呂冬霞　羅文哲　張淑紅　王長(zhǎng)山　薛　勇　(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江　佳木斯　154007)

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毛尖蘑粗多糖對(duì)H22荷瘤小鼠的抑廇作用及Bcl－2表達(dá)的影響

呂冬霞羅文哲張淑紅王長(zhǎng)山薛勇(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江佳木斯154007)

〔摘要〕目的探討毛尖蘑子實(shí)體粗多糖( MJMP)對(duì)H22荷瘤小鼠Bcl－2表達(dá)的影響。方法建立H22小鼠模型，隨機(jī)分為4組，對(duì)H22模型小鼠進(jìn)行MJMP處理，計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑瘤率，采用SP免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)小鼠腫瘤組織中Bcl－2蛋白的表達(dá);通過(guò)RT－PCR方法檢測(cè)腫瘤組織中Bcl－2 mRNA的表達(dá)。結(jié)果MJMP低、高劑量對(duì)小鼠H22移植腫瘤均表現(xiàn)抑制作用，腫瘤抑制率與陰性對(duì)照組比較差異顯著( P＜0．01) ;免疫組化證明，MJMP可減少Bcl－2蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞百分率，與陰性對(duì)照組比較差異顯著( P＜0．01) ;應(yīng)用RT－PCR方法表明，經(jīng)過(guò)MJMP處理后，Bcl－2 mRNA表達(dá)與陰性對(duì)照組比較明顯減弱( P＜0．01)。結(jié)論MJMP對(duì)H22腫瘤的抑制可能與Bcl－2 mRNA及蛋白低表達(dá)有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕毛尖蘑多糖; Bcl－2;凋亡; H22

肝癌常見(jiàn)的治療手段主要有手術(shù)治療、介入治療、放化療、生物靶向治療等方法〔1〕，但同時(shí)給機(jī)體帶來(lái)很多的不良反應(yīng)。真菌作為天然的藥物和食物，含有的菌類(lèi)多糖具有抗腫瘤作用〔2～4〕。本研究將毛尖蘑子實(shí)體提取的粗多糖( MJMP)作用于H22荷瘤小鼠，采用SP免疫組化學(xué)法和RT－PCR法檢測(cè)小鼠腫瘤組織中Bcl－2的表達(dá)，旨在探討MJMP抑制腫瘤的機(jī)制。

1材料和方法

1. 1材料毛尖蘑:大興安嶺呼瑪縣韓家園林業(yè)局松濤鹿苑公司;昆明種近交系雌性小鼠:佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào): SYXK黑2006－004，普通級(jí)，普通環(huán)境飼養(yǎng)) ; H22小鼠肝癌細(xì)胞株:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所。Trizol: Gibco公司;淋巴細(xì)胞分離液、紅細(xì)胞裂解液: Beyotime生物試劑公司;總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒:大連Takara生物公司;β－actin多克隆抗體:北京博奧森生物有限公司。環(huán)磷酰胺( CTX) :江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。

1. 2動(dòng)物分組與用藥常規(guī)造模，24 h后，隨機(jī)分組: MJMP(采用熱水浸提方法改良〔5〕)高劑量組、MJMP低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組( CTX)、陰性對(duì)照組(生理鹽水)。各組均灌胃的方式進(jìn)行藥物處理，藥物劑量均為0．2 ml/d，1次/d，連續(xù)給藥14 d。

1. 3腫瘤生長(zhǎng)抑瘤率的測(cè)定給藥14 d后，斷頸髓處死小鼠，無(wú)菌條件下剖取腫瘤實(shí)體，稱(chēng)重，計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑瘤率，腫瘤生長(zhǎng)抑瘤率= (陰性對(duì)照組平均腫瘤重量－給藥組平均腫瘤重量) /陰性對(duì)照組平均腫瘤重量×100%

1. 4免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織Bcl－2蛋白表達(dá)取小鼠腫瘤組織常規(guī)方法制備免疫組化切片。顯微鏡下觀察蛋白表達(dá)情況，隨機(jī)選擇5個(gè)視野細(xì)胞計(jì)數(shù)，進(jìn)行定量分析。蛋白表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞為明顯的棕黃色染色，而藍(lán)色細(xì)胞為陰性細(xì)胞。

1. 5 RT－PCR方法檢測(cè)腫瘤組織Bcl－2 mRNA的表達(dá)按說(shuō)明書(shū)要求提取腫瘤組織細(xì)胞總RNA，經(jīng)RNA鑒定后將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)引物為Bcl－2:上游5'－CCTGGCACCTGGCGGATAGC－3'，下游5 '－CGACTGAAGAGTGAGCCCAGCAGAAC－3，β－actin:上游5 '－AATGGGTCAGAAGGACTCCTATGTGG－3'，下游5'－CGCCTA GAAGCACTTGCGGTG－3'。以上PCR樣品取出后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析各條帶，依據(jù)各條帶的光密度和面積對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，以β－actin密度作為參考定量標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算Bcl－2/β－actin的值。

