張自心,　謝學(xué)文,　傅俊范*,　李寶聚*

1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 沈陽 110866;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所, 北京 100081

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黃瓜棒孢葉斑病病原學(xué)和抗性基因研究進(jìn)展

張自心1,謝學(xué)文2,傅俊范1*,李寶聚2*

1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 沈陽 110866;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所, 北京 100081

摘要：黃瓜棒孢葉斑病(cucumber target leaf spot)是危害我國黃瓜生產(chǎn)的新流行病害。經(jīng)過長期科學(xué)研究，在病原學(xué)和抗性基因等方面取得了諸多突破性進(jìn)展。對黃瓜棒孢葉斑病發(fā)生概況和發(fā)病特點(diǎn)、病原學(xué)及抗性基因的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，指出現(xiàn)階段研究中存在的問題，并提出相應(yīng)的解決方案和建議，對今后的研究方向進(jìn)行了展望，以期為該病識別、防治和抗病育種研究提供參考。

關(guān)鍵詞：黃瓜棒孢葉斑病；多主棒孢；病原學(xué)；抗性基因

黃瓜棒孢葉斑病(cucumber target leaf spot)又稱褐斑病、靶斑病，是危害我國黃瓜(CucumissativusL.)生產(chǎn)的新興葉部病害，在露地栽培和設(shè)施栽培均可發(fā)生，發(fā)病率高，甚至可達(dá)100%，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1～3]。本文就黃瓜棒孢葉斑病發(fā)生概況、發(fā)病特點(diǎn)、病原學(xué)和黃瓜抗性基因的研究進(jìn)行了綜述，以期為黃瓜棒孢葉斑病的研究提供參考。

1發(fā)生概況和發(fā)病特點(diǎn)

1.1發(fā)生概況

黃瓜棒孢葉斑病是一種世界性葉部病害，在美國、德國、巴拿馬、韓國、新西蘭、西印度等地均有發(fā)生和報道(http://nt.ars-grin.gov/fungaldatabases/)。自2005年以來，本課題組在我國華北、華中、華南、華東、西北、西南和東北等地的田間調(diào)查均發(fā)現(xiàn)有黃瓜棒孢葉斑病的發(fā)生，其中尤以東北、華北和華東等蔬菜種植地發(fā)生嚴(yán)重，田間葉片發(fā)病率為10%～25%，嚴(yán)重時可達(dá)70%，甚至100%，年損失超過2億元[1～4]，并且有逐年加重趨勢。由于多主棒孢寄主范圍廣泛、病原菌極易變異產(chǎn)生抗藥性[5,6]，且防治措施缺乏，最經(jīng)濟(jì)有效的手段便是擴(kuò)大抗病品種的栽培種植。目前，歐美等地黃瓜棒孢葉斑病抗性品種主要有以下幾種：Butcher’s Disease Resister[7]、Intimidator(XP3501217)、Moctezuma(PS102095)[8]、Marketmore97[9]、Hybrid 72502[10]、Royal Sluis Wautoma和USDA 6623E[11]，而國內(nèi)報道的抗病品種報道的主要有津春5號、中農(nóng)5號、津優(yōu)3號、津優(yōu)38號和花青大吊瓜等[12～14]，但這些抗性品種鑒定所用菌株不同，適用的地理區(qū)域尚需進(jìn)一步研究。

1.2發(fā)病特點(diǎn)

黃瓜棒孢葉斑病在黃瓜整個生長期均能引起發(fā)病，主要危害黃瓜葉片，在黃瓜葉柄和莖上也可產(chǎn)生小的、長型病斑，造成莖基部腐爛等[15,16]。多主棒孢菌具有喜溫好濕的特點(diǎn)，高溫高濕利于該病的流行和蔓延[17]，此外，枝葉過密、長時間悶棚、通風(fēng)不良、葉面結(jié)露、光照不足等均可促使其發(fā)病。該病原菌以菌絲體、分生孢子叢或厚垣孢子隨病殘體在土壤中越冬，存活力較強(qiáng)[18]，主要以種子帶菌方式進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播[19～21]。越冬后的該病原菌于翌年春季產(chǎn)生分生孢子，通過氣流和雨水飛濺傳播，進(jìn)行初侵染。初侵染后病斑所生成的分生孢子借風(fēng)雨向周圍蔓延，可進(jìn)行再侵染，病原菌一個生長季可進(jìn)行多次再侵染，使病害日益加重。該病最先發(fā)生在中部葉片，后逐漸向下擴(kuò)展，再向上部葉片發(fā)展，幼齡葉片發(fā)病較輕，葉正、背面均可受害，嚴(yán)重時蔓延至葉柄、莖蔓[22]。該病病斑呈灰黃褐色，中部顏色稍淺，略帶蒼白色，呈圓形、近圓形或不規(guī)則形。病斑大小差異很大，分為大型斑、小型斑和角狀斑3種類型。濕度大時，病斑背面產(chǎn)生灰黑色霉層；干燥時，病斑在葉部可造成穿孔；發(fā)病嚴(yán)重時，病斑連片，葉片早枯[1,17]。

