鄭惠惠,　江　洪

北京萬達(dá)因生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限責(zé)任公司, 北京 141017

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CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展

鄭惠惠,江洪*

北京萬達(dá)因生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限責(zé)任公司, 北京 141017

CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是目前重組糖蛋白生產(chǎn)的首選系統(tǒng)。隨著無血清懸浮培養(yǎng)技術(shù)、基因工程技術(shù)和大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用和不斷發(fā)展，CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)成為生物技術(shù)藥物最重要的表達(dá)或生產(chǎn)系統(tǒng)，并被廣泛應(yīng)用于抗體、重組蛋白藥物和疫苗等產(chǎn)品的研發(fā)和生產(chǎn)中。近年來，針對(duì)CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)在某些重組蛋白的表達(dá)和大規(guī)模生產(chǎn)中存在的不足，研究者們通過利用基因工程技術(shù)手段，結(jié)合重組蛋白表達(dá)機(jī)制的研究成果，為優(yōu)化和應(yīng)用CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)做出了不懈努力。從培養(yǎng)基的優(yōu)化、高產(chǎn)重組CHO細(xì)胞株的構(gòu)建、大規(guī)模培養(yǎng)三個(gè)方面綜述了CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的最近研究進(jìn)展，以期為CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的研究與應(yīng)用提供參考。

CHO細(xì)胞培養(yǎng)；細(xì)胞改造；重組抗原表達(dá)

CHO 細(xì)胞是由Puck于1957年建成的中國倉鼠卵巢成纖維細(xì)胞系。發(fā)展至今，CHO細(xì)胞已成為生物技術(shù)藥物最重要的表達(dá)或生產(chǎn)系統(tǒng)。隨著無血清懸浮培養(yǎng)技術(shù)、基因工程技術(shù)、生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)放大與強(qiáng)化技術(shù)、大規(guī)模高密度流加和連續(xù)灌注培養(yǎng)技術(shù)等的發(fā)展，CHO細(xì)胞系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于抗體、基因重組蛋白質(zhì)藥物、病毒疫苗等生物技術(shù)產(chǎn)品的研究開發(fā)和工業(yè)化生產(chǎn)中。

CHO 細(xì)胞是目前重組糖基蛋白生產(chǎn)的首選體系。因?yàn)樗哂袦?zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能，表達(dá)的蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面更接近于天然蛋白分子。但CHO細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中會(huì)出現(xiàn)活力差、分泌外源蛋白能力弱等問題。所以建立穩(wěn)定、高產(chǎn)的重組CHO細(xì)胞成為很多研究者的目標(biāo)。近年來，研究者從細(xì)胞營養(yǎng)、代謝、凋亡、信號(hào)傳導(dǎo)等角度，結(jié)合蛋白表達(dá)機(jī)制等研究成果，對(duì)這一目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)做出了很多努力。本文從培養(yǎng)基優(yōu)化、高產(chǎn)重組CHO細(xì)胞株的構(gòu)建、大規(guī)模培養(yǎng)三個(gè)方面綜述了CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的最新研究進(jìn)展,以期為CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用提供參考。

1　培養(yǎng)基的優(yōu)化

研究發(fā)現(xiàn)，不同的細(xì)胞株甚至克隆對(duì)營養(yǎng)成分的需求都有差別。通過篩選比較不同培養(yǎng)基成分對(duì)重組抗原生產(chǎn)的影響，并開發(fā)適用于不同重組CHO細(xì)胞株的培養(yǎng)基，成為很多研究者提高CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)量的重要方式。為了維持細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中的正常生長(zhǎng)，需要在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加很多其他因子，如激素、生長(zhǎng)因子、蛋白水解物等。

