張曉霞，魏任雄，周　俊，婁江濤

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬寧波市中醫(yī)院男性科實驗室，浙江寧波 315012)

ChinJAllergyClinImmunol，2016，10(3)：242- 246

免疫因素是WHO男性不育標(biāo)準(zhǔn)化病因分類診斷之一，男性免疫性不育作為器官特異性自身免疫性疾病，體內(nèi)可能存在免疫系統(tǒng)的功能紊亂。T輔助細(xì)胞(T helper cell，Th細(xì)胞)是免疫細(xì)胞分化的重要組成部分，Th1/Th2分化平衡，對維持機體穩(wěn)態(tài)有重要意義[1]。體內(nèi)Th1或Th2細(xì)胞失衡與糖尿病、心血管疾病及支氣管哮喘等多種疾病有關(guān)[2- 4]。目前，Th細(xì)胞失衡與免疫性男性不育是否有關(guān)尚未見相關(guān)報道，男性免疫性不育異常的免疫細(xì)胞分化和免疫應(yīng)答機制尚不明確。本研究主要通過觀察免疫性不育患者外周血T細(xì)胞分化情況及Th1和Th2細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞因子γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ)和白細(xì)胞介素- 4(interleukin- 4，IL- 4)在基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，探索男性免疫性不育患者機體的免疫狀態(tài)。

資料與方法

對象

收集2014年4月至2015年4月來寧波市中醫(yī)院男科就診的免疫性不育患者40例，入選標(biāo)準(zhǔn)參照WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》(第5版)[5]：性及射精功能正常，在至少一份精液標(biāo)本中，混合抗球蛋白反應(yīng)試驗(mixed antiglobulin reaction，MAR)或免疫珠試驗有不少于50%活動精子表面被覆抗體。所有患者均排除泌尿系統(tǒng)感染，年齡22～47歲，平均(31.2±6.5)歲，夫妻性生活正常，未采取任何避孕措施1年以上未使女方懷孕，女方均經(jīng)婦科檢查排除不孕因素。所有患者均為初診，未經(jīng)治療。另外選擇妻子懷孕待產(chǎn)生育力正常的健康男性20例為對照組，年齡22～35歲，平均(27.1±13.9)歲。所有對象均簽署知情同意書，并通過醫(yī)院倫理委員會同意。

主要試劑和儀器

熒光定量PCR儀Mx3000P型 (美國Stratagene公司)，普通PCR儀(德國Roche公司)，溶血儀(Beckman公司)，總RNA提取試劑盒(日本TaKaRa公司)，cDNA第一鏈合成試劑盒(日本TaKaRa公司)，TaqDNA聚合酶(上海Fermentas公司)，dNTP(上海Fermentas公司)，Universal Master Mix(Applied Biosystems)，熒光抗體CD3-PE-CY5、CD4-FITC、CD8-PE均購自Beckman公司。

標(biāo)本采集

所有受試者均空腹采集外周血4 ml，用EDTA抗凝。0.5 ml全血用于流式細(xì)胞術(shù)檢測，剩余全血采用Ficoll密度梯度離心法收集外周血單個核細(xì)胞，用于提取基因組RNA。

T淋巴細(xì)胞細(xì)胞亞群檢測

取EDTA抗凝外周血0.5 ml，加入5 μl三色熒光抗體CD3-PE-CY5/CD4-FITC/CD8-PE，室溫避光孵育15 min，置溶血儀中溶血，然后加入2 ml PBS洗滌后棄上清。用500 μl PBS重懸細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀檢測分析。

RT-PCR檢測IFN-γ和IL4的基因表達(dá)

RNA提?。翰捎肨rizol法提取外周血單個核細(xì)胞的基因組RNA，具體按照試劑盒說明書操作。經(jīng)DU800紫外分光光度計測定A260/A280比值1.8～2.0，提示無DNA及蛋白質(zhì)污染。

逆轉(zhuǎn)錄：取11 μl RNA模板樣品，加入1 μl 0.5 μg/μl Oligo(dT)18，總反應(yīng)體系20 μl，具體操作嚴(yán)格按cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進(jìn)行。

IFN-γ mRNA擴(kuò)增：根據(jù)Genebank所收錄的IFN-γ mRNA序列設(shè)計引物，上游引物5′-TTTTGGGTTCTC TTGGCTGTT-3′,下游引物5′-CTCCTTTTTCGCTTCCCT GT-3′。20 μl PCR反應(yīng)體系中含有上游引物900 nmol/L，下游引物300 nmol/L，cDNA 2 μl，Universal Master Mix 10 μl。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min，再用二步法進(jìn)行擴(kuò)增：94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共反應(yīng)40個循環(huán)。

IL- 4 mRNA擴(kuò)增：根據(jù)Genebank所收錄的IL- 4 mRNA序列設(shè)計引物，上游引物5′-AATTGCCTCAC ATTGTCACT-3′，下游引物5′-CTCTCATGATCGTCTT TAGCC-3′。PCR反應(yīng)體系和條件同IFN-γ mRNA。

管家基因β-actin：根據(jù)Genebank所收錄的β-actin mRNA序列設(shè)計引物，上游引物5′-GGCAC CCAGCACAATGAAG-3′，下游引物5′-CGTCATACTC CTGCTTGCTG-3′。PCR反應(yīng)體系和條件同IFN-γ mRNA。

統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié)　　果

免疫性不育患者T細(xì)胞亞群

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與正常對照相比，免疫性不育患者CD3+T與CD8+T細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.05)，CD4+T細(xì)胞數(shù)顯著下降(P<0.05)，免疫性不育者CD4/CD8比值下降并倒置(圖1～3)。