2病原學(xué)研究進(jìn)展

2.1多主棒孢菌的形態(tài)特征和遺傳多樣性研究

引起黃瓜棒孢葉斑病的病原菌為多主棒孢[Corynesporacassiicola(Berk & M A Curtis) C T Wei]，隸屬于絲孢綱(Hyphomycetes),絲孢目(Hyphomycetales),暗色菌科(Dematiaceae),棒孢屬(Corynespora)，為無性型真菌。多主棒孢菌是棒孢屬的模式菌種，最早由我國真菌分類學(xué)家魏景超定名[23]。多主棒孢菌分生孢子典型形態(tài)特征為：半透明至深褐色的倒棍棒形或圓柱形，具有4～20個假隔膜，孢子大小為(40.0～220.0)μm×(9.0～22.0)μm，基臍寬度為(4.0～8.0)μm，分生孢子梗頂端具有0～9個圓柱形層出梗，層出梗寬(110.0～850.0)μm×(4.0～11.0)μm[24]。

傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)包括菌落顏色、結(jié)構(gòu)及分生孢子大小、形狀等，其差異不足以用于種內(nèi)菌株的分化研究，目前應(yīng)用的主要方法是通過對持家基因測序進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究和利用分子標(biāo)記技術(shù)對種內(nèi)菌株的遺傳多樣性分析。有關(guān)多主棒孢菌的遺傳類群劃分研究主要集中在多主棒孢是否與其寄主、致病力和采集來源有關(guān)，各研究者對此持有不同觀點(diǎn)。利用 RFLP 和 RAPD標(biāo)記將采自斯里蘭卡和澳大利亞地區(qū)、多個寄主植物的多主棒孢菌劃分為7個遺傳類群，遺傳類群與樣本采集地、致病力、菌株的生長速率之間具有顯著相關(guān)性[25]；Smith等[26]利用高變異位點(diǎn)GA4分析了4個國家58個寄主屬植物上的多主棒孢菌株，發(fā)現(xiàn)病原菌具有顯著的遺傳多樣性，且遺傳類群與致病力和寄主來源相關(guān)；通過ISSR分子標(biāo)記技術(shù)將我國內(nèi)地及海南地區(qū)87株黃瓜棒孢葉斑病菌劃分為兩個類群，其中類群A菌株來源自海南，類群B菌株來自內(nèi)地河北、山東和遼寧等地，此項研究表明多主棒孢的分類可能與地理來源相關(guān)[4]；也有研究者認(rèn)為多主棒孢遺傳類群與致病型、地理或寄主來源不存在相關(guān)性[27～29]。楊苗[3]利用持家基因(EF-1α基因和Actin基因)對我國蔬菜棒孢葉斑病病原菌進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，將病原菌劃分為5個遺傳類群，種群劃分與寄主來源和致病類型密切相關(guān)，但與地理來源無關(guān)?？偟膩碇v，研究學(xué)者對多主棒孢的遺傳類群分類結(jié)論并不統(tǒng)一，仍需進(jìn)一步搜集不同寄主和地理來源的多主棒孢菌，擴(kuò)大并選擇具有代表性的研究樣本進(jìn)行系統(tǒng)的分類研究。

