秦莉花　李　晟葉麗芝黃　寬陳曉陽，2，3(湖南中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院，湖南　長沙　40208)

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高鹽飲食對更年期焦慮小鼠海馬鉀離子－氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)體2、鈉－鉀－氯離子失轉(zhuǎn)運(yùn)體1表達(dá)的影響

秦莉花李晟1葉麗芝1黃寬1陳曉陽1，2，3(湖南中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院，湖南長沙410208)

〔摘要〕目的研究高鹽飲食對更年期焦慮癥小鼠鉀離子－氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)體2( KCC2)、鈉－鉀－氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)體1( NKCC1)表達(dá)的影響。方法

將大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、4%高鹽飲食組、8%高鹽飲食組。其中4%高鹽飲食組、8%高鹽飲食組經(jīng)高鹽飲食干預(yù)1個月后，HE染色觀察腦部結(jié)構(gòu)，免疫組織化學(xué)觀察KCC2、NKCC1表達(dá)情況。結(jié)果高鹽飲食使更年期焦慮小鼠海馬區(qū)錐體細(xì)胞排列紊亂，神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，細(xì)胞輪廓模糊，出現(xiàn)大量的空泡現(xiàn)象，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞間隙明顯增大;模型組KCC2表達(dá)的陽性細(xì)胞明顯減少，高鹽飲食組陽性細(xì)胞極少;模型組NKCC1表達(dá)陽性細(xì)胞明顯增多，高鹽飲食組陽性細(xì)胞增多更明顯。結(jié)論高鹽飲食加重更年期焦慮癥的發(fā)生可能與KCC2及NKCC1之間的動態(tài)平衡被打破有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕高鹽飲食;更年期焦慮癥;鉀離子－氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)體2;鈉－鉀－氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)體1

1湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院2中藥現(xiàn)代化教育廳重點實驗室3國家中藥管理局藥性與藥效研究三級實驗室

第一作者:秦莉花( 1980－)，女，副教授，博士，主要從事更年期相關(guān)疾病研究。

更年期焦慮癥不僅影響患者的健康、社會關(guān)系、家庭生活等方面，還可引起其他精神障礙疾病，甚至產(chǎn)生自殺行為，且直接關(guān)系到老年期疾病的發(fā)生。因此其防治研究是臨床醫(yī)護(hù)人員乃至整個社會所面臨的重要任務(wù)。隨著年齡增長，人們味覺功能下降，在日常生活中表現(xiàn)為食物咸味重，研究表明我國人均吃鹽及人均每天食鹽攝入量均超標(biāo)〔1〕。本研究探討高鹽飲食對更年期焦慮小鼠鉀離子－氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)體2( KCC2)、鈉－鉀－氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)體1( NKCC1)的影響。

1材料與方法

1. 1實驗動物選用11月齡的昆明雌性小鼠，清潔級，體重35～45 g，由長沙市開福區(qū)東創(chuàng)實驗動物科技服務(wù)部代購，動物合格證號: scxk(湘) 2009－0012。飼料均來自于由長沙市開福區(qū)東創(chuàng)實驗動物科技服務(wù)部。

1. 2試劑與儀器羊抗鼠KCC2、NKCC1多克隆抗體購自美國Sigma公司。低溫大容量高速離心機(jī)(型號: KDC－2046低溫大容量離心機(jī)，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)科技實業(yè)有限公司) ;電子天平(型號: ES－C－600電子天平，湘儀天平儀器有限公司)。

1. 3分組連續(xù)5 d進(jìn)行小鼠陰道涂片檢查，呈現(xiàn)不規(guī)則動情周期的小鼠為自然更年期小鼠。將40只更年期小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、4%高鹽飲食組、8%高鹽飲食組。分組后空白組和模型組小鼠繼續(xù)給予普通飼料，4%高鹽飲食組小鼠予含4%的NaCl高鹽顆粒飼料，8%高鹽飲食組小鼠予含8%的NaCl高鹽顆粒飼料喂養(yǎng)，自由攝食，自由飲用自來水，連續(xù)1個月。

1. 4模型制備①高架十字迷宮模型:參照文獻(xiàn)〔2〕自制高架十字迷宮，測試方法參照〔2，3〕。②明暗箱:參照文獻(xiàn)〔2，4〕自制，測試測試方法參照〔2，3〕。③曠場實驗:參照文獻(xiàn)〔5〕自制，測試測試方法參照〔3，4〕。

1. 5 HE染色實驗第31天取材，麻醉灌注取腦，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)HE染色，脫水透明封固，制成切片，光學(xué)顯微鏡觀察。

1. 6免疫組織化學(xué)實驗第31天取材，麻醉灌注取腦，4%多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、透明、包埋，選擇海馬部位冠狀位連續(xù)冷凍切片。以SABC法進(jìn)行免疫組織化學(xué):加入0．3% H2O210 min，3%正常山羊血清封閉10 min;滴加一抗( 1∶100)，過夜(陰性對照組以正常羊血清替代一抗)，加入羊抗兔IgG、SABC，室溫放置2 h，PBS沖洗鋪片，DAB顯色劑顯色，脫水，封片。每只大鼠取3張切片，每張切片選取3個無重疊在顯微鏡(× 400)下觀察海馬區(qū)NKCC1、KCC2的表達(dá)情況。

