王海臣 王宏 劉偉超 呂菊保 沙洪

300192天津，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所

650 nm低能量激光照射離體高血脂全血和紅細(xì)胞對(duì)其吸收光譜的影響

王海臣 王宏 劉偉超 呂菊保 沙洪

300192天津，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所

目的 研究低能量激光照射離體高血脂全血和紅細(xì)胞對(duì)其吸收光譜的影響。方法 選取30例高血脂患者血樣為高血脂組，30例正常血樣為正常組，用多功能酶標(biāo)儀分別對(duì)血樣的全血和紅細(xì)胞進(jìn)行掃描，比較兩個(gè)樣本吸收光譜的異同；選用低能量650 nm激光照射待測(cè)血樣，用多功能酶標(biāo)儀對(duì)全血和紅細(xì)胞進(jìn)行掃描并比較照射前后吸收光譜的變化。結(jié)果 高血脂血樣的全血和紅細(xì)胞在416、544、578 nm處的吸收峰值均比正常血樣高，因此，可通過光譜吸收峰初步判定血液中血脂異常的情況。650 nm激光照射30例高血脂血樣后，紅細(xì)胞在416、544、578 nm處峰值分別降低，照射前后差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；全血照射后其吸收光譜在416、544、578 nm升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 650 nm低能量激光照射可降低高血脂紅細(xì)胞對(duì)光譜的吸收峰，且有助于改善紅細(xì)胞膜-漿脂質(zhì)的平衡，從光譜學(xué)角度證明了激光治療高血脂疾病的可行性。

低能量激光； 高血脂； 吸收光譜； 多功能酶標(biāo)儀

Fund program：National Natural Science Foundation of China(81602800,81301288)

0 引 言

高血脂又稱血脂紊亂或血脂異常，是指人體內(nèi)血清（血漿）脂質(zhì)濃度超出了正常范圍[1]。高血脂癥是一類較常見的疾病，除少數(shù)是由于全身性疾病所致外，絕大多數(shù)是因遺傳基因缺陷或與環(huán)境因素相互作用引起的。高血脂是誘發(fā)動(dòng)脈血管粥樣硬化以及心腦血管等多種疾病的重要因素，因此改善體內(nèi)血脂水平是治療高血脂的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2-3]。對(duì)于血脂的治療，臨床上有各種療法，如抽脂手術(shù)[4]、針灸治療[5]、藥物治療、激光治療[6]等。其中激光治療效果顯著，目前未發(fā)現(xiàn)副作用。自20世紀(jì)90年代以來，低能量激光照射療法（low-level laser therapy，LLLT）引入我國(guó)，此療法是利用激光的生物學(xué)效應(yīng)調(diào)整機(jī)體的免疫系統(tǒng)、血液循環(huán)系統(tǒng)和組織代謝系統(tǒng)等，使病例狀態(tài)恢復(fù)正常的一種療法[7]。低能量激光照射在以下方面效果顯著：①改善紅細(xì)胞變形能力和紅細(xì)胞剛性。②提高紅細(xì)胞載氧能力，加速血氧結(jié)合[8]。③糾正微循環(huán)，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫能力[9]。④提高組織修復(fù)能力[10-11]。國(guó)際上以臨床研究為依據(jù)，各種治療高血脂手段的研究層出不窮，雖然多數(shù)研究結(jié)果證明激光治療是治療高血脂癥的可行性手段，但其詳細(xì)作用機(jī)理的研究并不充分[12-13]。本研究旨在利用低能量激光照射對(duì)生物組織作用產(chǎn)生生物效應(yīng)，激光照射離體血液后，觀察全血及紅細(xì)胞對(duì)光譜吸收的變化來分析血脂的改變，從而為低能量激光照射改善高血脂人群的血脂水平提供新的思路和方法。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院檢驗(yàn)科正常血樣30例（膽固醇濃度＜5.72 mmol/L、甘油三酯濃度＜1.70 mmol/L）；高血脂血樣30例（膽固醇濃度＞5.72 mmol/L和/或甘油三酯濃度＞1.70 mmol/L）。60例樣本中女性23例，年齡為25～78歲，平均年齡為（68.5±13.5）歲，采用肝素抗凝。將性別、年齡、血細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)以及血小板經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），膽固醇、甘油三酯含量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