2.2多主棒孢菌致病毒素的研究

由多主棒孢產(chǎn)生的毒素蛋白Cassiicolin，最早稱為毒素，是一種低分子量蛋白質(zhì)。它與之前報道的許多寄主選擇性毒素不同，并非由小分子物質(zhì)通過聚合過程形成，而是由Pro-Cassiicolin形成蛋白，結(jié)構(gòu)特殊，且與寄主?；投舅睾外伝虻鞍踪|(zhì)不同源。此外研究還表明Cassiicolin可能與其他毒素致病機(jī)理不同，寄主與病菌之間可能存在新的互作[30]。最早發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生毒素的多主棒孢菌分離自番茄，隨后發(fā)現(xiàn)橡膠上分離的多主棒孢菌在合成培養(yǎng)基上也可產(chǎn)生毒素，病菌濾液或毒素能侵染番茄或橡膠葉片，并產(chǎn)生典型發(fā)病癥狀[31，32]。研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)病癥狀出現(xiàn)前的1～2 d內(nèi)，耐病和感病品種中均可檢測到Cassiicolin的轉(zhuǎn)錄峰值，這表明Cassiicolin在病原菌侵染初期可能起著關(guān)鍵作用。此外，利用毒素蛋白可對植物細(xì)胞內(nèi)的侵染位點(diǎn)進(jìn)行早期檢測，可避免真菌功能基因組影響接種材料，能夠在植物抗性遺傳檢測中得到準(zhǔn)確結(jié)果[33，34]。然而某些未檢測到毒素蛋白基因存在的多主棒孢菌竟然也可引起典型的發(fā)病癥狀，這其中可能存在某些尚未發(fā)現(xiàn)的病原菌與寄主間的互作效應(yīng)。毒素蛋白基因與多主棒孢遺傳背景方面有著密切的聯(lián)系，在多主棒孢菌生物學(xué)和進(jìn)化學(xué)的研究中起著重要的作用[35]。

2.3多主棒孢菌抗藥性研究

多主棒孢菌極易隨環(huán)境改變而發(fā)生變異，對多種化學(xué)藥劑產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致黃瓜棒孢葉斑病的防治困難重重[36]。我國尚未對黃瓜棒孢葉斑病的抗藥性進(jìn)行系統(tǒng)的研究，國際上，日本對多主棒孢抗藥性研究最為深入[6]。國內(nèi)僅黃大野[37]對采集自我國不同地區(qū)和寄主的165株多主棒孢菌進(jìn)行了多菌靈的敏感性測定，發(fā)現(xiàn)黃瓜多主棒孢對多菌靈抗性極高，抗性頻率高達(dá)100%。日本有報道稱該病菌對苯并咪唑類、二羧酰亞胺類、N-苯氨基甲酸酯類、QoⅠ類殺菌劑具有抗藥性。Hasama[38]測定了419株黃瓜多主棒孢菌株對多菌靈和苯菌靈的敏感性，發(fā)現(xiàn)78.8%的菌株對多菌靈表現(xiàn)高抗性，并有多菌靈和苯菌靈雙抗菌株出現(xiàn)。Miura等[39]通過研究137株多主棒孢菌株對苯菌靈的抗藥性，發(fā)現(xiàn)79%的菌株對苯菌靈具有抗藥性。Miyamoto[36,40]和Ushio[41]對大量黃瓜多主棒孢菌株進(jìn)行啶酰菌胺抗藥性檢測，發(fā)現(xiàn)大部分菌株對啶酰菌胺表現(xiàn)抗藥性，部分甚至表現(xiàn)高抗。

不同的殺菌劑作用位點(diǎn)不同，產(chǎn)生的抗性機(jī)制也不同。黃瓜多主棒孢菌對嘧菌酯抗藥性的產(chǎn)生是由于細(xì)胞色素b基因DNA序列上，編碼第143位氨基酸的堿基發(fā)生點(diǎn)突變，并導(dǎo)致氨基酸的改變而使得細(xì)胞色素b結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，致使嘧菌酯與靶標(biāo)的親和力下降，產(chǎn)生抗藥性[42]。多主棒孢菌對啶酰菌胺的抗性機(jī)制較復(fù)雜，琥珀酸脫氫酶SdhB、SdhC和SdhD亞基編碼的氨基酸點(diǎn)突變及其位置與抗性水平相關(guān)，由于SdhB亞基編碼278位氨基酸發(fā)生點(diǎn)突變，該位點(diǎn)核苷酸由CAC突變?yōu)門AC，導(dǎo)致組氨酸突變?yōu)槔野彼岫a(chǎn)生超高抗藥性(EC50>30 mg/L)；多主棒孢菌對啶酰菌胺產(chǎn)生中抗(EC50值2.0～5.9 mg/L)是由于其SdhC亞基73位絲氨酸突變?yōu)楦彼?、SdhD亞基89和109位甘氨酸突變?yōu)槔i氨酸導(dǎo)致[40]。國內(nèi)也明確了多主棒孢菌對多菌靈抗性機(jī)制的產(chǎn)生是由于β-微管蛋白198位的谷氨酸突變?yōu)楸彼幔瑢Χ嗑`和乙霉威的雙重抗性機(jī)制為：198位的谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼?，?00位的苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼?，從而?dǎo)致藥劑與靶標(biāo)的結(jié)合作用降低而產(chǎn)生抗藥性。田間可利用不同作用機(jī)制的殺菌劑，如啶酰菌胺、咯菌腈、咪鮮胺、腐霉利和嘧菌環(huán)胺等無明顯交互抗藥性的藥劑作為抗性菌株治理的候選藥劑[37]。

