歐　莉彭　成　衛(wèi)培峰高曉慶白　楊(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川　成都　637)

?

制首烏誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的“毒－證”機(jī)制

歐莉1彭成衛(wèi)培峰1高曉慶1白楊1(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川成都611137)

〔摘要〕目的研究制首烏誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的“毒－證”機(jī)制。方法皮下注射氫化可的松建立大鼠腎陽虛模型，分為空白對照組、腎陽虛低、中、高劑量組(分別予制首烏10．8，21．6，43．2 g/kg)。連續(xù)給藥14 d后處死大鼠，制備含藥血清。分別采用5，5'－二硫代雙( 2－硝基苯甲酸) ( DTNB)法和硫代巴比妥酸( TBA)法測定L02肝細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽( GSH)和丙二醛( MDA)的含量，并通過顯微鏡和電鏡觀察肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果制首烏腎陽虛各劑量組含藥血清(終濃度15%)作用24 h及48 h后，細(xì)胞內(nèi)T－GSH及GSH含量均有不同程度降低，其中腎陽虛中、高劑量組含藥血清作用48 h后，細(xì)胞內(nèi)GSH含量與空白對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異( P＜0．05) ;同時(shí)，GSH/GSSG比值與空白組比較，制首烏腎陽虛高劑量組含藥血清作用24 h及48 h后均出現(xiàn)顯著降低( P＜0．01)。給藥后，L02肝細(xì)胞密度變小，脫壁細(xì)胞增多，部分細(xì)胞出現(xiàn)壞死、裂解和形態(tài)改變;肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡，細(xì)胞器腫脹、破壞。結(jié)論制首烏非對證治療腎陽虛證候時(shí)，對肝臟具有一定毒性作用，腎陽虛證可能是制首烏肝毒性的靶向證候，故臨床使用時(shí)應(yīng)注意對證用藥，并嚴(yán)格控制制首烏的使用劑量和療程。

〔關(guān)鍵詞〕制首烏;肝細(xì)胞;凋亡

1陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院

第一作者:歐莉( 1980－)，女，博士，副教授，主要從事中藥藥效學(xué)及毒性機(jī)制研究。

何首烏為蓼科植物何首烏( Polygonum multiflorum Thunb．)的干燥塊根。清蒸或用黑豆煮汁拌蒸后曬干入藥為制何首烏，具有補(bǔ)益精血，固腎烏須的功效〔1〕。《本草匯言》中記載稱何首烏“生用氣寒、性斂、有毒;制熟氣溫?zé)o毒”，故歷代醫(yī)家均強(qiáng)調(diào)炮制入藥〔2〕。目前對何首烏的毒性均借用化學(xué)藥品毒性研究方法進(jìn)行研究，忽視了中醫(yī)基礎(chǔ)理論的指導(dǎo)作用，忽視了制首烏毒性(藥物偏性)與證候之間的關(guān)聯(lián)性。因此，制首烏肝毒性評價(jià)問題的關(guān)鍵，不只是在正常動物上評價(jià)其絕對毒性大小，更重要是在疾病模型動物上模擬臨床實(shí)際情況研究其合理用藥減(避)毒的途徑和機(jī)制。因此，本文以人正常肝細(xì)胞株L02為觀察對象，探討制首烏腎陽虛含藥血清誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的“毒－證”相關(guān)性，以期為預(yù)防制首烏導(dǎo)致藥物性肝損傷的發(fā)生提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1. 1材料

1. 1. 1細(xì)胞系及培養(yǎng)條件人正常肝細(xì)胞株L02購自湘雅中心實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫，在含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基，37℃、5%CO2及飽和濕度條件下進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，所有試驗(yàn)均在細(xì)胞對數(shù)生長期進(jìn)行。

1. 1. 2藥品與試劑RPMI1640完全培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶，均購自美國Gibco公司;噻唑藍(lán)( MTT)、二甲基亞砜( DMSO)，均購自美國Sigma公司;細(xì)胞丙二醛( MDA)檢測試劑盒及谷胱甘肽( GSH)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，批號分別為20140711及20140628;何首烏藥材購自四川成都荷花池藥材市場，批號: 1209341405，產(chǎn)地為四川，由陜西中醫(yī)學(xué)院中藥教研室衛(wèi)培峰教授鑒定。

