曾玉曉，徐玲瓏，吳迪炯，葉寶東，高雁婷，劉文賓，周郁鴻

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院血液科， 杭州 310006)

ChinJAllergyClinImmunol，2016，10(3)：207- 212

免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia，ITP)是免疫介導(dǎo)的血小板過度破壞、巨核細胞數(shù)量和質(zhì)量異常，血小板生成相對不足的自身免疫性疾病。ITP的治療，目前主要從激素、丙種球蛋白沖擊、切脾、化療等方面著手，取得了一定療效。對于難治性血小板減少癥患者，抗CD20單克隆抗體(美羅華)已成為重要的選擇手段之一，但其存在著價格昂貴，遠期療效尚有無法確定的不足。目前，已有采用間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell，MSCs)治療ITP[1]的個案報道，但相關(guān)的實驗研究仍相對缺乏。人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)來源豐富，增殖分化能力強[2- 3]。因此，本實驗探索hUC-MSCs對難治性免疫性血小板減少癥(refractory immune thrombocytopenia，rITP)患者外周血B細胞分化及分泌功能的影響。

資料與方法

病例來源

病例資料為2012年6月至2013年10月本院rITP患者26例，男性10例，女性16例，中位年齡44(12～68)歲。健康供者6例，男性4例，女性2例，中位年齡28(21～40)歲。

rITP患者納入標(biāo)準(zhǔn)

(1)脾切除后無效或復(fù)發(fā)者或依賴激素者；(2)仍需治療以降低出血的危險；(3)除外其他引起血小板減少癥的原因，確診ITP。

hUC-MSCs的提取[4]及純度鑒定

人臍帶由浙江省杭州市第一人民醫(yī)院提供，通過了浙江省中醫(yī)院倫理委員會倫理批準(zhǔn)。將無菌臍帶用含有青鏈霉素雙抗的PBS清洗；剝離華通氏膠，將華通氏膠剪碎至約2 mm×2 mm×2 mm大小；用0.2%的Ⅱ型膠原酶，37 ℃消化4～5 h；消化物用50目、200目濾網(wǎng)過濾，過濾液用PBS稀釋，分別以2 000 r/min×15 min、1 500 r/min×15 min、800 r/min×5 min離心，棄上清液；計數(shù)，細胞以7.5×105個接種于25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，48 h后首次換液，細胞融合度達90%時胰酶消化，以0.5×105/L傳代培養(yǎng)。取第三代的hUC-MSCs，用CD44、CD31標(biāo)記hUC-MSCs用流式細胞儀檢測其純度。

健康供者及rITP患者外周血B細胞的分離及共培養(yǎng)體系的建立

用人外周血淋巴細胞分離液以密度梯度離心法分離出rITP患者及健康供者外周血單個核細胞，調(diào)整細胞數(shù)為7.5×107/L，用流式細胞儀檢測CD19標(biāo)記的細胞。胰酶消化融合度90%的hUC-MSCs細胞，調(diào)節(jié)細胞濃度為5×105個接種于培養(yǎng)皿，貼壁3 h后，分別以hUC-MSCs∶單個核細胞0.5∶10、1∶10、2∶10、4∶10、8∶10建立共培養(yǎng)體系。

美洲商陸刺激B細胞分化及酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測抗體IgM、IgG分泌量

將濃度分別為30、10、1 mg/L的美洲商陸(Pokeweed，PWM)加入健康供者外周血分離的單個核細胞中培養(yǎng)2、4、7 d，按酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)試劑盒說明書檢測標(biāo)準(zhǔn)品及上清液分泌抗體IgM和IgG的吸光度值(OD值)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算兩種抗體的濃度。外周血單個核細胞與hUC-MSCs共培養(yǎng)4 d，收集上清液，按ELISA試劑盒說明書檢測標(biāo)準(zhǔn)品及上清液分泌抗體IgM和IgG的OD值，計算兩種抗體的濃度。