3黃瓜對黃瓜棒孢葉斑病的抗性基因研究現(xiàn)狀

3.1抗性遺傳規(guī)律的研究

有關(guān)黃瓜棒孢葉斑病抗性遺傳分析報道較少，學(xué)者普遍認(rèn)為黃瓜棒孢葉斑病的抗性是由質(zhì)量性狀基因控制。Abul-Hayja等[43]以Royal Sluis 72502(抗)×South Carolina GY3(感)為雜交組合，研究指出Royal Sluis 72502對黃瓜棒孢葉斑病的抗性由1對顯性單基因控制。但國內(nèi)王惠哲等[44]選用高抗親本Q5和高感親本P57-1配置組合的F1、F2及回交世代對黃瓜棒孢葉斑病抗病遺傳規(guī)律進(jìn)行了研究，結(jié)果表明黃瓜對該病的抗性是由 1 對隱性單基因控制的，感病相對抗病為不完全顯性。楊雙娟等[45]利用由抗病親本野生黃瓜變種PI183967(C.sativusvar.hardwickii)、感病親本新泰密次選系931，及其F1、F2、BC1P1和BC1P2進(jìn)行抗性遺傳分析，表明黃瓜野生變種PI183967對黃瓜棒孢葉斑病的抗性由單隱性核基因控制。Wen 等[46]以抗病黃瓜近交系D31和感病黃瓜系D5為親本，F(xiàn)1表現(xiàn)感病，其F2∶3家系分離比符合期望分離比1∶2∶1，表明D31對棒孢葉斑病的抗性由隱性單基因控制。綜上，國外學(xué)者認(rèn)為黃瓜對黃瓜棒孢葉斑病的抗性由1對顯性單基因控制；而國內(nèi)學(xué)者則認(rèn)為該抗性由1對隱性單基因控制。造成以上不同結(jié)果的原因可能是學(xué)者們選用抗病材料或病原菌生理小種不同。

3.2抗性基因研究

迄今為止，有關(guān)黃瓜棒孢葉斑病抗性基因的研究并不多見，已報道的黃瓜棒孢葉斑病抗性基因有4個。黃瓜對棒孢葉斑病的抗性基因Cca首次報道于1978年[43]。隨著國內(nèi)黃瓜棒孢葉斑病頻繁爆發(fā)并造成嚴(yán)重?fù)p失，有關(guān)黃瓜對棒孢葉斑病的抗性基因研究也隨之增多，已報道有3個隱性單基因：cca、cca-2和cca-3[45～47]。有關(guān)3個基因的定位和連鎖標(biāo)記等研究也獲得了突破性進(jìn)展。Wang等[44]找到了與cca緊密連鎖的EST-SSR標(biāo)記CAFR33，遺傳距離為2.9 cM，標(biāo)記正確率可達(dá)91.5%。楊雙娟等[45]將抗性基因cca-2定位于黃瓜第6染色體，位于標(biāo)記SSR10954和SSR16890之間，兩對側(cè)翼標(biāo)記正確率為85.7%。最新報道的黃瓜棒孢葉斑病抗性基因cca-3被精細(xì)定位于物理距離79 kb的Indel 16 874 230和Indel 16 953 846之間，基因注釋該區(qū)段，篩選出CC-NB-ARC型抗病基因Csa6M375730為黃瓜棒孢葉斑病抗性基因的候選基因[46]。以上研究均為黃瓜棒孢葉斑病抗性基因的克隆、利用及分子標(biāo)記輔助選擇育種奠定了基礎(chǔ)。

