陳　晨，周艷容，明宏艷，王小晉，廖鳳蘭，朱云楓，王　勁

(1.廣東國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心，廣東廣州 510623；2.淮安出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇淮安 223021)

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·論著·

近紅外熒光標(biāo)記-免疫磁珠偶聯(lián)法定量檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌ESAT-6蛋白

陳晨1，周艷容1，明宏艷1，王小晉2，廖鳳蘭1，朱云楓1，王勁1

(1.廣東國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心，廣東廣州 510623；2.淮安出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇淮安 223021)

摘要:目的建立定量檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌早期分泌抗原靶-6(ESAT-6)的近紅外熒光標(biāo)記-免疫磁珠偶聯(lián)法。方法以近紅外熒光染料(Dylight 800)標(biāo)記靶向ESAT-6的單克隆抗體，靶向ESAT-6的多克隆抗體包被在納米磁珠表面。采用雙抗體夾心法，磁性分離結(jié)合物和游離物，采用便攜式高靈敏度低噪聲激發(fā)式熒光檢測(cè)儀檢測(cè)磁性結(jié)合物的熒光強(qiáng)度，從而檢測(cè)待檢樣品中ESAT-6水平。結(jié)果該方法的檢測(cè)線性范圍為2.4～750.0 ng/mL，最低檢測(cè)限為0.48 ng/mL；10 ng/mL水平加樣回收率為96%，50 ng/mL水平加樣回收率為95%；批間變異系數(shù)(CV)為5.8%，批內(nèi)CV為4.3%。該方法檢測(cè)胸腔積液標(biāo)本ESAT-6的特異度為80%，靈敏度為95%。結(jié)論該方法檢測(cè)ESAT-6的線性范圍廣、靈敏度高、穩(wěn)定性好。

關(guān)鍵詞:近紅外熒光；免疫磁珠；結(jié)核分枝桿菌早期分泌抗原靶-6；定量檢測(cè)

結(jié)核病是一種古老的傳染性疾病，目前全世界約有1/3的人口感染結(jié)核分枝桿菌，每年有近800萬(wàn)人死于肺結(jié)核[1]；耐藥和多重耐藥菌株的大量出現(xiàn)，又為結(jié)核病的控制帶來(lái)更大的困難。此外，更多的研究還證實(shí)結(jié)核分枝桿菌能增強(qiáng)人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的復(fù)制，因此在艾滋病患者中雙重感染者眾多，成為導(dǎo)致患者死亡的主要原因。目前對(duì)于結(jié)核分枝桿菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷主要是基于涂片抗酸染色、細(xì)菌培養(yǎng)、核酸檢測(cè)及相關(guān)抗體的檢測(cè)，以上方法存在著靈敏度低、特異性差、耗費(fèi)時(shí)間或檢測(cè)成本高的缺點(diǎn)。近年來(lái)隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的深入，多種與結(jié)核分枝桿菌相關(guān)的蛋白被發(fā)現(xiàn)，這些蛋白是否能夠成為結(jié)核分枝桿菌感染診斷的特異性抗原標(biāo)志物激發(fā)了大家的興趣。結(jié)核分枝桿菌早期分泌抗原靶-6(ESAT-6)是結(jié)核分枝桿菌在感染早期的分泌性抗原，也是結(jié)核分枝桿菌短期培養(yǎng)物的過(guò)濾后蛋白質(zhì)中具有免疫保護(hù)力的抗原。既是重要的T淋巴細(xì)胞抗原，也具有刺激B淋巴細(xì)胞反應(yīng)的抗原決定簇。它只存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和少量致病性分枝桿菌中，且在卡介苗中缺失[2]。李新玲等[3]曾建立了基于時(shí)間分辨熒光的方法來(lái)檢測(cè)ESAT-6、CFP100融合蛋白，取得了滿意的結(jié)果。本文建立了一種定量檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌ESAT-6的方法，將納米磁珠偶聯(lián)與近紅外熒光標(biāo)記法結(jié)合起來(lái)，利用納米磁珠表面羧基活化后可與抗體表面的氨基共價(jià)結(jié)合，從而將抗體固定到納米磁珠表面，發(fā)揮了納米磁珠比表面積大，吸附性強(qiáng)，懸浮穩(wěn)定性好，有利于抗原抗體反應(yīng)順利進(jìn)行的特點(diǎn)；同時(shí)，近紅外熒光染料具有靈敏度高、選擇性好的優(yōu)點(diǎn)，它的激發(fā)光及發(fā)射光光譜均在近紅外區(qū)域，可最大限度減少環(huán)境中雜散熒光物質(zhì)的干擾。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源臨床胸腔積液標(biāo)本搜集自廣州市胸科醫(yī)院，其中結(jié)核性胸腔積液標(biāo)本20份，惡性胸腔積液標(biāo)本20份，均采集自臨床明確診斷病例，符合相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑便攜式流動(dòng)進(jìn)樣熒光檢測(cè)器(中科院理論物理所制備的樣機(jī)，該設(shè)備固化為激發(fā)光波長(zhǎng)777 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)790 nm)；Dylight 800購(gòu)自美國(guó)Thermofisher公司；鼠抗ESAT-6單克隆抗體(100 μg/100 μL)、兔抗鼠ESAT-6多克隆抗體(1 mg/mL)均購(gòu)自美國(guó)Pierece 公司；納米磁珠購(gòu)自武漢哇哇噻納技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司北京生物技術(shù)研究所；ESAT-6(全片段重組蛋白，1.5 mg/mL)購(gòu)自杭州啟泰生物公司；結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(H37Rv ATCC27294)、牛分支桿菌卡介苗(BCG)株、牛結(jié)核分枝桿菌株、偶然分枝桿菌株、恥垢分枝桿菌株為臨床分離株，均來(lái)自于淮安市疾病控制中心。