蛋白質(zhì)水解物含有豐富的營養(yǎng)成分，可有效縮短細(xì)胞對(duì)無血清培養(yǎng)基的適應(yīng)過程。Davami等[1]通過組合比較不同來源的蛋白水解物對(duì)細(xì)胞密度及表達(dá)產(chǎn)量的影響，優(yōu)化得到更適于DG44的培養(yǎng)基。酵母水解物作為一種成本較低的非動(dòng)物源蛋白水解物，可以使細(xì)胞密度增加的同時(shí)，使重組表達(dá)抗體的表達(dá)量大幅提高[2]。大豆水解物等都可以被添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中[1,3,4]。由于蛋白水解物的構(gòu)成復(fù)雜，且批間差異大，因此蛋白水解物的添加會(huì)影響細(xì)胞培養(yǎng)基批次間的穩(wěn)定性。如果去除培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)水解物，需要添加氨基酸或微量元素等，通過優(yōu)化調(diào)整其比例，仍能支持高密度的CHO細(xì)胞培養(yǎng)[5]。

劉興茂等[6]采用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)對(duì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)添加成分進(jìn)行了考察，確定了腐胺、胰島素及轉(zhuǎn)鐵蛋白對(duì)11G-S細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)有明顯的生長(zhǎng)促進(jìn)作用。設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基可以使細(xì)胞最大生長(zhǎng)密度達(dá)到4.12×106cells/mL。Xu等[7]采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)與支持向量機(jī)(SVM)預(yù)測(cè)并實(shí)驗(yàn)確定了硫酸鋅、轉(zhuǎn)鐵蛋白及BSA對(duì)CHO-K1細(xì)胞的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。另有研究表明，使用檸檬酸鐵作為轉(zhuǎn)鐵蛋白的替代物，可以使細(xì)胞的密度達(dá)到7.0 ×106cells/mL，但是會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率[8]。Miki等[9]研究發(fā)現(xiàn)，添加生長(zhǎng)因子IGF-1和脂類信號(hào)分子溶血磷脂酸(LPA)也可以有效加速CHO細(xì)胞生長(zhǎng)。

優(yōu)化培養(yǎng)基能有效提高重組CHO細(xì)胞的培養(yǎng)密度。高密度的CHO細(xì)胞培養(yǎng)是CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用的必要條件之一。與大腸桿菌和酵母表達(dá)系統(tǒng)相比，CHO細(xì)胞有生長(zhǎng)較慢、培養(yǎng)周期較長(zhǎng)、產(chǎn)量較低等缺點(diǎn)。為了提高重組蛋白產(chǎn)量、擴(kuò)大CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的生產(chǎn)應(yīng)用范圍，研究者們?cè)趦?yōu)化培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，構(gòu)建高產(chǎn)的重組CHO細(xì)胞系，為大規(guī)模的重組蛋白生產(chǎn)提供基礎(chǔ)。

2　高產(chǎn)重組CHO細(xì)胞株的構(gòu)建

研究者們利用發(fā)展迅速的基因編輯技術(shù)對(duì)CHO細(xì)胞進(jìn)行篩選和改造，得到高產(chǎn)的重組細(xì)胞株。研究者們通過過量表達(dá)或敲除某個(gè)基因，調(diào)整代謝途徑、延緩細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄表達(dá)效率，有效的增加了重組蛋白產(chǎn)量。通過結(jié)合全基因組測(cè)序和基因敲除技術(shù)的研究成果，研究者們?yōu)榈玫椒磻?yīng)性更好的糖基化重組蛋白做出了不懈努力。

2.1調(diào)整代謝途徑

乳酸作為糖酵解產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)。Zhou等[10]使用siRNA 技術(shù)降低乳酸脫氫酶A(LDHa)和丙銅酸脫氫酶激酶(PDHKs)基因的表達(dá)，使乳酸的產(chǎn)生降低了90%，并增加了單抗的產(chǎn)量。Toussaint等[11]通過在rCHO中表達(dá)酵母丙酮酸羧化酶(PYC2)，改變了流加培養(yǎng)方式中葡萄糖的代謝速率，增長(zhǎng)了細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，從而增加了細(xì)胞密度及產(chǎn)量。

