方哲翔 王建華 程娘梅 張其清

350002福州大學(xué)生物和醫(yī)藥技術(shù)研究院（方哲翔、王建華、程娘梅）；300192天津，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所（張其清）

載TGF-β1納米粒的膠原/絲素蛋白復(fù)合支架的制備與表征

方哲翔 王建華 程娘梅 張其清

350002福州大學(xué)生物和醫(yī)藥技術(shù)研究院（方哲翔、王建華、程娘梅）；300192天津，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所（張其清）

目的 構(gòu)建一種載轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）納米粒的雙層膠原/絲素蛋白復(fù)合支架。方法 制備載TGF-β1的殼聚糖-肝素（Ch-Hep）納米粒，檢測(cè)其形態(tài)、粒徑、Zeta電位和包封率。制備不同膠原和絲素蛋白質(zhì)量比（2∶8、3∶7、7∶3、8∶2、10∶0）的5種膠原/絲素蛋白復(fù)合材料，分別檢測(cè)其吸水率、孔隙率、熱水溶失率和生物相容性；選擇其中2種綜合性能良好的復(fù)合材料分別作為復(fù)合支架的疏松層和致密層，構(gòu)建載TGF-β1納米粒的雙層膠原/絲素蛋白復(fù)合支架，觀察其形態(tài)并進(jìn)行體外釋放動(dòng)力學(xué)研究。結(jié)果 Ch-Hep納米粒的平均粒徑為（718.2±73.6）nm，Zeta電位為（25.5±0.8）mV，對(duì)TGF-β1的包封率為（84.82±1.57）%。隨著膠原/絲素蛋白復(fù)合材料中膠原含量的增加，材料的吸水率、孔隙率逐漸增加，熱水溶失率逐漸降低；5種材料對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）均有促生長(zhǎng)和增殖的作用。綜合考慮后選用質(zhì)量比為3∶7和7∶3的膠原/絲素蛋白復(fù)合材料分別作為復(fù)合支架的致密層和疏松層，構(gòu)建的膠原/絲素蛋白復(fù)合支架為雙層結(jié)構(gòu)，一側(cè)結(jié)構(gòu)致密，另一側(cè)疏松多孔。體外釋放動(dòng)力學(xué)研究表明，復(fù)合支架對(duì)TGF-β1具有定向時(shí)空控制性釋放作用。結(jié)論 載TGF-β1納米粒的雙層膠原/絲素蛋白復(fù)合支架對(duì)TGF-β1具有良好的時(shí)空控制釋放作用，有望作為生長(zhǎng)因子的控緩釋支架材料應(yīng)用于軟骨組織工程。

膠原； 絲素蛋白； 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1； 納米粒

Fund program：National Natural Science Foundation of China(31271023);Natural Science Foundation of Fujian Province(2012J01209)

0 引 言

近年來(lái)，由創(chuàng)傷、腫瘤、骨質(zhì)疏松等多種原因引起的關(guān)節(jié)軟骨缺損發(fā)病率逐年增加，對(duì)人類健康造成了極大的威脅，組織工程技術(shù)的出現(xiàn)為軟骨缺損治療帶來(lái)了新希望。對(duì)與關(guān)節(jié)軟骨缺損相關(guān)的生長(zhǎng)因子、種子細(xì)胞和支架材料的研究使關(guān)節(jié)軟骨缺損的再生修復(fù)成為可能，其中載生長(zhǎng)因子的控緩釋支架材料的構(gòu)建是其重要的研究方向之一。

本研究選取殼聚糖和肝素制備載轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的納米粒，并將其復(fù)合于致密程度不同的雙層膠原/絲素蛋白復(fù)合材料中，構(gòu)建載TGF-β1納米粒的膠原/絲素蛋白復(fù)合支架并進(jìn)行體外釋放動(dòng)力學(xué)研究，為其在軟骨缺損治療中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

蠶繭（江蘇蘇豪國(guó)際集團(tuán)股份有限公司），牛腱膠原（福建省博特生物科技有限公司），殼聚糖（相對(duì)分子質(zhì)量為1×105，脫乙酰度為90%）（生工生物工程（上海）股份有限公司），肝素鈉（上海麗臣商貿(mào)有限公司），TGF-β1（美國(guó)Sigma-Aldrich公司），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），DMEM/F-12（1∶1）培養(yǎng)基（美國(guó)HyClone公司），I型膠原酶（美國(guó)Gibco公司），骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）（福州大學(xué)生物和醫(yī)藥技術(shù)研究院自制）。