1. 1. 3實(shí)驗(yàn)動物SPF級SD大鼠，購自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號: SCXK(陜) 2012－003，飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。飼養(yǎng)環(huán)境保持室溫20℃～25℃，相對濕度40% ～60%，實(shí)驗(yàn)動物自由進(jìn)食和飲水。

1. 1. 4儀器AE－21倒置顯微鏡，麥克奧迪公司; CB－150二氧化碳培養(yǎng)箱，德國Binder公司; DHG－9075 A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司; TGL－16G高速臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠; EX－8080酶標(biāo)儀，美國BIO－TEK公司。JEM－1230電鏡及Quantimet 570圖像分析儀，日本電子株式會社。

1. 2方法

1. 2. 1制首烏藥材及水煎液的制備將生首烏按照2010版藥典方法(清蒸法)進(jìn)行炮制〔1〕，隨后將制首烏分別按照高、中、低劑量進(jìn)行煎煮:將制首烏置于煎煮容器中，加入相當(dāng)于藥材量5倍的冷水浸泡60 min，煮沸30 min，再加入相當(dāng)于藥材量3倍的冷水繼續(xù)煎煮20 min后，煎煮液濃縮。

1. 2. 2制首烏含藥血清的制備SD大鼠40只，隨機(jī)分為4組，每組10只。其中3組大鼠皮下注射氫化可的松，1次/d，25 mg/kg，連續(xù)14 d，造成腎陽虛證模型〔5〕，另1組為生理鹽水組。隨后各組分別以高( 43．2 g/kg)、中( 21．6 g/kg)、低濃度( 10．8 g/kg)的制首烏水煎液及生理鹽水灌胃，每天給藥2次，連續(xù)7 d，末次給藥1 h后乙醚麻醉大鼠，無菌條件下心臟取血，立即注入無菌管里，室溫靜置，待血液凝固、血清析出后，吸取上清離心，3 000 r/min，10 min后再吸取上清，即得制首烏含藥血清。血清混合后，置于56℃水浴中滅活30 min，用0．22 μm的微孔濾膜過濾除菌。經(jīng)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)無微生物污染后，置于－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 3 L02肝細(xì)胞的培養(yǎng)及給藥將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清( FBS)的RPMI1640完全培養(yǎng)基5 ml，置37℃、5% CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，鏡下觀察細(xì)胞貼壁生長情況。取生長狀態(tài)良好的同一批傳代細(xì)胞，用0．25%胰蛋白酶－EDTA消化液消化，用10% FBS+1640培養(yǎng)液將細(xì)胞重懸，以每孔103～104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積為100 μl，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化。每實(shí)驗(yàn)各組分別加入15%的高、中、低濃度的制首烏含藥血清及正常大鼠血清，置37℃、5% CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h。

1. 2. 4測定胞內(nèi)GSH含量收集各實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞后將其懸浮于100 μl的PBS中，超聲破胞后3 500 r/min離心去除沉淀。上清液采用DTNB法檢測GSH含量。GSSG含量=( GSSG測定△A值) /( GSSG標(biāo)準(zhǔn)△A值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度/樣本測試前稀釋倍數(shù)。GSH含量=T－GSH含量－2×GSSG含量。

1. 2. 5測定胞內(nèi)MDA含量棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清，用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下，用移液器將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到塑料離心管中，加細(xì)胞提取液，混勻2 min，將細(xì)胞超聲破碎制成懸液，取樣0．1 ml于1．5 ml離心管中，漩渦混勻器混勻，95℃以上水浴40 min，取出后流水冷卻，4 000 r/min離心10 min，吸取0．25 ml各管反應(yīng)液加入到新的96孔板中，酶標(biāo)儀530 nm測定各孔吸光度。MDA含量=(測定OD值－空白OD值) /(標(biāo)準(zhǔn)OD值－空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度/樣本蛋白濃度。