1.2 方法

1.2.1 主要材料與儀器

0.9%生理鹽水（浙江齊敏制藥），肝素（上海源葉生物科技有限公司）。全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），日立7100全自動(dòng)生化分析儀（日本Hitachi公司），Pentra全自動(dòng)血液分析儀（法國(guó)ABX公司），HES-TBD550紅細(xì)胞分離液（上海通善生物科技有限公司），KA-1000型臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠制造），650 nm雙波長(zhǎng)半導(dǎo)體激光器（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所激光醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室研制）。

1.2.2 血樣的選取

選取醫(yī)院中用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)出的30例高血脂血樣和30例血脂正常血樣各4 ml，其中高血脂含量標(biāo)準(zhǔn)符合衛(wèi)生部頒發(fā)的《中藥新藥治療高血脂的臨床研究指導(dǎo)原則》。用全自動(dòng)血液分析儀主要檢測(cè)血樣的紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量、紅細(xì)胞壓積等。采用肝素（1 000 U/ml）抗凝，并將血樣保存于（4±2）℃，作為實(shí)驗(yàn)待測(cè)液。

1.2.3 低能量激光照射

將正常血樣設(shè)為正常組，高血脂血樣設(shè)為高血脂組。高血脂組與正常組分別用波長(zhǎng)為650 nm激光照射，調(diào)整激光參數(shù)，使激光器輸出功率密度為20 mW/cm2，激光能量密度為12 J/cm2。將血樣輕輕混勻，吸取1 ml至干凈的24孔板中，標(biāo)記對(duì)應(yīng)的血樣編號(hào)；將激光器和光纖連接好，并調(diào)整好激光照射位置，使激光最亮的光斑對(duì)準(zhǔn)孔板的正中間位置，關(guān)閉日光燈；將24孔板放在照射臺(tái)上，每孔照射15 min，每5分鐘搖動(dòng)孔板一次，以保證血樣照射均勻；然后吸取照射后的血樣0.5 ml進(jìn)行紅細(xì)胞分離，分離的紅細(xì)胞與剩下的0.5 ml全血樣本稀釋之后用酶標(biāo)儀進(jìn)行光譜掃描。

1.2.4 紅細(xì)胞的分離和提取

將待測(cè)分離血樣按體積比1∶1與生理鹽水混合稀釋；然后再按體積比1∶1加入細(xì)胞分離液，置于塑料離心管中，1 500 r/min離心10 min，去除上清液，重復(fù)3次，即得紅細(xì)胞分離液；吸取0.5 ml紅細(xì)胞于干凈的離心管中，標(biāo)記對(duì)應(yīng)的血樣編號(hào)。

1.2.5 酶標(biāo)儀掃描

用0.9%生理鹽水將全血及全血分離得到的紅細(xì)胞稀釋60倍，加至96孔板中，用多功能酶標(biāo)儀掃描全血及紅細(xì)胞并繪制圖譜，統(tǒng)計(jì)全血及紅細(xì)胞吸收光譜的特性；比較正常組與高血脂組激光照射前后全血和紅細(xì)胞吸收光譜的不同之處，觀察吸收峰值的變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 全血與紅細(xì)胞吸收光譜的特點(diǎn)

在200～1 000 nm波段正常組與高血脂組無論是全血還是紅細(xì)胞均在200～270 nm范圍內(nèi)吸光度值跳動(dòng)很大，且隨機(jī)噪聲影響很大，270 nm之后才開始穩(wěn)定；各自的變化趨勢(shì)和峰值出現(xiàn)的波長(zhǎng)位置基本相同，符合可見光段吸收光譜特征[14]。在（416.47±1.85）、（544.95±1.80）、（578.63±2.00）nm處有明顯的吸收峰，正常血樣與高血脂血樣的吸收光譜僅存在波峰量上的差異；在（345.00±1.00）nm處也存在吸收峰，在600～1 000 nm處其吸收率＜5%，且無特征吸收峰（圖1）。由表1可得出高血脂組比正常組的吸收峰要高，以416nm處最為明顯。