1.3方法

1.3.1制備近紅外熒光染料標(biāo)記的ESAT-6單克隆抗體按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)要求，將Dylight800用pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋10倍，取1.4 μL與20 μg鼠抗ESAT-6單克隆抗體(1 mg/mL)輕柔混合均勻后于室溫避光反應(yīng)2 h；反應(yīng)結(jié)束后，將標(biāo)記產(chǎn)物放入透析袋中，4 ℃，PBS透析4 h。標(biāo)記好的抗體溶液中添加終濃度為1.5%胎牛血清(BSA)、0.1%吐溫20(Tween-20)及0.1‰疊氮化鈉(NaN3)，4 ℃保存；使用前將標(biāo)記產(chǎn)物以PBS稀釋2 000倍。

1.3.2制備ESAT-6多克隆抗體包被的納米磁珠按照納米磁珠使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行處理。(1)預(yù)處理：輕輕混勻磁珠懸浮液，吸取0.01 mL懸浮液(25 mg/mL)加入1.5 mL EP管中；再加入0.1 mL雙蒸水(ddH2O)，輕輕混勻并將試管架置于磁板上，靜置2 min后吸取上清液；重復(fù)上述步驟1次；加入1 mL 0.1 mol/L的2-N-嗎啡啉乙磺酸溶液(MES，pH5.0)，重懸磁珠。(2)活化：將上述EP管置于磁板上，用1 mL MES洗滌2次，棄上清；臨用前配制終濃度為0.1 mol/L的MES，其內(nèi)含碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的濃度均為40 g/L(加入上述兩種物質(zhì)后，置于振蕩器上充分混勻15 min，待用)。用該MES液重懸磁珠，用磁板吸附磁珠，棄上清，重復(fù)該步驟1次，即得活化磁珠。(3)磁珠與蛋白的偶聯(lián)：在上述已活化的磁珠中加入50 μL ESAT-6多克隆抗體(1 mg/mL)和500 μL偶合液(pH5.5 PBS)，混勻，室溫，置于搖床上持續(xù)震蕩，孵育2 h；用PBS緩沖液(pH5.5，0.05% Tween-20)清洗3次，吸附棄上清；加入封閉液(1 mL Tris緩沖液，0.1 mol/L，含0.1% BSA)，混勻，室溫，置于搖床上持續(xù)震蕩，孵育2 h；加入1 mL PBS緩沖液(pH5.5，0.05% Tween-20)，靜置2 min，棄上清，重復(fù)3次；棄上清時(shí)，試管需置于磁板上；加入1 mL保存液(PBS，pH7.4，含0.05% Tween-20、0.1% BSA、0.05 NaN3)待用。

1.3.3檢測(cè)流程取50 μL待檢樣品與50 μL熒光標(biāo)記的ESAT-6單抗，于EP管中混勻，37 ℃反應(yīng)30 min；將包被了多抗的磁珠稀釋10倍后，取50 μL加入該EP管，37 ℃反應(yīng)15 min；再加入500 μL ddH2O，磁板上靜置2 min，棄上清，重復(fù)該步驟3次；管中加入100 μL PBS(pH7.4)，混勻，用便攜式流動(dòng)進(jìn)樣熒光檢測(cè)器進(jìn)行熒光強(qiáng)度測(cè)定。

