張　彬　陳麗紅　陳秀慧　林　瑤　(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，福建　福州　350005)

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大蒜素促進(jìn)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株( RL－952)細(xì)胞凋亡的機(jī)制

張彬陳麗紅陳秀慧林瑤(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，福建福州350005)

〔摘要〕目的探討大蒜素誘導(dǎo)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株( RL－952)細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制。方法人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株RL－952經(jīng)大蒜素或Janus激酶/信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄液活因子( JAK/STAT3)通路抑制劑AG490共培養(yǎng)后，MTT比色法檢測(cè)藥物對(duì)TL－952腫瘤細(xì)胞的抑制率;采用Real－time PCR和酶聯(lián)免疫吸附( ELISA)法檢測(cè)各組細(xì)胞中JAK/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白或mRNA及細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果大蒜素能夠劑量和時(shí)間依從性地抑制人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株RL－952的增殖;且大蒜素和AG490孵育人子宮內(nèi)膜癌RL－952細(xì)胞株后細(xì)胞內(nèi)JAK/STAT3轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白JAK和STAT3的表達(dá)明顯減弱，同時(shí)促細(xì)胞凋亡蛋白Bax、P53的表達(dá)明顯增高、抑制凋亡蛋白Bcl2表達(dá)明顯降低，且與對(duì)照組細(xì)胞差異顯著( P＜0．01)。結(jié)論大蒜素能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，且其可能的機(jī)制是通過抑制JAK/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)。

〔關(guān)鍵詞〕大蒜素;子宮內(nèi)膜癌;抑制率; JAK/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路;劑量依從性

子宮內(nèi)膜癌是臨床上最常見的婦科惡性腫瘤之一，且患者具有較差的預(yù)后〔1〕。近年來，子宮內(nèi)膜癌的多發(fā)病率和死亡率有逐年升高的趨勢(shì)，且常見于圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后的女性〔2〕。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能與激素的使用、糖尿病、肥胖等因素有關(guān)。子宮內(nèi)膜癌在臨床的極早期無明顯的癥狀，之后可能會(huì)出現(xiàn)不規(guī)則的陰道出血、陰道分泌物增加、不明原因的陣發(fā)性下腹痛以及腹部包塊等。Janus激酶/信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子( JAK/STAT3)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞內(nèi)的一條多細(xì)胞因子共同參與的途徑，其與MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路共同介導(dǎo)了細(xì)胞外刺激引起的多種腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移及凋亡的病理學(xué)過程。JAK/STAT3信號(hào)通路與多種惡性腫瘤的發(fā)生有密切相關(guān)性〔3〕。大蒜素主要存在于大蒜的鱗莖中，為三硫代烯醚類化合物，對(duì)多種致病菌均有抑制作用。同時(shí)，以往的研究也表明大蒜素具有防止肝纖維化、降低膽固醇和抗腫瘤的作用〔4〕。本研究主要對(duì)大蒜素誘導(dǎo)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株( RL－952)細(xì)胞凋亡過程的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行研究，為臨床上相關(guān)治療提供參考。

1材料與方法

1. 1材料與試劑人子宮內(nèi)膜癌RL－952購自美國典型物種保藏中心;細(xì)胞培養(yǎng)板為美國Costar產(chǎn)品;胎牛血清購自杭州四季青公司;青霉素和鏈霉素購自Sigma Aldrich公司; DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司; mRNA提取及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京天根生物技術(shù)有限公司;總蛋白提取試劑盒購自南京建成生物工程研究所;酶聯(lián)免疫吸附( ELISA)檢測(cè)相關(guān)試劑盒均購自美國OMEGA公司。

1. 2 RL－952細(xì)胞培養(yǎng)與研究分組RL－952細(xì)胞株在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中37℃，5%二氧化碳、飽和濕度培養(yǎng)條件下進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。將生長狀態(tài)良好的腫瘤細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、大蒜素低劑量處理組( 12 μg/ml)、大蒜素中劑量處理組( 24 μg/ml)、大蒜素高劑量處理組( 48 μg/ml)和AG490處理組( 10 mmol/L)。