1. 6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS11．5軟件進(jìn)行方差分析( AVONA)、Q檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2. 1 MJMP對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用CTX及MJMP低、高劑量對(duì)小鼠H22移植腫瘤均表現(xiàn)抑制作用。陰性對(duì)照組小鼠的平均腫瘤重量為( 2．739±0．318) g，CTX組和MJMP低、高劑量組小鼠平均瘤重分別為( 1．132±0．187) g、( 1．508±0．240) g和( 1．242±0．217) g，比陰性對(duì)照組明顯減少( P＜0．01) ; MJMP低、高劑量組和CTX組的腫瘤抑制率分別是44．94%、54．65%和58．67%。

2. 2 MJMP對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤組織Bcl－2的蛋白表達(dá)Bcl－2陽(yáng)性表達(dá)為黃色陽(yáng)性細(xì)胞。CTX組〔( 40．12±7．62) %〕和高、低劑量組〔( 44．58±6．34) %、( 49．64±6．92) %〕較陰性對(duì)照組的Bcl－2〔( 66．33±7．59) %〕差異顯著( P＜0．01)，CTX組和CJMJ治療組Bcl－2陽(yáng)性細(xì)胞百分率表達(dá)均明顯減弱。

2. 3 MJMP對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤組織Bcl－2 mRNA的表達(dá)

1、陰性對(duì)照組; 2、低劑量組; 3、高劑量組; 4、CTX組圖1 RT-PCR法檢測(cè)H22小鼠腫瘤組織Bcl-2 mRNA的表達(dá)

見(jiàn)圖1。Bcl－2的mRNA表達(dá)在陰性對(duì)照組呈過(guò)表達(dá)( 0．25±0．02)，CTX組和MJMP組的Bcl－2 mRNA表達(dá)明顯減弱( 0．15± 0．03、0．16±0．02、0．21±0．02)。

3討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，MJMP和CTX能夠明顯抑制H22荷瘤小鼠肝癌實(shí)體瘤的生長(zhǎng)，其中低劑量MJMP的抑瘤作用低于CTX。肝癌細(xì)胞的Bcl－2基因高表達(dá)，可抑制肝癌細(xì)胞的凋亡，是肝癌形成的重要因素之一。Bcl－2可與線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相結(jié)合〔6〕。目前認(rèn)為Bcl－2主要通過(guò)以下幾個(gè)途徑體現(xiàn)抑制細(xì)胞凋亡的作用: ( 1) Ca2+在細(xì)胞內(nèi)的濃度升高可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中Bcl－2高表達(dá)，可抑制Ca2+在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管的釋放，從而影響了細(xì)胞凋亡; ( 2)線粒體上的Bcl－2通過(guò)抗過(guò)氧化反應(yīng)，保護(hù)脂質(zhì)膜和保持細(xì)胞的氧化狀態(tài)，抑制氧自由基的產(chǎn)生，來(lái)抑制細(xì)胞凋亡; ( 3) Bcl－2參與組成線粒體孔道，調(diào)節(jié)線粒體膜對(duì)凋亡蛋白前體的通透性，封閉Bax形成的孔道以達(dá)到保護(hù)細(xì)胞凋亡的目的; ( 4) Bcl－2和Bax兩種蛋白結(jié)合，可以抑制細(xì)胞凋亡; ( 5) Bcl－2還可以通過(guò)阻止線粒體中的細(xì)胞色素C釋放，阻斷Caspase蛋白酶的激活，阻止細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程，而抑制細(xì)胞凋亡; ( 6) Bcl－2還可能通過(guò)控制細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑來(lái)抑制細(xì)胞的凋亡〔7〕。有研究表明在肝癌細(xì)胞中Bcl－2的表達(dá)增高，細(xì)胞呈高分化，異型性明顯，提示Bcl－2高表達(dá)與肝癌細(xì)胞的高分化有一定的相關(guān)性〔8〕。因此去除或減弱Bcl－2基因產(chǎn)物達(dá)到治療的目的，成為肝癌基因治療的一個(gè)新靶點(diǎn)，肝癌患者的預(yù)后與Bcl－2基因及蛋白表達(dá)關(guān)系非常密切，臨床上可以指導(dǎo)有效、合理地治療，判斷肝癌的預(yù)后。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，MJMP能夠減少H22肝癌細(xì)胞中Bcl－2蛋白的表達(dá)，可能與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。

4參考文獻(xiàn)

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〔2015－06－09修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者:羅文哲( 1976－)，男，副教授，碩士，主要從事腫瘤發(fā)生機(jī)制與生物學(xué)治療研究。

基金項(xiàng)目:佳木斯大學(xué)重點(diǎn)研究項(xiàng)目( No．Sz2013－002)

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R730. 52

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202( 2016) 02-0298-02;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 020

第一作者:呂冬霞( 1965－)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤發(fā)生機(jī)制與生物學(xué)治療研究。