趙志敏　肖志娟　薛　茜鄒玉安王　靜(河北北方學(xué)院，河北　張家口　075000)

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康腦液對(duì)腦缺血再灌注大鼠血管內(nèi)皮生長因子mRNA及肝細(xì)胞生長因子mRNA表達(dá)的影響

趙志敏肖志娟薛茜1鄒玉安1王靜2(河北北方學(xué)院，河北張家口075000)

〔摘要〕目的探討康腦液對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠血管內(nèi)皮生長因子( VEGF) mRNA及肝細(xì)胞生長因子( HGF) mRNA的影響。方法大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組、康腦液高、中、低劑量組。栓線法復(fù)制SD大鼠大腦中動(dòng)脈缺血模型( MCAO)，采用原位雜交法觀察各組大鼠腦內(nèi)VEGF mRNA和HGF mRNA的表達(dá)，同時(shí)觀察康腦液對(duì)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能、腦梗死體積的影響。結(jié)果與模型組比較，尼莫地平組、康腦液各劑量組均能改善腦缺血大鼠的神經(jīng)功能缺失癥狀，縮小腦梗死體積，增強(qiáng)VEGF mRNA和HGF mRNA的表達(dá)( P＜0．05)，其中康腦液高、中劑量組作用強(qiáng)于尼莫地平組( P＜0．01)。結(jié)論康腦液能增強(qiáng)大鼠腦缺血再灌注后VEGF mRNA及HGF mRNA的表達(dá)，是其抗腦缺血的可能作用機(jī)制之一。

〔關(guān)鍵詞〕缺血性腦卒中;血管新生;康腦液;血管內(nèi)皮生長因子;肝細(xì)胞生長因子

1河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

2河北北方學(xué)院生命科學(xué)研究中心

第一作者:趙志敏( 1985－)，女，碩士，醫(yī)師，主要從事缺血性腦血管病藥理學(xué)研究。

在我國，缺血性腦血管病可占到致死因素的56．6%～80%，患者總?cè)藬?shù)可達(dá)500萬～600萬，存活者約有75%的高致殘率〔1〕。研究缺血性腦卒中腦損傷機(jī)制，尋找恰當(dāng)有效的治療方法是臨床與實(shí)驗(yàn)研究的主要任務(wù)之一?？的X液是益氣活血鼻祖方補(bǔ)陽還五湯結(jié)合現(xiàn)代人患病特點(diǎn)化裁而來，本實(shí)驗(yàn)從血管新生這一角度，探討其防治腦血管病的可能作用機(jī)制。

1材料與方法

1. 1藥品及試劑康腦液(由黃芪、丹參、川芎、葛根、鉤藤、三七粉等組方)，河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院制備并提供。除三七粉外，常規(guī)煎煮2次，再將兩煎的上清液混合，分別濃縮成400%、200%、100%康腦液(每毫升含生藥4、2、1 g)，4℃冰箱保存;尼莫地平片，規(guī)格: 20 mg×50片，生產(chǎn)批號(hào): 20121107，河北永豐藥業(yè)有限公司提供，用無菌蒸餾水溶解為0．1 mg/ml溶液;血管內(nèi)皮生長因子( VEGF)、肝細(xì)胞生長因子( HGF)原位雜交試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1. 2主要實(shí)驗(yàn)儀器自動(dòng)脫水機(jī)與石蠟切片機(jī)，均購美國Thermo產(chǎn)品;電腦生物組織包埋機(jī)，浙江金華科迪產(chǎn)品; CX21光學(xué)顯微鏡，日本Olympus產(chǎn)品。

1. 3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雄性成年SD大鼠156只，體重200～280 g，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物中心〔許可證號(hào)SCXK(京) 2011－0012〕。

1. 4動(dòng)物分組與給藥大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組、康腦液高、中、低劑量組，術(shù)后分別存活6 h，12 h，1 d，3 d，7 d，除假手術(shù)組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)1只外，其余各組均6只。于術(shù)前7 d，每天早晨灌胃給藥1次，最后一次給藥1 h后，實(shí)施腦缺血再灌注手術(shù)，術(shù)后繼續(xù)給藥，直至處死。給藥劑量按大鼠與人體表面積等效劑量折算，康腦液高、中、低劑量( 28．6，14．3，7．15 g·kg－1·d－1)，尼莫地平組1 mg·kg－1·d－1，給藥體積均為10 ml/kg，假手術(shù)組、模型組給予等體積生理鹽水。

1. 5模型制作參照文獻(xiàn)方法〔2〕，栓線經(jīng)右側(cè)頸外動(dòng)脈插入建立右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞( MCAO)模型，缺血2 h后再灌注，假手術(shù)組除不穿線外，其余操作同模型組及治療組。