4展望

近年來，黃瓜棒孢葉斑病的發(fā)病范圍不斷擴(kuò)大，危害程度不斷加重，已成為當(dāng)前黃瓜生產(chǎn)的嚴(yán)重威脅。明確多主棒孢病原學(xué)特性是提供棒孢葉斑病防治措施的重要前提。但目前棒孢葉斑病病原菌多主棒孢的研究基礎(chǔ)薄弱，對于該病原菌的種內(nèi)生理分化尚未得到科學(xué)的分析，仍需深入研究[5]。隨著分子生物學(xué)方法尤其是DNA分析技術(shù)和RAPD、RFLP、ISSR等分子標(biāo)記方法逐步應(yīng)用于多主棒孢的分類及鑒定，有關(guān)多主棒孢遺傳類群劃分及其與致病型、地理或寄主來源之間的相關(guān)性、生理分化、多主棒孢毒素蛋白Cassiicolin及其控制基因、多主棒孢抗藥性等研究日漸得到關(guān)注和研究。此外，有研究表明毒素蛋白基因與多主棒孢遺傳背景密切相關(guān)，利用毒素蛋白基因?qū)Χ嘀靼翩呔M(jìn)化分類系統(tǒng)研究具有重大意義[28,34]。目前有關(guān)多主棒孢菌的某些研究結(jié)論并不一致，仍需擴(kuò)大研究群體的寄主來源和地理來源進(jìn)行綜合性研究，明確多主棒孢菌種群分類情況。

選育和使用抗病品種是病害防治最直接有效、經(jīng)濟(jì)安全的措施。但總的來看，我國目前栽培種中黃瓜棒孢葉斑病抗性品種極少，國內(nèi)黃瓜棒孢葉斑病抗性種質(zhì)資源尚未經(jīng)過系統(tǒng)篩選，對黃瓜棒孢葉斑病抗性遺傳規(guī)律的研究較少，國內(nèi)所報道的遺傳規(guī)律與國外存在分歧[43～46]。高效、多樣化的抗源是抗病育種的基礎(chǔ)，而現(xiàn)有黃瓜抗棒孢葉斑病資源單一，有必要加強(qiáng)抗性材料篩選挖掘和抗性遺傳規(guī)律的探討，為我國培育抗病品種奠定了基礎(chǔ)。此外，還應(yīng)注重多抗基因的聚合，不斷將新的、高效抗病基因通過雜交、回交等方法導(dǎo)入優(yōu)良品系，從而緩解病原菌毒性群體頻率的上升。目前，應(yīng)充分利用已篩選出的抗、感黃瓜棒孢葉斑病材料，加強(qiáng)與黃瓜棒孢葉斑病相關(guān)的分子生物學(xué)研究，獲得與抗性基因緊密連鎖的標(biāo)記，為分子標(biāo)記輔助育種提供技術(shù)支持，從而提高抗病育種效率，加速育種進(jìn)程。

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Status on Pathogenic and Resistance Gene of Cucumber Target Leaf Spot

ZHANG Zi-xin1, XIE Xue-wen2, FU Jun-fan1*, LI Bao-ju2*

1.CollegeofPlantProtection,ShenyangAgriculturalUniversity,Liaoning110866,China;2.InstituteofVegetableandFlowers,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,China

Abstract:Cucumber target leaf spot is a new epidemic disease of cucumber in china. Experiencing long-term scientific research, many breakthroughs had been achieved in the fields of pathogen and resistance genes. The research progress on the occurrence, characteristics, pathogenic and resistance gene of cucumber target leaf spot were summarized in this paper. The problems in present studies were pointed out. Moreover, the corresponding suggestion and research direction for future were discussed, in order to provide reference for the identification, control and resistance breeding of cucumber target leaf spot.

Key words:cucumber target leaf spot; Corynespora cassiicola; pathogenic; resistance gene

收稿日期：2016-03-28; 接受日期：2016-04-21

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(31401888)；大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(CARS-25)資助。

作者簡介：張自心，碩士研究生，主要從事植物抗病基因定位研究。E-mail：973735442@qq.com。*通信作者：傅俊范，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事植物真菌學(xué)研究。E-mail：Fujunfan@163.com；李寶聚，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事蔬菜病害綜合防治研究。E-mail:libaoju@caas.cn

DOI:10.3969/j.issn.2095-2341.2016.03.03