2.2延緩細(xì)胞凋亡

為了延長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間從而增加產(chǎn)量，有研究者建立了能表達(dá)抗凋亡基因的CHO細(xì)胞系。Majos等[12]通過在CHO 中表達(dá)1個(gè)Asp29 Asn突變的抑制凋亡基因，有效延緩了細(xì)胞凋亡。也有研究者通過敲除細(xì)胞中的促凋亡基因來延緩細(xì)胞凋亡，如Cost等[13]敲除了BCL2相關(guān)蛋白X(BAX)和BAK的基因，使單克隆抗體產(chǎn)量增加了5倍。Ritter等[14]發(fā)現(xiàn)8號(hào)染色體端粒區(qū)的缺失也可以使產(chǎn)物產(chǎn)量成倍增加。

2.3增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄表達(dá)效率

有研究者在細(xì)胞信號(hào)通路研究成果的基礎(chǔ)上，通過表達(dá)轉(zhuǎn)錄及翻譯過程中的相關(guān)蛋白，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)效率，以增加目的重組蛋白的產(chǎn)量。Le Fourn等[15]通過在CHO中表達(dá)人信號(hào)受體蛋白SRP14，成功增加了分泌表達(dá)的重組蛋白的產(chǎn)量。Peng等[16]通過表達(dá)轉(zhuǎn)錄翻譯相關(guān)蛋白SLY1、MUNC18C和XBP1，使IgG的產(chǎn)量提高了20倍；Rahimpour等[17]在CHO細(xì)胞中表達(dá)神經(jīng)酰胺轉(zhuǎn)移蛋白(CERT)的突變基因使t-PA的產(chǎn)量增加了35%。

2.4表達(dá)糖基化酶

能產(chǎn)生糖基化的重組蛋白是CHO 細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)重要的優(yōu)勢(shì)，研究者們通過建立能表達(dá)N-糖基化途徑中不同酶類的細(xì)胞系以增加糖基化重組蛋白的反應(yīng)性。如Goh[18]建立的一個(gè)含有N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶I基因的突變體CHO-gmt4細(xì)胞系，其表達(dá)的重組葡萄糖腦苷脂酶將不需要多糖重構(gòu)可直接用于治療戈謝病患者。Zhang等[19]通過CHO-gmt5細(xì)胞株表達(dá)的重組抗體,其Fc的N-多糖缺少巖藻糖和唾液酸能增強(qiáng)ADCC的作用。根據(jù)CHO-K1的基因組信息，Yang等[20]通過鋅指核酸酶(ZFNs)基因敲除的方法，研究了19種包括作用于N-糖基鏈分支、半乳糖基、聚LacNAc延伸、唾液酸化加蓋的N-糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)N-糖基化作用的影響，為更準(zhǔn)確的表達(dá)特定糖基化方式的重組蛋白提供了重要參考。

重組CHO細(xì)胞表達(dá)重組蛋白能力的高低，不能簡(jiǎn)單的歸結(jié)為某些關(guān)鍵基因的作用。為了得到高產(chǎn)的重組細(xì)胞株，需要研究者們綜合考慮細(xì)胞的代謝情況、培養(yǎng)條件、蛋白表達(dá)效率和蛋白加工修飾能力等諸多因素。