圖1 正常組與高血脂組全血和紅細(xì)胞的吸收光譜

表1 正常組與高血脂組光譜吸收測(cè)量結(jié)果（x±s）

2.2 低能量激光照射高血脂血樣

用650 nm激光照射高血脂組，激光照射前后的可見光吸收光譜特征無明顯變化；照射后的全血光譜吸收峰較照射前高，在吸收峰416、544、578 nm處，照射前后的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；照射后紅細(xì)胞光譜吸收峰在416、544、578 nm處較照射前低，且照射前后差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中在吸收峰416 nm差異更為突出。（表2）

表2 高血脂組全血與紅細(xì)胞照射前后光譜吸收變化情況（±s）

表2 高血脂組全血與紅細(xì)胞照射前后光譜吸收變化情況（±s）

注：與照射前比較，aP＜0.05

項(xiàng)目 組別 n 波長(zhǎng)（nm）416 544 578全血 照射前 30 2.64±1.04 1.01±0.37 1.12±0.40照射后 30 3.36±1.11a 1.16±0.35a 1.19±0.36a紅細(xì)胞 照射前 30 3.85±0.94 1.32±0.20 1.35±0.21照射后 30 3.11±0.91a 1.34±0.37a 1.10±0.28a

2.3 低能量激光照射正常血樣

用650 nm激光照射正常組，激光照射前后的可見光吸收光譜特征無明顯變化。照射后的全血光譜吸收峰比照射前偏低，但照射前后差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；同時(shí)照射后的紅細(xì)胞光譜吸收峰在416、544、578 nm處較照射前相比，其差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。由此可見，650 nm低能量激光照射正常血樣對(duì)血樣的吸收光譜并無太大的影響。（表3）

表3 正常組全血與紅細(xì)胞照射前后光譜吸收變化情況（x±s）

3 討論

影響血液吸收光譜中可見光吸收峰的主要因素為血紅蛋白，國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究均表明全血與紅細(xì)胞的吸收光譜基本一致。全血和紅細(xì)胞分別在波長(zhǎng)為345、416、544、578 nm附近存在吸收峰[15]（圖1），符合血紅蛋白可見光吸收光譜的特征。由于本研究采用的是離體血液，因此血紅蛋白處于非氧合狀態(tài)，表現(xiàn)為非氧合血紅蛋白特征。在200～1 000 nm吸收光譜中，峰值為200～275 nm之間很容易破壞蛋白分子，導(dǎo)致血紅蛋白失去活性，因此在此波段光譜吸收跳動(dòng)很大；而當(dāng)激光波長(zhǎng)超過800 nm就會(huì)減少血細(xì)胞的載氧能力。據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)，波長(zhǎng)為630～670 nm的激光治療效果最好，氦氖弱激光照射通常選用的波長(zhǎng)為632.8 nm，此時(shí)紅細(xì)胞的載氧能力強(qiáng)，對(duì)于血液流變學(xué)的改善效果明顯。

本研究證明，可利用血液的吸收光譜特征來反映血脂的異常情況，在全血的吸收光譜中，吸收光譜特征并未改變，而高血脂組比正常組的吸光度偏高，在吸收峰416、544、578 nm附近尤為明顯（圖1）。對(duì)于高血脂組，在300～700 nm間其整體吸收峰偏高，主要是由于其血液中甘油三酯和膽固醇的含量比正常血液中多。王樂新等[16]在對(duì)高甘油三酯血清吸收光譜的研究中發(fā)現(xiàn)，高甘油三脂血清光譜的吸收率要高于正常血清的吸收率，其主要吸收范圍為370～600 nm，最強(qiáng)的吸收峰波長(zhǎng)位于416 nm，且在538 nm與575 nm附近有2個(gè)較弱的吸收峰，但這2個(gè)波峰在正常血清的吸收光譜中并不明顯。蘭秀風(fēng)等[17]的研究表明，高膽固醇血清的主要吸收范圍為375～600 nm，其吸收率是正常血清的2.2倍，其中最強(qiáng)的吸收峰位于波長(zhǎng)416 nm處，在544 nm及578 nm處有2個(gè)較弱的吸收峰，這2個(gè)吸收峰在正常血清的吸收光譜中亦不明顯。因此，根據(jù)吸收光譜特征可初步判定血液中的血脂含量是否異常。