DNM-9602酶標(biāo)儀（北京普朗新技術(shù)有限公司），HH.CP-TCO2恒溫培養(yǎng)箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司），AFZ-1001-U超純水系統(tǒng)（美國(guó)艾科浦國(guó)際有限公司），JEM-100CXII透射電鏡（日本電子株式會(huì)社），XL30ESEM-TMP環(huán)境掃描電鏡（荷蘭Philips-FEI公司），Zetasizer Nano S90粒度分析儀（英國(guó)Malvern儀器有限公司），TP114電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司），Biofuge PrimoR冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），DF-101S磁力攪拌器（上海雷磁新涇儀器公司）。

1.2 方法

1.2.1 載TGF-β1的殼聚糖-肝素納米粒的制備和表征

分別配制質(zhì)量濃度為2 mg/ml的殼聚糖溶液和1 mg/ml的肝素鈉溶液；將0.4 mg TGF-β1溶于0.2 ml水中，加入5 ml肝素鈉溶液混合過(guò)夜；在4℃下以700 r/min攪拌，將2 ml殼聚糖溶液逐滴滴入肝素鈉混合溶液中，即得載TGF-β1的殼聚糖-肝素（chitosan-heparin，Ch-Hep）納米粒。

吸取適量載TGF-β1的Ch-Hep納米粒滴于銅網(wǎng)上，于空氣中自然干燥過(guò)夜，用透射電鏡觀察其形態(tài)；將載TGF-β1的Ch-Hep納米粒用0.8 μm濾膜過(guò)濾，用粒度分析儀檢測(cè)其粒徑和Zeta電位。

1.2.2 載TGF-β1的Ch-Hep納米粒的包封率測(cè)定

按BCA試劑A∶試劑B的體積比為50∶1配制BCA工作液；配制質(zhì)量濃度為0.5 mg/ml的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）標(biāo)準(zhǔn)品溶液；將BSA溶液按0、1、2、4、8、12、16、20 μl分別加入96孔板中，各孔稀釋至20 μl，配成不同質(zhì)量濃度的BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液；每孔加入200 μl BCA工作液，室溫放置30 min，于546 nm處測(cè)定吸光度（absorbance，OD）值；以標(biāo)準(zhǔn)品BSA含量（μg）為橫坐標(biāo)，以平均OD值為縱坐標(biāo)，繪制BCA試劑盒蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線；將1.2.1節(jié)中制備的載TGF-β1的Ch-Hep納米粒的肝素鈉混合液在8 000 r/min、4℃條件下離心10 min，用BCA試劑盒檢測(cè)上清液中TGF-β1的含量，計(jì)算Ch-Hep納米粒的包封率。

1.2.3 膠原/絲素蛋白復(fù)合材料的制備

將蠶繭剪碎后放入質(zhì)量濃度為5 g/L的Na2CO3溶液中，100℃水浴30 min，取出清洗，60℃烘干，即得經(jīng)脫膠處理后的絲素絲；在80℃下，用CaCl2/ H2O/C2H5OH溶液（摩爾比為1∶8∶2）溶解脫膠后的絲素絲，浴比為1∶25，過(guò)濾透析3 d，得到絲素蛋白溶液；取培養(yǎng)皿稱取質(zhì)量，培養(yǎng)皿中加入絲素蛋白溶液，稱取質(zhì)量，置于80℃烘箱8 h后，每30分鐘取出稱取質(zhì)量，直至質(zhì)量不再變化。式中：M0為培養(yǎng)皿質(zhì)量，M1為加入絲素蛋白溶液后的質(zhì)量，M2為置烘箱后的恒定質(zhì)量。

取適量牛腱膠原加入0.1 mol/L醋酸溶液中，攪拌使其溶解，制得質(zhì)量濃度為6 g/L的膠原溶液，靜置1 h后取出放入4℃冰箱備用；按絲素蛋白的檢測(cè)濃度，將膠原和絲素蛋白分別按質(zhì)量比2∶8、3∶7、7∶3、8∶2、10∶0緩慢混合，磁力攪拌4 h后凍干，得5組膠原/絲素蛋白復(fù)合材料；將膠原/絲素蛋白復(fù)合材料浸入1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（EDC）/ N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）交聯(lián)劑中交聯(lián)8 h，水洗除去交聯(lián)劑后凍干即得膠原/絲素蛋白復(fù)合材料。

1.2.4 膠原/絲素蛋白復(fù)合材料的篩選

將各組膠原/絲素蛋白復(fù)合材料剪成1 cm×1 cm小塊，稱取質(zhì)量；浸入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH7.4）中，37℃水浴24 h后取出，吸干表面水分，稱取質(zhì)量，按下式計(jì)算吸水率