1. 6神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分參照文獻(xiàn)等〔3〕5分制評(píng)分方法于大鼠腦缺血再灌注后24 h對(duì)各個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的神經(jīng)行為學(xué)進(jìn)行評(píng)分。0分:無神經(jīng)系統(tǒng)損傷癥狀; 1分:不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪; 2分:向左側(cè)轉(zhuǎn)圈; 3分:向?qū)?cè)傾斜; 4分:不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。1. 7 TTC染色及腦梗死體積測定于再灌注24 h后，每組隨機(jī)抽取6只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛過量麻醉后，快速斷頭取腦，置冰箱(－20℃)內(nèi)10 min后，去除嗅球、小腦和低位腦干，取冠狀面從前向后均勻切成2 mm厚腦片5片，將切片迅速置于2%TTC溶液( 37℃水浴)中避光條件下染色30 min。正常腦組織染成紅色，缺血區(qū)呈灰白色，界線清晰。4%多聚甲醛固定24 h。取出腦片，用數(shù)碼相機(jī)在同樣光性條件下拍照。照片用圖像分析系統(tǒng)Image Proplus 6．0計(jì)算每片腦組織的梗死面積、腦片面積。按照下列公式計(jì)算出每只大鼠腦組織的腦梗死體積百分比，腦梗死體積百分比=(腦片總梗死面積/腦片總面積)×100%。

1. 8 VEGF mRNA、HGF mRNA原位雜交檢測切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2室溫10 min滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水洗3次，加1%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶消化37℃10 min，原位雜交用磷酸鹽緩沖液( PBS)液沖3×5 min，蒸餾水1次，用0．1%DEPC處理的多聚甲醛后固定，室溫10 min，蒸餾水洗3次。預(yù)雜交:每張切片20 μl預(yù)雜交液，40℃3 h，吸去多余液體不洗。雜交每張切片滴加20 μl雜交液，蓋上原位雜交專用的蓋玻片，42℃過夜，37℃左右水溫2×SSC洗滌5 min×2，0．5×SSC 15 min×1，0．2×SSC 15 min×1，滴加封閉液，37℃30 min，甩去封閉液，滴加生物素大鼠抗地高辛，37℃1 h，原位雜交用PBS洗5 min×4，滴加SABC，37℃20 min，原位雜交用PBS洗5 min×3，滴加生物素過氧化物酶，37℃20 min，原位雜交用PBS洗5 min×4，DAB顯色15～25 min，輕度復(fù)染，脫水，透明，封片。在×400視野下計(jì)數(shù)，在梗死周邊區(qū)隨機(jī)選取10個(gè)互不重疊視野，以胞質(zhì)染成棕黃色為陽性細(xì)胞。

1. 9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17．0軟件行單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK法。

2結(jié)果

2. 1神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分及腦梗死體積比較尼莫地平組和康腦液各劑量組神經(jīng)功能評(píng)分均顯著低于模型組( P＜0．05)，康腦液高、中劑量組與尼莫地平組比較差異顯著( P＜0．01) ;康腦液各劑量組腦梗死體積顯著低于模型組( P＜0．05)，康腦液高、中劑量組與尼莫地平組比較差異顯著( P＜0．01)。見表1，圖1。2. 2 VEGF mRNA、HGF mRNA原位雜交結(jié)果VEGF mRNA陽性細(xì)胞主要分布于缺血壞死區(qū)周圍皮質(zhì)、側(cè)腦室、海馬齒狀回的神經(jīng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。在假手術(shù)組有少量表達(dá)，模型組VEGF mRNA陽性細(xì)胞數(shù)與假手術(shù)組比較差異顯著( P＜0．01)，康腦液各劑量組和尼莫地平組與模型組比較顯著升高( P＜0．05) ;康腦液高、中劑量組與尼莫地平組比較差異顯著( P＜0．01)。假手術(shù)組大鼠大腦皮質(zhì)僅見HGF mRNA少量表達(dá)，HGF mRNA陽性細(xì)胞呈棕黃色，模型組缺血半球皮質(zhì)HGF mRNA表達(dá)與假手術(shù)組比較顯著升高( P＜0．01)，康腦液高、中劑量組與模型組和尼莫地平組比較差異顯著( P＜0．01)。見表2、表3，圖2。

表1各組大鼠神經(jīng)功能和腦梗死體積比較(±s，n=6)

表1各組大鼠神經(jīng)功能和腦梗死體積比較(±s，n=6)

與假手術(shù)組比較: 1) P＜0．01;與模型組比較: 2) P＜0．05，3) P＜0．01;與尼莫地平組比較: 4) P＜0．01;與康腦液低劑量組比較: 5) P＜0．01，下表同

組別　　神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分(分)　　腦梗死體積( %)假手術(shù)組　0　0模型組　3．67±0．521)　39．67±2．341)尼莫地平組　2．50±0．553)　30．83±1．473)康腦液高劑量組　1．50±0．843) 4) 5)　24．33±2．503) 4) 5)康腦液中劑量組　1．50±0．553) 4) 5)　23．83±3．493) 4) 5)康腦液低劑量組　2．83±0．412)　33．50±1．763)

圖1各組大鼠腦組織TTC染色

表2各組大鼠大腦皮質(zhì)VEGF mRNA的表達(dá)(±s，n=6)

表2各組大鼠大腦皮質(zhì)VEGF mRNA的表達(dá)(±s，n=6)