EnVision免疫組化法測B細胞誘導(dǎo)的成熟蛋白-1的表達

外周血單個核細胞與hUC-MSCs共培養(yǎng)4 d，CD138標(biāo)記細胞。EnVision二步法免疫組化，檢測B細胞誘導(dǎo)的成熟蛋白- 1(B lymphocyte-induced maturation protein1，Blimp- 1)被抑制程度。陽性率(positive rate, PR)=陽性細胞數(shù)/(陰性細胞數(shù)+陽性細胞數(shù))×100%。

計分標(biāo)準(zhǔn)[5- 6]：(1)陽性強度的判斷：按著色細胞染色強弱判斷，細胞染色呈陰性為(-)；染色弱，陽性細胞呈淡黃色為(+)；染色中等，陽性細胞呈棕黃色為(++)；染色強，陽性細胞呈棕褐色為(+++)，統(tǒng)計時分別用0、1、2和3分表示。(2) 陽性率的判斷：沒有陽性細胞的計為(-)，陽性率小于25%的計為(+)，陽性率介于26%～50%之間的計為(++)，陽性率大于50%計為(+++)，統(tǒng)計時分別用0、1、2、3分表示。

統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié)　　果

流式細胞儀檢測hUC-MSCs純度和外周血單個核細胞B細胞比例

流式細胞儀檢測第三代hUC-MSCs表面CD44和CD31表達分別為99.8%和1.6%。流式細胞儀檢測健康供者、rITP患者外周血單個核細胞CD19標(biāo)記的細胞分別為6.9%和6.2%(圖1、2)。

B細胞分化為漿細胞分泌抗體與PWM濃度和作用時間的相關(guān)性

PWM濃度30、10、1 mg/L，作用4 d時健康供者組IgG分泌量分別為(4.83±0.17)、(3.49±0.66)、(2.97±0.88)μg/L，分別高于同濃度第2天、第7天IgG分泌量(P均<0.01)；IgM分泌量分別為(3.47±0.49)、(1.84±0.46)、(1.67±0.65)μg/L，高于同濃度第2天、第7天IgM分泌量(P均<0.01)(圖3)，因此以PWM為30 mg/L、4 d作為PWM刺激B細胞的濃度和時間。該刺激條件下rITP患者組IgG分泌量為(7.39±1.42)μg/L，高于健康供者組(P=0.014)；rITP患者組IgM分泌量為(5.44±0.17)μg/L，高于健康供者組(P=0.039)(表1)。選用PWM濃度為30 mg/L，作用時間4 d進行下一步實驗。

圖1hUC-MSCs純度鑒定

Fig1hUC-MSCs’ purity identification

hUC-MSCs：人臍帶間充質(zhì)干細胞；CD44標(biāo)記的hUC-MSCs細胞占99.8%；CD31標(biāo)記的hUC-MSCs細胞占1.6%

hUC-MSCs抑制抗體IgG、IgM的分泌

hUC-MSCs和rITP患者外周血單個核細胞以2∶10共培養(yǎng)時，rITP患者IgG、IgM分泌量分別是(4.98±1.63)和(3.78±0.82)μg/L，明顯低于無hUC-MSCs時IgG、IgM分泌量(P=0.005、0.003)。此比例時rITP患者組IgG、IgM分泌量和健康供者組無明顯差異(P=0.266、0.543)(表2)。

hUC-MSCs抑制Blimp- 1蛋白的表達

rITP患者CD138標(biāo)記細胞陽性率即Blimp- 1蛋白表達率在hUC-MSCs∶單個核細胞為2∶10時為33.51%，較無hUC-MSCs時明顯下降(P=0.026)，與健康供者組比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.076)(圖4)。

圖2外周血CD19標(biāo)記的細胞百分比

Fig2CD19 marked peripheral blood mononuclear cells

rITP：難治性免疫性血小板減少癥；健康供者組外周血CD19標(biāo)記細胞為6.9%； rITP患者組外周血CD19標(biāo)記細胞為6.2%

圖3健康供者外周血在不同PWM濃度及不同作用時間時IgG、IgM分泌量

Fig3IgG and IgM secretion levels of healthy donors with different PWM concentration and work time

PWM：美洲商陸

表1不同PWM濃度時健康供者組及rITP患者組IgG、IgM的分泌量
Table1IgG and IgM secretion levels of healthy donors and rITP patients with different PWM concentration

PWM(mg/L)健康供者rITP患者IgGIgMIgGIgM　1　　　297±088△　　　167±065△　　　465±087△　　　276±112△10　　　349±066#　　　184±046△　　　497±067△　　　259±053△30　　　483±017　　　347±049　　　739±142?　　　544±017?