式中：W0為復(fù)合材料浸入PBS后的質(zhì)量，W1為復(fù)合材料干燥狀態(tài)下的質(zhì)量。

將各組膠原/絲素蛋白復(fù)合材料小塊浸入無(wú)水乙醇中；8 min后負(fù)壓脫氣至無(wú)氣泡逸出，記錄此時(shí)無(wú)水乙醇體積；用鑷子取出樣品，記錄剩余乙醇體積，按下式計(jì)算孔隙率

式中：V1為復(fù)合材料浸入的無(wú)水乙醇體積，V2為脫氣后的無(wú)水乙醇體積，V3為取出復(fù)合材料后的無(wú)水乙醇體積。

將各組膠原/絲素蛋白復(fù)合材料小塊稱取質(zhì)量；浸入PBS（pH7.4）中，37℃水浴24 h，放入烘箱烘干，稱取質(zhì)量，按下式計(jì)算熱水溶失率

式中：M0為復(fù)合材料干燥狀態(tài)下的質(zhì)量，M1為復(fù)合材料浸入PBS再烘干后的質(zhì)量。

將各組膠原/絲素蛋白復(fù)合材料放入培養(yǎng)板，每孔加入1.0 ml DMEM/F-12培養(yǎng)基，每組材料表面接種1×105個(gè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h；再將材料轉(zhuǎn)至新的培養(yǎng)板，每3天換液1次；分別于接種后的第1、3和5天用PBS清洗，每孔加入200 μl噻唑藍(lán)（thiazolyl blue tetrazolium bromide, MTT）溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄孔中溶液，加入600 μl二甲基亞砜后振蕩30 min，分別于490 nm處測(cè)定OD值。

1.2.5 載TGF-β1納米粒的雙層膠原/絲素蛋白復(fù)合支架的制備與表征

根據(jù)1.2.4節(jié)的檢測(cè)結(jié)果，選取膠原和絲素蛋白質(zhì)量比分別為3∶7和7∶3的膠原/絲素蛋白復(fù)合材料制備雙層膠原/絲素蛋白復(fù)合支架，其中3∶7作為致密層材料，7∶3作為疏松層材料。

制備時(shí)將疏松層膠原/絲素蛋白材料用雙蒸水潤(rùn)濕后平鋪，表面滴加載TGF-β1的Ch-Hep納米粒溶液，4～8℃風(fēng)干至表面無(wú)流動(dòng)液體；將致密層膠原/絲素蛋白材料潤(rùn)濕后平鋪于疏松層之上，4～8℃風(fēng)干，即得載生長(zhǎng)因子的雙層膠原/絲素蛋白復(fù)合材料；用液氮脆斷制樣，導(dǎo)電膠固定，噴金5 min后用掃描電鏡觀察。

1.2.6 載TGF-β1納米粒的雙層膠原/絲素蛋白復(fù)合支架的體外釋放動(dòng)力學(xué)研究

將自行設(shè)計(jì)的流池法簡(jiǎn)易檢測(cè)裝置[1]置于37℃水浴鍋內(nèi)；將載TGF-β1納米粒的雙層膠原/絲素蛋白復(fù)合支架置于濾器內(nèi)，在恒流泵作用下，液體從雙層材料流出，流出方向分別為疏松層→致密層（SM）和致密層→疏松層（MS）；流入的釋放液分別為PBS（pH7.4）和質(zhì)量濃度為0.5 mg/ml的Ⅰ型膠原酶；調(diào)整恒流泵流速為0.5 ml/h，每24小時(shí)收集1次；采用BCA試劑盒檢測(cè)收集液中TGF-β1的含量，繪制TGF-β1的釋放曲線。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 載TGF-β1的Ch-Hep納米粒的表征

由透射電鏡結(jié)果（圖1A）可看出，載TGF-β1的Ch-Hep納米粒形狀不規(guī)則，呈顆粒狀，中間加深部分為TGF-β1。載TGF-β1的Ch-Hep納米粒粒徑呈正態(tài)分布，分布范圍集中，平均粒徑為（718.2± 73.6）nm（圖1B），Zeta電位為（25.5±0.8）mV（圖1C）。

2.2 載TGF-β1的Ch-Hep納米粒包封率的測(cè)定

以平均OD值與對(duì)應(yīng)的BSA濃度繪制蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖2所示，蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.001 1x+0.123 3，r=0.994 9，表明BSA在0～500 μg/ml范圍內(nèi)與OD值成線性關(guān)系。根據(jù)蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得出，Ch-Hep納米粒的包封率為（84.82±1.57）%。

2.3 不同質(zhì)量比膠原/絲素蛋白復(fù)合材料的吸水率、孔隙率、熱水溶失率和生物相容性檢測(cè)

