%時,n-Ag/PLGA的RGR值大于75%, 無細(xì)胞毒性; 隨著n-Ag/AD/PLGA中山莨菪堿濃度的升高, L929細(xì)胞相對增殖率逐漸降低; AD質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%和5% 的n-Ag/AD/PLGA的RGR值大于75%, 無細(xì)胞毒性; 而當(dāng)山莨菪堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)達到10%時,n-Ag/AD/PLGA的RGR值小于75%, 且大于50%, 具有輕微的細(xì)胞毒性. 山莨菪堿的細(xì)胞增殖實驗結(jié)果表明, 高濃度的山莨菪堿對L929細(xì)胞增殖有一定的抑制作用, 同時通過釋放實驗推算, 24 h所釋放的山莨菪堿藥物量已達到抑制L929細(xì)胞增殖的濃度, 因此表現(xiàn)出輕微的細(xì)胞毒性.

Fig.7　Cell viability of L929 cells cultured on different 　electrospun fibers(* P<0.05)　a. PLGA. Mass fraction of AD in n-Ag/AD/PLGA(%): 　b. 0; c. 1; d. 5; e. 10.

在一定濃度下, 山莨菪堿對L929的增殖有一定的促進作用. 隨著培養(yǎng)時間的增加, 吸光度值升高, 細(xì)胞數(shù)量逐漸增多, 山莨菪堿對L929的促進作用更加明顯. 當(dāng)山莨菪堿濃度升高到1 mg/mL時, 抑制L929的增殖, 隨著山莨菪堿濃度繼續(xù)增高, 抑制作用更加明顯, 說明山莨菪堿濃度過高時, 對L929的增殖有一定毒性.

細(xì)胞增殖實驗結(jié)果(圖7)表明, 隨著培養(yǎng)時間的延長, 材料表面吸光度值升高(P<0.05), 細(xì)胞逐漸增多. 在相同培養(yǎng)時間下,n-Ag/PLGA吸光度值略低于對照組, 說明n-Ag沒有促進L929增殖的作用. 加入山莨菪堿之后, 當(dāng)山莨菪堿的含量在1%～5%時, 吸光度值略有提高, 但與n-Ag/PLGA相比, 沒有統(tǒng)計學(xué)差異, 說明在一定濃度范圍內(nèi), 山莨菪堿的加入沒有抑制L929細(xì)胞增殖的作用, 且相對n-Ag/PLGA有促進L929細(xì)胞增殖的趨勢. 當(dāng)山莨菪堿的含量增加到10%時, L929細(xì)胞成生長抑制, 說明高濃度的山莨菪堿不利于L929細(xì)胞的增殖, 這也與單純山莨菪堿細(xì)胞增殖實驗的結(jié)果相類似.

3結(jié)論

本文制備的n-Ag/AD/PLGA材料具有一定可控的藥物緩釋能力,n-Ag發(fā)揮了良好的抑菌性; 當(dāng)山莨菪堿含量在1%～5%時, 無細(xì)胞毒性, 作為功能性醫(yī)用敷料在糖尿病足治療中具有廣闊的臨床應(yīng)用前景.

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Preparation and Biological Evaluation of Electrospun

Nano-silver/Anisodamine/PLGA?

CUI Weiwei1, GAO Tianlin1, LU Ying2, ZHANG Peibiao3, LIU Ya1, LI Bo1*

(1.SchoolofPublicHealth, 2.FirstBethuneHospital,JilinUniversity,Changchun130021,China;

3.ChangchunInstituteofAppliedChemistry,ChineseAcademyofSciences,Changchun130022,China)

Abstract Nano-silver powders(n-Ag)/Anisodamine(AD)/poly(lactide-co-glycolide)(PLGA) were prepared by electrospinning. Field emission scanning electron microscope(ESEM) and Fourier transform infrared spectroscopy(FTIR) were applied for the investigation of the microscopic structure of the dressings as well as drug release, antibacterial and biological functions so that we could comprehensively evaluate the functionality of the dressings. The results show that the fibers exhibit a fully interconnected pore structure with narrow pore size distribution. And the diameters of electrospun fibers are influenced by the incorporation of AD. The result of drug release test proves that anisodamine can gradually release. It is also found that then-Ag/AD/PLGA dressings exhibit a well antibacterial ability. The cell experimental results show that when the content of AD is from 1% to 5%, the dressings are non-toxic and contribute to the growth and proliferation of mouse L929 cells. Therefore, we conclude that then-Ag/AD/PLGA dressing possesses good biocompatibility, antibacterial properties, and effectively release. It provides a new strategy for clinical treatment in diabetic foot infection.

KeywordsElectrospinning; Dressing; Nano-silver; Poly(lactide-co-glycolide); Anisodamine

(Ed.: W, Z)

? Supported by the Major Project of Science and Technology of Jilin Province, China(No.20130201005GX).

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收稿日期:2015-06-17 . 網(wǎng)絡(luò)出版日期: 2015-12-20.

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