1. 2. 6透射電鏡觀察肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)實(shí)驗(yàn)取生長狀態(tài)良好的同一批傳代細(xì)胞，對照組于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2 h，實(shí)驗(yàn)各組分別加入15%的高、中、低濃度的制首烏含藥血清培養(yǎng)48 h，空白對照組以空白組大鼠血清代替。用0．25%胰蛋白酶－EDTA消化液消化后收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗兩次，離心棄上清，立即加入4%戊二醛固定待用，1%鋨酸固定后再沖洗。用乙醇梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋制成電鏡切片，切片用枸櫞酸鉛－醋酸雙氧鈾染色后，透射電鏡下，每組各取4個(gè)不同的視野觀察肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)并記錄。

1. 3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS12．0軟件行單因素方差分析。

2結(jié)果

2. 1制首烏含藥血清對L02肝細(xì)胞形態(tài)的影響倒置顯微鏡下觀察，與空白對照組中L02肝細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞貼壁生長，呈梭形或多邊形，相鄰細(xì)胞連接成片，折光均勻。與空白對照組相比，15%的腎陽虛高劑量組含藥血清作用48 h后，細(xì)胞密度變小，脫壁細(xì)胞增多，部分細(xì)胞出現(xiàn)壞死、裂解和形態(tài)改變，見圖1。

圖1制首烏含藥血清作用48 h對L02肝細(xì)胞形態(tài)的影響(×400)

2. 2制首烏含藥血清對L02肝細(xì)胞胞內(nèi)T－GSH、GSH含量及GSH/GSSG比值的影響與空白對照組比較，制首烏腎陽虛各劑量組含藥血清作用24 h及48 h后，細(xì)胞內(nèi)T－GSH及GSH含量均不同程度降低，其中腎陽虛中、高劑量組含藥血清作用48 h后，細(xì)胞內(nèi)GSH含量與空白對照組比較出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異( P＜0．05) ;同時(shí)，與空白對照組比較，制首烏腎陽虛高劑量組含藥血清作用24 h及48 h后，GSH/GSSG比值均出現(xiàn)顯著降低( P＜0．01)，見表1。

2. 3制首烏含藥血清對L02肝細(xì)胞胞內(nèi)MDA含量的影響與空白對照組比較，制首烏腎陽虛低、高劑量組含藥血清作用24 h及48 h后，細(xì)胞內(nèi)MDA均增加明顯( P＜0．05) ;其中，腎陽虛高劑量組含藥血清作用48 h后，細(xì)胞內(nèi)MDA含量出現(xiàn)顯著性增加( P＜0．01)，見表2。

2. 4制首烏含藥血清對L02肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響正常肝細(xì)胞核大而圓，位于中央，核仁明顯，核膜清晰，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富。給藥后，部分細(xì)胞染色質(zhì)分解稀疏，細(xì)胞膜發(fā)生破損，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡，細(xì)胞器腫脹、破壞，細(xì)胞狀態(tài)差。腎陽虛中、高劑量組的部分細(xì)胞染色質(zhì)在核漿內(nèi)聚集成致密濃染的大小不等的團(tuán)塊狀，出現(xiàn)月牙樣邊集，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡。見圖2。

表1制首烏含藥血清對L02肝細(xì)胞胞內(nèi)T-GSH、GSH含量及GSH/GSSG比值的影響(±s，n=10)

表1制首烏含藥血清對L02肝細(xì)胞胞內(nèi)T-GSH、GSH含量及GSH/GSSG比值的影響(±s，n=10)

與同時(shí)間點(diǎn)空白對照組比較: 1) P＜0．05，2) P＜0．01;下表同

組別　　作用時(shí)間( h) T－GSH (μmol/L) GSH (μmol/L)　GSH/GSSG空白對照組　24　 95．12±25．40 89．84±16．77 34．07±11．73 48　 94．75±25．66 86．32±18．95　 20．41±6．82腎陽虛低劑量組　24　 86．93±27．29 73．69±21．42 11．18±5．762)48　 79．43±16．56 68．82±19．45　 12．95±5．34腎陽虛中劑量組　24　 90．21±19．33 80．31±19．20 16．24±7．801)48　 80．54±22．92 62．55±14．261)6．99±2．612)腎陽虛高劑量組　24　 76．46±19．82 66．57±15．481)13．46±8．542)48　 70．81±27．40 58．93±17．841)9．84±4．152)