3　大規(guī)模培養(yǎng)研究

基因工程技術(shù)、細(xì)胞融合技術(shù)及抗體類藥物的迅速發(fā)展，推進(jìn)了生物反應(yīng)器培養(yǎng)技術(shù)在生物制藥中的應(yīng)用。由于CHO細(xì)胞能以懸浮培養(yǎng)的方式高密度培養(yǎng)，培養(yǎng)體積可達(dá)1 000 L以上，所以在大規(guī)模培養(yǎng)和重組蛋白的高產(chǎn)量生產(chǎn)中，CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)擁有廣闊的發(fā)展前景。在大規(guī)模生產(chǎn)中，通常采用流加培養(yǎng)方式，通過添加營養(yǎng)物質(zhì)來延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，增加細(xì)胞密度和目的產(chǎn)品的濃度。為了更大程度的提高重組蛋白的生產(chǎn)效率，研究者們需要根據(jù)不同細(xì)胞株的生長(zhǎng)代謝特點(diǎn)，選擇和優(yōu)化起始培養(yǎng)基、補(bǔ)料培養(yǎng)基及補(bǔ)料策略?，F(xiàn)代計(jì)算機(jī)技術(shù)、數(shù)學(xué)算法及理論的應(yīng)用，也為研究者對(duì)細(xì)胞流加培養(yǎng)的優(yōu)化提供了很大幫助。

3.1優(yōu)化培養(yǎng)參數(shù)

選擇合適的培養(yǎng)基、優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)的參數(shù)(如溫度、pH、溶氧、CO2濃度、滲透壓等)對(duì)生產(chǎn)至關(guān)重要。同時(shí)，流加工藝參數(shù)(如流加培養(yǎng)基成分、流加時(shí)間等)均需根據(jù)不同的細(xì)胞株及反應(yīng)器的特點(diǎn)來設(shè)計(jì)優(yōu)化。Fan等[21]采用分批補(bǔ)料方式培養(yǎng)CHO細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)顯示培養(yǎng)基中的氨基酸和葡萄糖濃度對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、IgG濃度和N-糖基化生成都很重要。Kim等[22]使用分批補(bǔ)料培養(yǎng)使IgG的產(chǎn)量達(dá)到2.3 g/L。通過用小麥蛋白水解物(WGH)代替補(bǔ)料中的谷氨酰胺可以使t-PA的產(chǎn)量達(dá)到422 mg/L[23]。

3.2應(yīng)用新的培養(yǎng)技術(shù)

微載體培養(yǎng)是一種動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)。培養(yǎng)液中大量的微載體為細(xì)胞提供了極大的附著表面，從而可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的高密度培養(yǎng)。胡顯文等[24]在攪拌式反應(yīng)器中無血清培養(yǎng)分泌u-PA的DNA 重組CHO 細(xì)胞，通過部分更換Cytopore多孔微載體，解決了大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞凋亡的問題。并使用周期變壓刺激技術(shù)使u-PA的產(chǎn)量提高了10倍，且可以降低葡萄糖厭氧代謝產(chǎn)生乳酸的轉(zhuǎn)化率。Ventini等[25]通過Cytodex微載體培養(yǎng)CHO-hTSH細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)表明，培養(yǎng)基中微載體的數(shù)量及在rhTSH合成期開始時(shí)的細(xì)胞濃度是提高目的蛋白產(chǎn)量的重要參數(shù)。李智等[26]利用CHO細(xì)胞能在培養(yǎng)過程中自然結(jié)團(tuán)的特性，采用超聲沉降柱二合一灌流系統(tǒng)促進(jìn)細(xì)胞結(jié)團(tuán)和加強(qiáng)截留的特性，用無血清培養(yǎng)基連續(xù)灌流培養(yǎng)基因重組CHO細(xì)胞MK3-A2株，分泌表達(dá)的rhTNK-tPA生產(chǎn)率平均為89 mg/L·d。

3.3添加保護(hù)劑

聚醚F68可以有效減少生物反應(yīng)器中攪拌對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的機(jī)械損傷。針對(duì)F68對(duì)某些細(xì)胞株的生長(zhǎng)及產(chǎn)量降低的情況，研究者發(fā)現(xiàn)0.05%或0.075%的500 kDa的γPGA可以替代F68應(yīng)用于CHO DG44細(xì)胞的培養(yǎng)中[27]。