PWM：美洲商陸；rITP：難治性免疫性血小板減少癥；與健康供者比較，*P<0.01；與PWM 30 mg/L比較，#P<0.05，△P<0.01

表2rITP患者外周血單個核細胞與hUC-MSCs不同比例及無hUC-MSCs時IgG、IgM分泌量
Table2IgG and IgM secretion levels of rITP patients with no-hUC-MSCs and PBMCs co-cultured with hUC-MSCs in different ratio

hUC?MSCs：PBMCIgGIgM無hUC?MSCs　　739±142　　544±01705∶10　　724±144　　564±0961∶10　　670±061　　528±1052∶10　　498±163?　　378±082?4∶10　　680±187　　533±0708∶10　　707±112　　603±116

rITP：難治性免疫性血小板減少癥；hUC-MSCs：人臍帶間充質(zhì)干細胞；PBMC:外周血單個核細胞；與無hUC-MSCs比較，*P<0.01

圖4　健康供者組、rITP患者組無hUC-MSCs、外周血單個核細胞與hUC-MSCs不同比例時Blimp- 1蛋白表達率Fig 4　Blimp- 1 protein expression of healthy donors,no-hUC-MSCs and PBMCs co-cultured with hUC-MSCs in different ratio of rITP patientsrITP：難治性免疫性血小板減少癥；hUC-MSCs：人臍帶間充質(zhì)干細胞；Blimp- 1：B細胞誘導(dǎo)的成熟蛋白- 1; PBMC：外周血單個核細胞

討　　論

MSCs是全能干細胞，可以從骨髓、臍帶、脂肪等組織中提取，有自我更新、分化的能力。有易于分離提取、特異性表面標(biāo)記、可分化為多種細胞具有免疫調(diào)節(jié)、遷移等特性，因此MSCs可用于治療再生障礙性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病、多發(fā)性硬化癥等自身免疫性疾病。MSCs具有調(diào)節(jié)T細胞、B細胞、單核巨噬細胞等免疫細胞的功能[7]。目前認(rèn)為MSCs通過可溶性因子[8]、白細胞介素10(interleukin- 10, IL- 10)、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)[9]、γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)等調(diào)節(jié)T細胞的活化增殖。MSCs使B 細胞停滯在G0/G1期、改變B細胞胞外激酶和p38促分裂原活化蛋白的激發(fā)模式[10]，使B 細胞不能增殖分化為漿細胞，從而減少IgG、IgM、IgA的分泌。我們的實驗中，hUC-MSCs高表達CD44，不表達CD31，與骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)相同，而且hUC-MSCs比其他組織來源的MSCs更原始，更具有增殖分化能力。本實驗發(fā)現(xiàn)在hUC-MSCs∶單個核細胞為2∶10時IgG、IgM分泌量較無hUC-MSCs時明顯減少，與相關(guān)文獻[11]一致。說明hUC-MSCs可以抑制B細胞分化為漿細胞。

Blimp- 1是由prdm1基因編碼的轉(zhuǎn)錄抑制因子，可以誘導(dǎo)成熟B淋巴細胞發(fā)育為漿細胞，被稱作“B淋巴細胞終極分化的主調(diào)控子”。成熟B淋巴細胞分化為漿細胞需多個轉(zhuǎn)錄因子共同參與，其中PAX5、BCL- 6、MITF、MTA3、BACH2參與B細胞分化，Blimp、XBP- 1、IRF- 4參與漿細胞分化。Asari等[12]認(rèn)為將B細胞和MSCs共培養(yǎng)可抑制Blimp- 1 mRNA的表達，本實驗也證明hUC-MSCs和B 細胞共培養(yǎng)，Blimp- 1蛋白表達下降，從而減少B細胞向漿細胞分化。