1. 7統(tǒng)計學(xué)方法組間比較行t檢驗。

2結(jié)果

2. 1高鹽飲食對更年期焦慮癥小鼠腦部結(jié)構(gòu)的影響空白組海馬區(qū)細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核圓而大，核仁清晰可見，錐體細(xì)胞排列整齊，層次緊密;模型組海馬區(qū)錐體細(xì)胞排列較紊亂，神經(jīng)元數(shù)目減少，細(xì)胞輪廓較清晰，出現(xiàn)空泡現(xiàn)象，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞間隙相對增大;高鹽飲食組海馬區(qū)錐體細(xì)胞排列紊亂，神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，細(xì)胞輪廓模糊，出現(xiàn)大量的空泡現(xiàn)象，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞間隙明顯增大，8%高鹽飲食組表現(xiàn)比4%高鹽飲食組更明顯，見圖1。

2. 2高鹽飲食對更年期焦慮癥小鼠腦海馬KCC2表達(dá)的影響在高倍光學(xué)顯微鏡下，觀察細(xì)胞陽性著色情況，與空白組比較，模型組KCC2表達(dá)陽性細(xì)胞明顯減少，高鹽飲食組陽性細(xì)胞極少，且4%和8%高鹽組之間沒有明顯的差異。見圖2。

2. 3高鹽飲食對更年期焦慮癥小鼠腦海馬NKCC1表達(dá)的影響在高倍光學(xué)顯微鏡下，觀察視野范圍內(nèi)細(xì)胞陽性著色情況，與空白組比較，模型組NKCC1表達(dá)陽性細(xì)胞明顯增多，高鹽飲食組陽性細(xì)胞增多更明顯，但4%和8%高鹽組之間沒有明顯的差異。見圖3。

圖1高鹽飲食對更年期焦慮癥小鼠腦部結(jié)構(gòu)的影響( HE，×400)

圖2高鹽飲食對更年期焦慮癥小鼠腦海馬KCC2的影響( DAB，×400)

圖3高鹽飲食對更年期焦慮癥小鼠腦海馬NKCC1的影響( DAB，×400)

3討論

合理的飲食結(jié)構(gòu)是現(xiàn)代中醫(yī)護(hù)理中飲食護(hù)理的中心內(nèi)容之一。目前提倡合理的飲食結(jié)構(gòu)，雖根據(jù)每個人的機(jī)體狀況而有所不同，但總體而言首先應(yīng)避免偏嗜。早古代醫(yī)家就已強(qiáng)調(diào)飲食不宜過咸，應(yīng)少吃鹽?，F(xiàn)代文獻(xiàn)也報道食物與人的情緒有關(guān)，如多食咸味、甘味，使鹽、糖攝入過多，情緒容易激動。澳大利亞學(xué)者曾歷時10年的跟蹤調(diào)查結(jié)果顯示，飲食結(jié)構(gòu)與抑郁、焦慮等精神紊亂之間存在密切的關(guān)系〔5〕。

KCC2分布于神經(jīng)元細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)氯離子外排的主要因素，使Cl－由細(xì)胞內(nèi)移向細(xì)胞外，降低胞內(nèi)的Cl－濃度; NKCC1分布于上皮細(xì)胞和非上皮細(xì)胞膜上，則順著內(nèi)向Na梯度促使Cl－由細(xì)胞外移向細(xì)胞內(nèi)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Cl－堆積，故Cl－排出系統(tǒng)( KCC2)及Cl－聚集系統(tǒng)( NKCC1)之間的動態(tài)平衡決定中樞神經(jīng)系統(tǒng)中〔Cl－〕i。γ－氨基丁酸( GABA)產(chǎn)生興奮性和抑制性作用之間的進(jìn)行轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素在神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Cl－濃度差〔6〕，而功能相反的氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)體KCC2/ NKCC1是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)調(diào)節(jié)Cl－濃度差、調(diào)控GABA效應(yīng)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素〔7，8〕。研究表明，KCC2基因敲除的大鼠，其腦內(nèi)GABA的抑制作用下降〔9〕。NKCC1 mRNA表達(dá)增高及KCC2mRNA表達(dá)降低的變化可能引起神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Cl－濃度增高，Cl－梯度的崩潰，Cl－內(nèi)流減少，細(xì)胞膜超級化減弱，從而導(dǎo)致GABA能抑制作用的減弱，神經(jīng)元高興奮性，使癲癇易感性增加〔10〕。課題研究前期采用EPM、高架十字迷宮成功制備焦慮癥模型，且高鹽飲食可加重動物焦慮程度，減少其活動次數(shù)〔3〕，本研究結(jié)果顯示高鹽飲食加重更年期焦慮癥的發(fā)生可能與高鹽飲食使細(xì)胞內(nèi)外的Na+、Cl－水平發(fā)生改變，KCC2及NKCC1之間的動態(tài)平衡被打破，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4參考文獻(xiàn)

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10王德廣．氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)體KCC2和腦缺血的研究〔D〕．安徽:中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)，2005．

〔2014－09－09修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

通訊作者:陳曉陽( 1953－)，女，教授，主任醫(yī)師，碩士，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥藥性理論基礎(chǔ)與應(yīng)用、藥理研究。

基金項目:湖南省教育廳科研項目( No．12C0253)

〔中圖分類號〕R271. 19

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202( 2016) 02-0270-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 006