在細(xì)胞培養(yǎng)工藝逐級(jí)放大的過程中，每一步都需要研究者們監(jiān)控細(xì)胞在生長(zhǎng)和表達(dá)方面的相關(guān)指標(biāo)。生物反應(yīng)器在線監(jiān)控pH、溶氧等參數(shù)的功能、色譜和在線蛋白分解監(jiān)測(cè)等技術(shù)為大規(guī)模培養(yǎng)的過程控制提供了幫助。

4　展望

CHO細(xì)胞是表達(dá)外源蛋白最多也是最成功的一類細(xì)胞，有其不可比擬的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也存在現(xiàn)行技術(shù)手段不能彌補(bǔ)的不足之處。結(jié)合生物信息學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、基因工程技術(shù)和生物反應(yīng)器技術(shù)的研究成果，研究者們可以通過綜合考慮細(xì)胞代謝特性、蛋白表達(dá)特性等影響因素，通過研發(fā)個(gè)性化培養(yǎng)條件及培養(yǎng)工藝，構(gòu)建高表達(dá)載體，篩選穩(wěn)定高產(chǎn)的重組細(xì)胞株，改造宿主細(xì)胞等角度繼續(xù)優(yōu)化CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)重組蛋白提供基礎(chǔ)。

用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的重組CHO細(xì)胞，需要具備生長(zhǎng)特性良好、能在無血清培養(yǎng)基中高密度培養(yǎng)、表達(dá)重組蛋白能力強(qiáng)、能正確的進(jìn)行翻譯后修飾等特點(diǎn)。糖基化是蛋白翻譯后最重要的修飾之一，直接影響重組蛋白的空間結(jié)構(gòu)、生物活性、穩(wěn)定性、免疫原性和生物反應(yīng)性等。對(duì)重組蛋白的糖基化研究一直是研發(fā)和生產(chǎn)真核重組蛋白的熱點(diǎn)課題。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，研究者們通過表達(dá)特定糖基化相關(guān)酶從而得到完整、準(zhǔn)確的特定形式的糖鏈結(jié)構(gòu)，為糖基化蛋白在免疫診斷、臨床治療等領(lǐng)域的持續(xù)發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。隨著基因技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)細(xì)胞代謝、信號(hào)傳導(dǎo)等方面研究的持續(xù)深入，構(gòu)建能表達(dá)準(zhǔn)確修飾的糖基化重組蛋白的高產(chǎn)重組CHO細(xì)胞株仍將成為研究熱點(diǎn)。

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[26]李 智, 肖成祖, 楊 琴, 等.CHO細(xì)胞無血清結(jié)團(tuán)灌流培養(yǎng):超聲-沉降柱二合一灌流系統(tǒng)[J]. 中國生物工程雜志, 2008,(4): 53-58.

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Progress of CHO Expression System

ZHENG Hui-hui, JIANG Hong*

BeijingWondergenBio-medicineTechnologyCo.Ltd.,Beijing141017,China

CHO cell expression system is the preferred system for recombinant glycoprotein production. With the evolving development and applications of serum-free suspension culture technology, genetic engineering and the large-scale culture technologies, CHO cell expression system has become the most important expression or production system of biotechnology products. This system is widely used in the research and production of antibodies, recombinant proteins and vaccines. In recent years, researchers have made great efforts to improve the expression and large-scale production of recombinant proteins by using latest bioengineering technology and the development of the recombinant protein expression mechanism. This article briefly reviewed the recent development of the CHO cell expression system in three aspects: the optimization of the culture medium, construction of engineered CHO strains for high-level production and large-scale culture research, which was expected to provide reference for research and application of CHO cell expression system.

CHO cell culture; cell engineering; recombinant antigen expression

10.3969/j.issn.2095-2341.2016.04.03

2016-02-22; 接受日期：2016-04-04

鄭惠惠，技術(shù)員，主要從事真核重組抗原研發(fā)研究。E-mail：shanjvqiuming@163.com。*通信作者：江洪，工程師，主要從事重組抗原研發(fā)研究。E-mail：jiang@wondergen.com