1. 3四甲基偶氮唑鹽( MTT)試驗(yàn)將RL－952腫瘤細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中在1. 2的培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞生長良好后在各組細(xì)胞加入相應(yīng)藥物(大蒜素或AG490)培養(yǎng)24、48、72 h。然后棄去培養(yǎng)液并加入20 μl MTT溫孵4 h，在每個(gè)培養(yǎng)孔中加入二甲基亞砜( DMSO)振蕩溶解，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)空的吸光度，并計(jì)算細(xì)胞增殖的抑制率。抑制率=(對(duì)照組吸光度－試驗(yàn)組吸光度) /對(duì)照組吸光度×100%。

1. 4 ELISA法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)各組腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)后的蛋白提取均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行總蛋白的定量。ELISA法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1. 5 Real－time PCR檢測(cè)相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)mRNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄過程均按照說明書進(jìn)行操作。熒光定量PCR的擴(kuò)增體系為: 2×qPCR mix 5 μl，上游和下游引物分別為1 μl，cDNA 2 μl，去離子水1 μl。擴(kuò)增條件為: 95℃10 s，60℃40 s，共擴(kuò)增28個(gè)循環(huán)。采用△Ct計(jì)算各組mRNA的表達(dá)。

1. 6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS20．0軟件進(jìn)行方差分析、χ2檢驗(yàn)。

2結(jié)果

表1 MTT法檢測(cè)大蒜素和JAK/STAT3抑制劑AG490對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株RL-952細(xì)胞的抑制作用( %)

2. 1 MTT法檢測(cè)大蒜素對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株RL－952細(xì)胞的抑制作用表1可見，MTT法檢測(cè)證實(shí)大蒜素和JAK/STAT3通路抑制劑AG490均能夠?qū)θ俗訉m內(nèi)膜癌細(xì)胞株RL－952發(fā)揮增殖的抑制作用，且大蒜素具有抑制作用的時(shí)間依從性和劑量依從性。

2. 2大蒜素調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞JAK蛋白和mRNA的表達(dá)分析本研究發(fā)現(xiàn)大蒜素和AG490能夠有效抑制JAK蛋白和mRNA的表達(dá)水平，且與對(duì)照組相比差異顯著( P＜0．05，P＜0．01) ;同時(shí)，AG490組與低劑量和中劑量大蒜素組之間也具有顯著差異( P＜0．05，P＜0．01)。見表2。

表2 ELISA和Real-time PCR法檢測(cè)JAK蛋白和mRNA的表達(dá)(±s)

表2 ELISA和Real-time PCR法檢測(cè)JAK蛋白和mRNA的表達(dá)(±s)

與對(duì)照組比較: 1) P＜0．05，2) P＜0．01;與低劑量組比較: 3) P＜0．05，4) P＜0．01;下表同

組別　JAK蛋白/β－actin pJAK蛋白/β－actin JAK mRNA表達(dá)(△Ct)對(duì)照組　0．76±0．18　 0．53±0．08　 5．30±0．19大蒜素低劑量組　0．75±0．19　 0．55±0．04　 5．22±0．14大蒜素中劑量組　0．55±0．101) 3)　0．43±0．09　 4．54±0．111) 3)大蒜素高劑量組　0．35±0．082) 4)　0．39±0．11　 3．83±0．102) 4)AG490組　0．31±0．072) 4)　0．27±0．09　 3．67±0．082) 4)

2. 3大蒜素調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞STAT3蛋白和mRNA的表達(dá)分析大蒜素能夠有效提高ERK1/2蛋白的表達(dá)，且與對(duì)照組細(xì)胞的表達(dá)存在顯著差異( P＜0．05，P＜0．01)。見表3。

2. 4 ELISA法檢測(cè)p53、Bax及Bcl2蛋白的表達(dá)大蒜素和AG490能夠有效提高上調(diào)Bax和p53蛋白水平，抑制Bcl2蛋白表達(dá)，且與對(duì)照組細(xì)胞的表達(dá)存在顯著差異( P＜0．05，P＜0．01)。見表4。

表3 ELISA和Real-time PCR法檢測(cè)STAT3蛋白和mRNA的表達(dá)(±s)

表3 ELISA和Real-time PCR法檢測(cè)STAT3蛋白和mRNA的表達(dá)(±s)