本研究中對(duì)紅細(xì)胞進(jìn)行吸收光譜檢測(cè)，高血脂組較正常組紅細(xì)胞的吸收峰要高。紅細(xì)胞的脂質(zhì)占其總質(zhì)量的40%，其中磷脂和游離膽固醇約占其總脂的95%，還有少量的甘油酯和游離脂酸，以分子來計(jì)數(shù)，紅細(xì)胞膜中的磷脂和膽固醇相近。膽固醇主要分布在紅細(xì)胞膜的外層，也有一部分嵌入脂質(zhì)雙層，它具有調(diào)節(jié)膜流動(dòng)性的作用，紅細(xì)胞和血漿之間的脂質(zhì)分子處于平衡體系，需要膜-漿脂質(zhì)交換來維持平衡[18]。血脂升高，血漿中膽固醇的濃度即升高，膽固醇就會(huì)從高濃度的血漿中流入紅細(xì)胞脂質(zhì)層，結(jié)果紅細(xì)胞膽固醇含量升高對(duì)其光譜吸收產(chǎn)生了影響，使得高血脂組紅細(xì)胞的吸收峰偏高。

本研究結(jié)果顯示，用低能量650 nm激光照射可降低紅細(xì)胞對(duì)光譜的吸收。低能量激光照射高血脂血樣，使得紅細(xì)胞膜表面的脂質(zhì)分子減少，推測(cè)是由于經(jīng)低能量激光照射，可調(diào)節(jié)多種與脂質(zhì)代謝有關(guān)酶的活性，促進(jìn)脂肪細(xì)胞釋放細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)[19]，改善紅細(xì)胞與血漿的脂質(zhì)平衡，從而進(jìn)一步改善了紅細(xì)胞的變形性和聚集性

4 結(jié)論

本研究表明，通過低能量激光照射可降低高血脂血液中紅細(xì)胞對(duì)光譜的吸收，間接反映出激光在治療高血脂方面的療效，激光治療通過減少紅細(xì)胞表面的脂質(zhì)分子，進(jìn)而有助于改善紅細(xì)胞膜的變形性及流動(dòng)性等血液流變學(xué)。未來尚需對(duì)低能量激光照射高血脂癥紅細(xì)胞的形態(tài)及功能變化的機(jī)理做進(jìn)一步的研究。

利益沖突 無

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Influence of absorption spectrum with 650 nm low-level laser irradiation on in-vitro hyperlipidemia blood and erythrocyte

Wang Haichen,Wang Hong,Liu Weichao,Lyu Jubao,Sha Hong

Institute of Biomedical Engineering,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Tianjin 300192,China

Sha Hong,Email:shahong2000@163.com

Objective To study the effect on absorption spectrum of low-level laser irradiation on hyperlipidemia blood and erythrocyte in vitro.Methods A total of 30 hyperlipidemia blood samples were chosen as the experiment group,and 30 normal blood samples were chosen as the control group.The absorption spectrum of whole blood and erythrocyte in the two groups was measured by multi-wavelength microplate reader and compared. After hyperlipidemia and normal blood samples were irradiated by 650 nm low-level laser,the absorbance of whole blood and erythrocyte was measured,and the results were compared with those of hyperlipidemia and normal blood samples before irradiation.Results The absorption peaks(416,544,578 nm)of whole blood and erythrocyte in the experiment group were higher than those in the control group,which was considered as a diagnostic factor of hyperlipidemia.After low-level laser irradiation,the absorption peaks of erythrocyte at 416,544,and 578 nm in the experiment group decreased with significant differences(P＜0.05),while the absorption peaks of whole blood at 416, 544,and 578 nm in the experiment group were elevated with significant differences(P＜0.05).Conclusions Lowlevel laser irradiation at 650 nm can decrease the hyperlipidemia erythrocyte absorption peaks and improve the balance between erythrocyte membrane and lipid profiles,which proves the feasibility of low-level laser for the treatment of hyperlipidemia from the perspective of spectroscopy.

Low-level laser;Hyperlipidemia;Absorption spectrum;Multifunctional microplate reader

沙洪，Email：shahong2000@163.com

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．05．005

國(guó)家自然科學(xué)基金（81602800，81301288）

2016-07-12）