本實驗中，hUC-MSCs對IgG、IgM及Blimp- 1蛋白的抑制程度，并不和其濃度成正比，這和Bertolo等[13]的實驗相似，Bertolo等在體外將人MSCs和人椎間盤組織共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)人MSCs 50 000個/孔時對IgG的抑制率反而低于人MSCs為10 000/孔時的抑制率。有學(xué)者認(rèn)為人MSCs對B細胞的活性無影響，但抑制B細胞的增殖，使其停滯在G0/G1期[11]。本研究未進行B細胞增殖相關(guān)的實驗，對于hUC-MSCs是否使B細胞停滯于細胞周期某一時期還有待進一步研究。

綜上，本實驗結(jié)果表明hUC-MSCs可以抑制Blimp- 1蛋白從而抑制rITP患者外周血B細胞向漿細胞分化，減少IgG、IgM的分泌，為臨床骨髓移植治療rITP提供一定的實驗依據(jù)，但其他作用機制及臨床治療劑量仍需探索。

[1]Fang B, Song YP, Li N, et al. Resolution of refractory chronic autoimmune thrombocytopenic purpura following mesenchymal stem cell transplantation: a case report[J]. Transplant Proc, 2009,41:1827- 1830.

[2]Wu LF, Wang NN,Liu YS,et al. Differentiation of Wharton’s jelly primitive stromal cells into insulin-producing cells in comparison with bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Tissue Eng Part A, 2009,15:2865- 2873.

[3]Can A, Karahuseyinoglu S. Concise review: human umbilical cord stroma with regard to the source of fetus-derived stem cells[J]. Stem Cells,2007,25: 2886- 2895.

[4]Seshareddy K, Troyer D, Weiss ML. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton’s Jelly of umbilical cord[J]. Methods Cell Biol, 2008,86:101- 119.

[5]馬大烈, 白辰光. 免疫組織化學(xué)陽性標(biāo)記結(jié)果的觀察和判斷[J]. 臨床與實驗病理學(xué)雜志, 2003, 19: 557- 559.

[6]Fields AC, Cotsonis G, Sexton D, et al. Survivin expression in hepatocellular carcinoma: correlation with proliferation, prognostic parameters, and outcome[J].Mod Pathol, 2004,17:1378- 1385.

[7]Gieseke F, Kruchen A, Tzaribachev N,et al. Proinflammatory stimuli induce galectin- 9 in human mesenchymal stromal cells to suppress T-cell proliferation[J]. Eur J Immunol,2013,43:2741- 2749.

[8]Duffy MM, Ritter T, Ceredig R,et al. Mesenchymal stem cell eff ects on T-cell eff ector Pathways[J]. Stem Cell Res Ther,2011,2:34.

[9]Nasef A, Chapel A, Mazurier C,et al. Identification of IL- 10 and TGF-beta transcripts involved in the inhibition of T-lymphocyte proliferation during cell contact with human mesenchymal stem cells[J]. Gene Expr, 2007,13:217- 226.

[10] Tabera S, Pérez-Simón JA, Díez-Campelo M,et al. The effect of mesenchymal stem cells on the viability,proliferation and differentiation of B-lymphocytes[J]. Haematologica,2008, 93:1301- 1309.

[11] Corcione A, Benvenuto F, Ferretti E, et al. Human mesenchymal stem cells modulate B-cell functions[J].Blood, 2006,107: 367- 372.

[12] Asari S, Itakura S, Ferreri K, et al. Mesenchymal stem cells suppress B cell terminal differentiation[J]. Exp Hematol, 2009,37: 604- 615.

[13] Bertolo A, Thiede T, Aebli N,et al.Human mesenchymal stem cell co-culture modulates the immunological properties of human intervertebral disc tissue fragmentsinvitro[J]. Eur Spine J,2011, 20:592- 603.