表2制首烏含藥血清對L02肝細(xì)胞胞內(nèi)MDA含量的影響(±s，nmol/mgprot，n=10)

表2制首烏含藥血清對L02肝細(xì)胞胞內(nèi)MDA含量的影響(±s，nmol/mgprot，n=10)

組別　24 h　48 h空白對照組　2．33±0．16　2．57±0．43腎陽虛低劑量組　3．24±0．651)　3．19±0．481)腎陽虛中劑量組　3．15±0．94　3．43±0．621)腎陽虛高劑量組　3．56±0．891)　4．14±0．772)

圖2制首烏含藥血清對L02肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

3討論

目前在中藥新藥臨床前安全性評價(jià)時(shí)，在急性毒性實(shí)驗(yàn)和長期毒性實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用的并非是與藥物相應(yīng)的證候模型，而是在正常機(jī)體驗(yàn)證藥物的毒性。這種篩選方法不符合中藥“以偏糾偏”的特性，部分藥物會因?yàn)槠淦远谡C(jī)體上反映出毒性而被淘汰〔3〕。這種現(xiàn)象導(dǎo)致了現(xiàn)代方法指導(dǎo)下的中藥藥理毒理和中醫(yī)臨床用藥之間的偏差。從長遠(yuǎn)看，這對中藥研究的發(fā)展是不利的。中藥的現(xiàn)代研究只有將“有故無隕”等思想作為指導(dǎo)，體現(xiàn)中藥研究的“辨證”“證治”等特點(diǎn)才能與中醫(yī)臨床的辨證論治相結(jié)合，切實(shí)有效地指導(dǎo)臨床用藥〔4〕。

本文采用給大鼠注射外源性糖皮質(zhì)激素建立腎陽虛模型，動物出現(xiàn)一系列的“耗竭”現(xiàn)象，如拱背、蜷曲、肢尾冷、擠臥在一起、肛溫降低、雄性動物睪丸萎縮、反應(yīng)遲鈍、自發(fā)活動時(shí)間降低，被毛疏松，失去光澤(脫毛)，消瘦、尿液白濁等病理狀態(tài)。這些外觀的病態(tài)表現(xiàn)符合中醫(yī)陽虛證的臨床表現(xiàn)〔5〕。

GSH是細(xì)胞內(nèi)最重要的抗氧化物質(zhì)，而且大量存在于各種細(xì)胞之中，并在多種生理過程中起著重要的作用。GSH構(gòu)成細(xì)胞防御氧化損傷機(jī)制中的第一道防線，而且是普遍存在的細(xì)胞類型中的主要氧化還原緩沖劑，其含半胱氨酸的三肽可以減輕蛋白質(zhì)的二硫化，減輕自由基和內(nèi)毒素的毒性作用，并維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原的平衡。GSH可以中和氧自由基，其本身在GPX作用下被氧化成GSSG，后者通過NADPH，在谷胱甘肽還原酶作用下還原成GSH。在生理?xiàng)l件下GSH和GSSG形成動態(tài)平衡，維護(hù)著細(xì)胞氧化內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，因此檢測GSH和GSSG的變化可反映組織氧化還原狀態(tài)的改變〔6，7〕。機(jī)體通過酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，后者能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸( PUFA)，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并因此形成脂質(zhì)氧化物。氧自由基不但可通過生物膜中PUFA的過氧化引起細(xì)胞損傷，而且還能通過脂氫過氧化物的分解產(chǎn)物引起細(xì)胞損傷。過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中MDA的含量可以用來反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，同時(shí)也可間接地反映出細(xì)胞損傷的程度。

本研究結(jié)果表明制首烏腎陽虛含藥血清作用肝細(xì)胞48 h后，肝細(xì)胞內(nèi)GSH含量顯著降低，GSH/GSSG比值失衡，MDA含量明顯上升，線粒體氧化損傷明顯，抗氧化能力明顯降低。而且給藥后，肝細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)改變，部分細(xì)胞出現(xiàn)裂解壞死;肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡，細(xì)胞器腫脹、破壞，提示使用制首烏非對證治療腎陽虛證候時(shí)，對肝臟具有一定毒性作用，腎陽虛證可能是制首烏肝毒性的靶向證候，故臨床使用時(shí)應(yīng)注意對證用藥，并嚴(yán)格控制制首烏的使用劑量和療程。