1.3.4ESAT-6檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線將ESAT-6全片段重組蛋白用PBS稀釋成0.48、2.40、12.00、60.00、300.00、750.00、1 500.00 ng/mL的7種不同濃度樣品，每個(gè)濃度設(shè)置兩個(gè)平行樣，按照1.3.3所示方法進(jìn)行檢測(cè)，繪制檢測(cè)ESAT-6的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5方法的性能評(píng)價(jià)挑取培養(yǎng)基中結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(H37Rv ATCC27294)、牛結(jié)核分枝桿菌株、偶然分枝桿菌株、恥垢分枝桿菌株、BCG的單個(gè)菌落，分別溶于1 mL PBS中離心取上清進(jìn)行測(cè)定，以確定檢測(cè)體系的特異性；將ESAT-6倍比稀釋以確定檢測(cè)限量；配制10 ng/mL和50 ng/mL的ESAT-6標(biāo)準(zhǔn)溶液計(jì)算回收率，采用同日內(nèi)連續(xù)20次檢測(cè)和連續(xù)20 d檢測(cè)的方法計(jì)算批內(nèi)(批間)變異系數(shù)(CV)，評(píng)價(jià)其準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析，采用最小二乘法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行擬合。繪制受試者工作特征(ROC)曲線，計(jì)算ROC曲線下面積(AUC)。

2結(jié)果

2.1近紅外熒光標(biāo)記-免疫磁珠偶聯(lián)法定量檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌ESAT-6的標(biāo)準(zhǔn)曲線將ESAT-6全片段重組蛋白用PBS稀釋成濃度為0.48、2.40、12.00、60.00、300.00、750.00、1 500.00 ng/mL的樣品，其線性范圍為2.4～750.0 ng/mL，檢測(cè)限量為0.48 ng/mL；以ESAT-6濃度的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，以儀器熒光示數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合相關(guān)系數(shù)r2=0.991 8，函數(shù)方程為Y=1.207 7X+0.261 1。見(jiàn)圖1。

圖1　近紅外熒光標(biāo)記-免疫磁珠偶聯(lián)法檢測(cè)

2.2方法的特異性評(píng)價(jià)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(H37Rv ATCC27294)熒光示數(shù)值為0.76，牛結(jié)核分枝桿菌株、偶然分枝桿菌株、恥垢分枝桿菌株的熒光示數(shù)值分別為0.01、0.01、0.02，BCG株熒光示數(shù)值為0，表明采用本方法檢測(cè)ESAT-6與其他結(jié)核株無(wú)交叉反應(yīng)。

2.3方法的回收率評(píng)價(jià)將100 ng/mL的ESAT-6溶液，加入ESAT-6檢測(cè)為5.6 ng/mL的胸腔積液標(biāo)本中，制成終濃度為10 ng/mL和50 ng/mL的兩個(gè)樣品，進(jìn)行回收試驗(yàn)測(cè)定，回收率分別為96%和95%。見(jiàn)表1。

表1　　回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4批內(nèi)和批間精密度試驗(yàn)將上述標(biāo)準(zhǔn)液，取平行樣，1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)行20次測(cè)試，結(jié)果顯示批內(nèi)CV為4.3%；連續(xù)20 d進(jìn)行重復(fù)測(cè)試，結(jié)果顯示批間CV為5.8%。

2.5臨床標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果取結(jié)核性胸腔積液和惡性胸腔積液各20份，分兩組，檢測(cè)其ESAT-6濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)核性胸腔積液ESAT-6水平分布在8.5～217.0 ng/mL之間，均值為119.6 ng/mL；惡性胸腔積液ESAT-6水平分布在5.3～36.5 ng/mL之間，均值為18.6 ng/mL。繪制ROC曲線，AUC為0.900，以9.1 ng/mL為臨界值，該方法的靈敏度為95%，特異度80%。見(jiàn)圖2。

圖2　　檢測(cè)胸腔積液中ESAT-6 的ROC曲線

3討論

傳統(tǒng)的免疫學(xué)檢測(cè)方法常采用同位素、熒光素、生物素或者酶作為免疫反應(yīng)的指示劑，反應(yīng)支持介質(zhì)多為聚丙烯孔板、瓊脂等，具有一定的局限性，并且部分指示物具有環(huán)境污染性，或者宜受環(huán)境因素的影響，信號(hào)放大能力弱。此外，固體介質(zhì)作為反應(yīng)支持物，可能對(duì)蛋白質(zhì)的構(gòu)象展開(kāi)有影響，不利于抗原抗體反應(yīng)的進(jìn)行。本研究首次采用Dylight 800這種新型近紅外熒光染料作為免疫反應(yīng)的高效信號(hào)指示劑，利用其熒光強(qiáng)度強(qiáng)、熒光壽命長(zhǎng)、穩(wěn)定性好、生物相容性優(yōu)的特點(diǎn)[4-6]，同時(shí)采用了納米磁珠作為反應(yīng)支持平臺(tái)，將免疫反應(yīng)的分離和富集連為一體，以ESAT-6作為檢測(cè)對(duì)象，建立了定量檢測(cè)的方法。