組別　6 h　12 h　24 h　3 d　7 d假手術(shù)組　10．00±2．28　10．00±1．67　10．17±2．23　12．17±3．66　11．50±2．35模型組　14．50±1．871)　21．33±3．501)　19．33±2．071)　34．33±4．721)　41．00±3．581)尼莫地平組　19．17±2．233)　27．00±2．833)　24．67±4．273)　40．33±6．922)　48．83±2．933)康腦液高劑量組　24．00±3．953) 4) 5　32．17±3．193) 4) 5)　29．83±2．933) 4) 5)　47．50±3．993) 4) 5)　55．83±3．433) 4) 5)康腦液中劑量組　24．33±2．423) 4) 5)　34．83±4．173) 4) 5)　30．17±2．863) 4) 5)　48．17±3．763) 4) 5)　56．33±5．683) 4) 5)康腦液低劑量組　18．67±3．012)　25．50±2．592)　24．17±3．662)　40．00±2．972)　47．17±3．973)

±s，n=6)表3各組大鼠血管HGF mRNA的表達(dá)(

±s，n=6)表3各組大鼠血管HGF mRNA的表達(dá)(

組別　6 h　12 h　24 h　3 d　7 d假手術(shù)組　3．83±0．75　4．17±1．17　4．50±1．38　4．83±2．86　5．67±1．37模型組　7．33±1．861)　9．67±1．631)　14．67±2．801)　24．50±2．881)　36．33±2．881)尼莫地平組　11．00±2．534)　13．33±2．802)　20．33±2．503)　29．00±3．902)　41．83±3．193)康腦液高劑量組　14．50±2．743) 4) 5)　17．67±2．423) 4) 5)　25．50±3．833) 4) 5)　34．83±3．823) 4) 5)　47．00±2．833) 4) 5)康腦液中劑量組　15．33±1．753) 4) 5)　18．17±2．643) 4) 5)　26．00±3．903) 4) 5)　36．17±3．313) 4) 5)　46．83±3．873) 4) 5)康腦液低劑量組　10．83±2．403)　12．83±4．022)　19．83±2．323)　28．67±3．502)　40．50±2．352)

圖2各組大鼠腦組織VEGF、HGF mRNA表達(dá)(×400)

3討論

腦缺血后，腦組織由于缺血、缺氧，缺血中心區(qū)細(xì)胞迅速壞死，半暗區(qū)神經(jīng)細(xì)胞處于低氧、低灌注狀態(tài)，及時(shí)恢復(fù)該區(qū)域血流供應(yīng)，有可能挽救潛在可逆的缺血腦組織，在時(shí)間和空間上阻止可逆向不可逆損傷病態(tài)發(fā)展，故挽救半暗帶可逆的神經(jīng)元是缺血性腦卒中治療成功的關(guān)鍵〔4〕。而半暗區(qū)血流的恢復(fù)有賴于側(cè)支循環(huán)的建立，血管新生是決定這些細(xì)胞存活的關(guān)鍵因素，與缺血性腦卒中病人的預(yù)后關(guān)系密切。腦缺血后，低氧作為一種信號(hào)激活VEGF/VEGF受體系統(tǒng)，促使半暗帶VEGF高表達(dá)〔5〕，VEGF是一種內(nèi)皮細(xì)胞特異的有絲分裂原，通過與VEGF受體結(jié)合而發(fā)揮促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、促進(jìn)新生血管形成、增加血管通透性等生物學(xué)特性，有類似于血管源性的神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)營養(yǎng)作用〔6，7〕。近年研究發(fā)現(xiàn)，HGF是一種具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，可促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂，對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)的形態(tài)功能也具有重要意義。HGF通過與c－met受體結(jié)合而發(fā)揮作用，可以作用于多種類型靶細(xì)胞，HGF的生血管作用，主要是通過與其受體結(jié)合而直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞。在缺血損傷的組織中，HGF分泌增多，c－met受體上調(diào)，HGF可保護(hù)或促進(jìn)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)及增生，并加快側(cè)支循環(huán)的建立。康腦液為臨床經(jīng)驗(yàn)方，由黃芪、當(dāng)歸、丹參、川芎、葛根、鉤藤、三七粉等幾味中藥組成，黃芪補(bǔ)氣升陽、益衛(wèi)固表，為君藥;當(dāng)歸善于活血養(yǎng)血，有化瘀而不傷血之妙，為臣藥;川芎、葛根、三七、丹參等助當(dāng)歸活血化瘀，為佐藥;鉤藤引藥上行，為使藥，君臣佐使共奏補(bǔ)氣活血化瘀之功。其中幾種中藥的單方及鼻祖方補(bǔ)陽還五湯〔8～11〕研究表明，分別具有促進(jìn)血管新生和改善神經(jīng)功能的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示影響VEGF mRNA及HGF mRNA表達(dá)是康腦液抗腦缺血損傷的又一可能機(jī)制。

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〔2014－07－19修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)

通訊作者:薛茜( 1968－)，女，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事缺血性腦血管病研究。

基金項(xiàng)目:河北省衛(wèi)生廳課題基金資助項(xiàng)( 20090591)

〔中圖分類號(hào)〕R749

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202( 2016) 02-0274-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 008