RT-PCR檢測免疫性不育患者IFN-γmRNA和IL-4mRNA表達(dá)

RT-PCR檢測結(jié)果顯示，與正常對照相比，IFN-γ mRNA在免疫性不育組的表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)；相反，IL- 4 mRNA的表達(dá)量則在免疫性不育組顯著下調(diào)(P<0.05)(表1)。

討　　論

在不育夫婦中，男性因素所致不育約占50%，其中2%～10%的不育癥與免疫因素有關(guān)[6]。目前普遍認(rèn)為男性免疫性不育的主要機制是血睪屏障異常開放或破壞，精母細(xì)胞及精子等與機體免疫系統(tǒng)接觸產(chǎn)生免疫反應(yīng)，導(dǎo)致抗精子抗體產(chǎn)生[7]。但是，血清或精漿中的抗精子抗體產(chǎn)生時機體免疫細(xì)胞的分化狀態(tài)及免疫應(yīng)答的機制還不清楚。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析了男性免疫性不育患者和正常對照者的外周血T細(xì)胞分化情況。結(jié)果顯示，免疫性不育患者外周血CD3+T細(xì)胞較正常對照組顯著升高(P<0.05)，表明免疫性不育的發(fā)病與T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫有密切關(guān)系。進(jìn)一步分析T淋巴細(xì)胞亞群，發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.05)，CD4+T細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05)，免疫性不育者CD4+T/CD8+T比值下降并發(fā)生倒置，提示免疫性不育患者存在T淋巴細(xì)胞亞群失調(diào)。

圖1免疫性不育組與正常對照組外周血T細(xì)胞亞群分布百分比散點圖

Fig1The distribution of T lymphocyte subsets in peripheral blood of immune infertility group and normal control group

A：兩組外周血CD3+T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分比比較，P=0.003；B：兩組外周血CD4+T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分比比較，P=0.000；C：兩組外周血CD8+T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分比比較，P=0.000；D：兩組外周血CD4+T/CD8+T比值比較，P=0.000

圖2流式細(xì)胞術(shù)檢測男性免疫性不育患者機體外周血T細(xì)胞亞群分布

Fig2T cell subsets in peripheral blood of male immune infertility patients detected by flow cytometry

圖3流式細(xì)胞術(shù)檢測正常對照者機體外周血T細(xì)胞亞群分布

Fig3T cell subsets in peripheral blood of normal control subjects detected by flow cytometry

分組例數(shù)IFN?γmRNAIL?4mRNA對照組20462±173705±150免疫性不育組40345±123807±185t27012138P00090037

IFN-γ：γ干擾素；IL- 4：白細(xì)胞介素- 4

Th細(xì)胞在維持機體穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要的作用，其激活后可分泌細(xì)胞因子。根據(jù)細(xì)胞因子的分泌模式，Th 細(xì)胞主要分為兩類：Th1和Th2。Th1細(xì)胞主要分泌IL- 2、IL- 12、IL- 15、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)和IFN-γ等，而Th2細(xì)胞主要分泌IL- 4、IL- 5、IL- 6、IL- 10和IL- 13等[8]。正常情況下，Th1/Th2細(xì)胞因子呈動態(tài)平衡，以維護(hù)機體處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)。一旦這種平衡遭到破壞，一方不能有效制約另一方，導(dǎo)致Th細(xì)胞極化，就會產(chǎn)生免疫紊亂，乃至發(fā)生疾病。多種自身免疫性疾病均涉及Th細(xì)胞極化，Th1/Th2處于失衡狀態(tài)。細(xì)胞因子在男性生殖系統(tǒng)調(diào)節(jié)中同樣發(fā)揮重要作用[9- 11]，與之相聯(lián)系的證據(jù)都表明男性免疫性不育可能同樣涉及Th 極化，使免疫應(yīng)答向Th1細(xì)胞方向偏離，具有促進(jìn)Th1細(xì)胞應(yīng)答、抑制Th2細(xì)胞活性的特點。本研究通過觀察Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞因子IFN-γ和IL- 4在基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況來分析Th1和Th2細(xì)胞在免疫性不育患者機體的狀態(tài)。通過RT-PCR檢測IFN-γ mRNA和IL- 4 mRNA的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IFN-γ mRNA在免疫性不育組的表達(dá)量較正常對照組明顯上調(diào)(P<0.05)；相反，IL- 4 mRNA在免疫性不育組的表達(dá)量明顯下調(diào)(P<0.05)，表明Th1細(xì)胞在免疫性不育患者機體的比例升高，Th2細(xì)胞則下降，說明免疫性不育患者機體確實存在Th細(xì)胞向Th1方向分化偏移和極化的現(xiàn)象。Th1極化使得Th1細(xì)胞分泌更多的IFN-γ和IL- 2等細(xì)胞因子，IFN-γ可激活巨噬細(xì)胞分泌更多的IL- 2，同時上調(diào)IL- 2R在新近激活的CD4+T細(xì)胞及Th1細(xì)胞上的表達(dá)，增加Th1細(xì)胞對IL- 2的敏感性，從而增加Th1表型細(xì)胞，使T細(xì)胞傾向于1型細(xì)胞因子反應(yīng)。

越來越多的證據(jù)表明，免疫性不育的發(fā)病可能與T細(xì)胞功能紊亂及其分泌較多的Th1樣細(xì)胞因子有關(guān)。本研究初步研究發(fā)現(xiàn)男性免疫性不育患者的T淋巴細(xì)胞功能紊亂及Th細(xì)胞分化向Th1方向偏移，但免疫性不育的發(fā)病機制仍有很多尚未明確。隨著免疫性不育研究機制的不斷深入，勢必為其治療提供廣闊的前景。

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