組別　STAT3蛋白/β－actin pSTAT3蛋白/β－actin STAT3 mRNA表達(dá)(△Ct)對(duì)照組　0．89±0．15　 0．73±0．11　 7．30±0．21大蒜素低劑量組　0．85±0．19　 0．71±0．09　 7．21±0．15大蒜素中劑量組　0．75±0．131) 3)　0．63±0．10　 6．56±0．141) 3)大蒜素高劑量組　0．63±0．182) 4)　0．59±0．10　 4．83±0．162) 4)AG490組　0．51±0．142) 4)　0．47±0．11　 4．69±0．112) 4)

表4 ELISA法檢測(cè)p53、Bax及Bcl2蛋白的表達(dá)

2. 5大蒜素及AG490促進(jìn)細(xì)胞凋亡的DAPI染色法分析

DAPI染色后中、高劑量大蒜素組和AG490組腫瘤細(xì)胞存在部分皺縮、細(xì)胞內(nèi)可見部分凋亡小體，而小劑量雷帕霉素對(duì)細(xì)胞的形態(tài)基本無明顯影響，見圖1。

圖1大蒜素及AG490促進(jìn)細(xì)胞凋亡的DAPI染色法分析( bar=100 μm)

3討論

大蒜素為黃色或淡黃色油狀液體，具有多種生理學(xué)活性。以往的研究表明大蒜素能夠保護(hù)大鼠脊髓缺血再灌注損傷〔5〕、減輕甲基芐基亞硝胺誘發(fā)的食管癌〔6〕，并能有效調(diào)劑大鼠肺組織中水通道蛋白的表達(dá)〔7〕。本研究提示大蒜素能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，且其可能的機(jī)制是通過抑制JAK/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)。

JAK/STAT3信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)最主要的信號(hào)通路，與多種腫瘤的病理過程密切相關(guān)〔8〕。在對(duì)JAK/STAT信號(hào)通路與肝細(xì)胞性肝癌的腫瘤進(jìn)展和預(yù)后的相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)JAK/STAT信號(hào)通路的過度激活在肝癌的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用，且可以作為肝癌惡性程度及預(yù)后的重要參考指標(biāo)〔9〕。在對(duì)肝癌患者血清腫瘤標(biāo)志物含量檢測(cè)及其與腫瘤組織中JAK－STAT通路的關(guān)系研究時(shí)也發(fā)現(xiàn)肝癌患者血清中增殖和黏附分子、去乙?；负图谆D(zhuǎn)移酶的水平異常升高，這些分子可以作為肝癌的重要血清標(biāo)志物，而這些標(biāo)志物的水平與JAK/ STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活密切相關(guān)〔10〕。本研究表明JAK/STAT信號(hào)通路參與了大蒜素誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡過程。

大蒜素能夠有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，且能夠協(xié)同抗腫瘤藥物的殺傷腫瘤細(xì)胞的作用〔11〕。在分析大蒜素對(duì)大鼠自然殺傷( NK)細(xì)胞腫瘤殺傷活性的影響研究中發(fā)現(xiàn)大蒜素可能通過上調(diào)NK細(xì)胞分泌干擾素( IFN)－γ的水平，增強(qiáng)其體外腫瘤殺傷能力〔12〕。在大蒜素抑制腫瘤生長機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究中也證實(shí)大蒜素能夠通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子( VEGF)的表達(dá)、抑制腫瘤的血管生成來實(shí)現(xiàn)腫瘤生長的抑制作用〔13〕。大蒜素聯(lián)合順鉑對(duì)大鼠膀胱腫瘤生長抑制和誘導(dǎo)凋亡的實(shí)驗(yàn)研究也顯示大蒜素聯(lián)合順鉑可共同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，從而抑制膀胱腫瘤的生長，進(jìn)而改善大鼠的生存狀態(tài)〔14〕。

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〔2015－03－27修回〕

(編輯袁左鳴)

基金項(xiàng)目:福建省教育廳科技項(xiàng)目( No．JB08115)

〔中圖分類號(hào)〕R737. 33

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202( 2016) 02-0285-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 013

第一作者:張彬( 1973－)，女，碩士，副主任醫(yī)師，副教授，主要從事婦科腫瘤、婦科內(nèi)分泌研究。