4參考文獻(xiàn)

1國家藥典委員會．中華人民共和國藥典(一部)〔S〕．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010: 165．

2閆二磊，梁生旺．何首烏肝損傷的研究進(jìn)展〔J〕．廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2014; 30( 6) : 1－4．

3李會芳，邢小燕，金城，等．淺論“有故無殞，亦無殞”的內(nèi)涵及其在中藥安全性評價(jià)中的意義〔J〕．中醫(yī)雜志，2008; 49( 3) : 281－2．

4金磊，劉喜明．論黃帝內(nèi)經(jīng)/有故無殞亦無殞的含義及臨床意義〔J〕．陜西中醫(yī)，2013; 34( 2) : 206－7．

5劉欣，張冰，崔一然，等．基于垂體－靶腺軸相關(guān)指標(biāo)動態(tài)觀察氫考誘導(dǎo)大鼠陽虛狀態(tài)〔J〕．上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011; 25( 1) : 53－5．

6張照明，張海濤，袁利明．國內(nèi)谷胱甘肽研究進(jìn)展〔J〕．廣州化工，2009; 37( 3) : 55－7．

7牛磊，汪雋瑛，蔣瑾瑾．白三烯誘導(dǎo)人呼吸道上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激及谷氨酰半胱氨酸合成酶的作用研究〔J〕．臨床兒科雜志，2012; 30 ( 1) : 66－9．

〔2015－02－11修回〕

(編輯李相軍)

The mechanisms related "toxic-targeted syndrome" of medicated serum of Polygonum Multiflorum Thunb on apoptosis of L02 cells

OU Li，PENG Cheng，WEI Pei-Feng，et al.
College of Pharmacy，Chengdu University of TCM，Chengdu 611137，Sichuan，China

【Abstract】Objective To study the mechanisms related " toxic－targeted syndrome" of medicated serum of Polygonum Multiflorum Thunb( PMT) on apoptosis of L02 cells．Methods Rat models with deficiency of kidney－YANG were induced by hydrocortisone．The rats were divided into blank control，low dose( 10．8 g/kg)，middle dose( 21．6 g/kg)，high dose( 43．2 g/kg) groups of PMT，the rats were killed after administrated 14 d to prepare medicated serum of PMT．The contents of glutathione( GSH) and malondialdehyde( MDA) in L02 cells were tested by dithio－bis－nitrobenzoic acid( DTNB) and 2－Thiobarbituric acid( TBA)．The changes of morphology and ultrastructure of L02 cells were observed by microscope and electron microscope．Results Medicated serum of deficiency of kidney－Yang groups( 15%) obviously reduced the contents of T－GSH and GSH in L02 hepatocytes after treated 24 h and 48 h．The contents of T－GSH and GSH were differences between control group and high and middle dose groups( P＜0．05)．Meanwhile，compared with that of control group，the GSH/GSSG ratio of medicated serum of deficiency of kidney－Yang groups were both significantly reduced after treated 24 h and 48 h( P＜0．01)．L02 liver cell density was decreased，and more cells falling down from the inner wall of the cell culture flasks，and part of the cell became necrotic，lysis and changed morphology．The ultrastructures of L02 liver cell were also changed，such as empty cytoplasm and swelling organelle appeared．Conclusions The syndrome of deficiency of kidney－YANG might be targeting the liver toxicity syndromes of PMT．PMT should be used in the correct syndrome in clinical and strictly control clinical dose and duration of treatment．

【Key words】Polygonum multiflorum thunb; Hepatocyte; Apoptosis

通訊作者:衛(wèi)培峰( 1972－)，男，博士，教授，主要從事中藥毒性機(jī)制研究。

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目( 81373988)

〔中圖分類號〕R285. 5

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202( 2016) 02-0262-04;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 003