Dylight800標(biāo)記抗體，操作簡(jiǎn)便，標(biāo)記效率高，據(jù)試劑盒提供的數(shù)據(jù)表明，其標(biāo)記效率約為87%，優(yōu)于其他種類的標(biāo)記物。本方法的批內(nèi)和批間CV分別為4.3%、5.8%，可以體現(xiàn)Dylight800熒光壽命長(zhǎng)、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，因而其在臨界值灰區(qū)判定時(shí)可能具有優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，穩(wěn)定的檢測(cè)結(jié)果可為臨床治療效果的評(píng)價(jià)及試驗(yàn)結(jié)果的判斷提供可靠的參考依據(jù)。

Dylight 800作為免疫反應(yīng)信號(hào)指示劑，由于其激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)均在近紅外波長(zhǎng)區(qū)域內(nèi)，可見(jiàn)光波長(zhǎng)范圍外，所以在本研究的特異性評(píng)價(jià)試驗(yàn)中，除了結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(H37Rv ATCC27294)在測(cè)試時(shí)可檢出反射光以外，其他菌株或產(chǎn)生極其微弱的發(fā)射光或未檢出光強(qiáng)度，表明其抗外界干擾能力強(qiáng)。

納米磁珠在本研究中作為反應(yīng)支持平臺(tái)，具有比表面積大，吸附性強(qiáng)，懸浮穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)。與Dylight 800共同搭建起來(lái)的免疫反應(yīng)系統(tǒng)，近似于液體環(huán)境，有利于蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的完整展開(kāi)，將免疫反應(yīng)的分離和富集連為一體，使得抗原抗體反應(yīng)能夠順利進(jìn)行。

胸腔積液是一個(gè)很好的培養(yǎng)基，結(jié)核菌在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的分泌蛋白不可避免地漏于其中，同時(shí)胸腔積液也是一個(gè)很好的富集環(huán)境，適于作為檢測(cè)樣品。在以ESAT-6為靶目標(biāo)的結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)臨床研究中，多數(shù)學(xué)者關(guān)注患者血清和腦脊液中ESAT-6的表達(dá)[3，7]，并取得了滿意的結(jié)果。在本研究中，初步嘗試用建立的方法對(duì)胸腔積液ESAT-6水平進(jìn)行檢測(cè)，從而鑒別診斷胸腔積液的性質(zhì)，結(jié)果顯示檢測(cè)的特異度為80%，靈敏度為95%。但是，本研究由于缺少足夠量的臨床標(biāo)本，因而所得結(jié)果具有一定的局限性，其臨床意義還需要大量的臨床標(biāo)本檢測(cè)數(shù)據(jù)和方法學(xué)比對(duì)來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，本研究?jī)H對(duì)納米磁珠-近紅外熒光標(biāo)記的免疫反應(yīng)體系的應(yīng)用進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明其檢測(cè)性能滿意。

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Study on quantitatively detecting Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 antigen by using near-infrared fluorescent dye-immunomagnetic beads coupling method

ChenChen1，ZhouYanrong1，MingHongyan1，WangXiaojin2，LiaoFenglan1，ZhuYunfeng1，WangJin1

(1.GuangdongInternationalTravelHealthCareCenter,Guangzhou,Guangdong510623,China；2.HuaianEntry-exitInspectionAndQuarantineBureau,Huaian,Jiangsu223001,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a near-infrared fluorescent dye-immunomagnetic beads coupling method for quantitative detection of Mycobacterium tuberculosis early secretory antigenic target-6(ESAT-6).MethodsNear-infrared fluorescent dye,dylight 800,was used to mark ESTA-6-targeting monoclonal antibodies,and the surface of nano-magnetic beads were coated with ESAT-6-targeting polyclonal antibodies.Double antibody sandwich method was used for magnetic separation of conjugates and dissociants.Portable high-sensitivity and low-noise excitation fluorescence detector was used to detect the intensity of magnetic combination,so as to test the ESAT-6 content in test samples.ResultsThe detecting linear range of this method was 2.4-750.0 ng/mL,and the minimum detection limit was 0.48 ng/mL.The recovery rate was 96% at a concentration of 10 ng/mL,and at a concentration of 50 ng/mL the recovery rate was 95%.The between-run coefficient of variation(CV)value was 5.8%,and the within-run CV value was 4.3%.The specificity and sensitivity of this method for detecting ESAT-6 in clinical pleural effusion samples were 80% and 95%,respectively.ConclusionThis method might have wide linear range,high sensitivity and good stability in the detection of ESAT-6.

Key words:near-infrared fluorescent；immunomagnetic beads；Mycobacterium tuberculosis early secretory antigenic target-6；quantitative detection

(收稿日期：2015-12-19)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.05.018

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)05-0623-03

作者簡(jiǎn)介：陳晨，女，主治醫(yī)師，主要從事口岸出入境人員結(jié)核分枝桿菌的快速檢測(cè)研究。