由圖3A可知，不同質(zhì)量比的膠原/絲素蛋白復(fù)合材料均具有良好的吸水率，隨著膠原含量的增加，膠原/絲素蛋白復(fù)合材料的吸水率逐漸升高。膠原/絲素蛋白復(fù)合材料的孔隙率見圖3B，其中膠原和絲素蛋白質(zhì)量比為2:8和3:7的復(fù)合材料的平均孔隙率均＜40%，質(zhì)量比為7:3、8:2和10:0的復(fù)合材料的平均孔隙率均＞60%，兩種不同孔隙率的復(fù)合材料可分別用作致密層和疏松層材料。圖3C顯示不同質(zhì)量比膠原/絲素蛋白復(fù)合材料的熱水溶失率均＜8%，且隨著膠原比例的增加，復(fù)合材料的熱水溶失率呈逐漸降低的趨勢(shì)。BMSCs在膠原/絲素蛋白復(fù)合材料上的增殖情況如圖3D所示。以純膠原材料（膠原和絲素蛋白的質(zhì)量比為10∶0）為對(duì)照，BMSCs在其余4組復(fù)合材料（膠原和絲素蛋白的質(zhì)量比分別為2∶8、3∶7、7∶3、8∶2）上均能生長(zhǎng)和增殖，第1天細(xì)胞增殖速率較低；第3～5天細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯加快，細(xì)胞數(shù)量顯著增加（P＜0.05）；第5天膠原和絲素蛋白質(zhì)量比為7∶3、3:7組的細(xì)胞增殖率分居第1和第2位，均表現(xiàn)出顯著地促細(xì)胞增殖作用（P＜0.05）。綜合考慮后選用質(zhì)量比為3∶7和7∶3的膠原/絲素蛋白復(fù)合材料分別作為復(fù)合支架的致密層和疏松層。

2.4 載TGF-β1納米粒的雙層膠原/絲素蛋白復(fù)合支架的表征

由復(fù)合支架橫截面的掃描電鏡圖可看出，構(gòu)建的膠原/絲素蛋白復(fù)合支架為雙層結(jié)構(gòu)，一側(cè)疏松多孔，另一側(cè)結(jié)構(gòu)致密。（圖4）

圖2 BCA法試劑盒測(cè)定蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 載轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的雙層膠原/絲素蛋白復(fù)合支架的掃描電鏡圖（×4 000）

2.5 載TGF-β1納米粒的雙層膠原/絲素蛋白復(fù)合支架的釋放動(dòng)力學(xué)研究

圖5A為載TGF-β1納米粒的雙層膠原/絲素蛋白復(fù)合支架在PBS釋放液中的釋放曲線，從中可看出，TGF-β1從疏松層→致密層（SM）較致密層→疏松層（MS）釋放速率低；而在膠原酶釋放液（圖5B）中正好相反，TGF-β1從疏松層→致密層（SM）的釋放速率高于致密層→疏松層（MS）。比較兩種釋放液環(huán)境下TGF-β1的釋放速率發(fā)現(xiàn)，膠原酶釋放液中TGF-β1的釋放速率均高于PBS釋放液，但兩者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論與結(jié)論

因創(chuàng)傷、腫瘤、骨質(zhì)疏松等多種原因造成的軟骨缺損是臨床常見問(wèn)題，對(duì)人類健康造成了極大的威脅。關(guān)節(jié)軟骨因無(wú)血管、淋巴等特點(diǎn)而使其自愈能力受限，因此有效修復(fù)軟骨缺損是亟待解決的臨床難題。近年來(lái)，軟骨組織工程技術(shù)[2]為軟骨缺損修復(fù)提供了一種新的治療策略，現(xiàn)已發(fā)展至第3代[3]，即將表面接種種子細(xì)胞的載生長(zhǎng)因子的生物材料直接植入缺損處，以誘導(dǎo)新組織的生成。

TGF-β1是軟骨損傷修復(fù)常用的生長(zhǎng)因子，但應(yīng)用時(shí)存在半衰期短和在體內(nèi)易擴(kuò)散等問(wèn)題，難以有效發(fā)揮TGF-β1的生物學(xué)效應(yīng)。常見的解決方法是為TGF-β1選擇合適的控緩釋載體材料，從而使TGF-β1得到良好的時(shí)空控制性釋放。納米粒是近年發(fā)展起來(lái)的藥物輸送系統(tǒng)，具有緩釋生長(zhǎng)因子、提高因子穩(wěn)定性和生物利用度等優(yōu)點(diǎn)，在組織工程領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。研究結(jié)果表明，殼聚糖緩釋系統(tǒng)在負(fù)載生長(zhǎng)因子的同時(shí)，可與組織工程支架直接復(fù)合[4]并促進(jìn)軟骨細(xì)胞的黏附和增殖[5]。肝素納米載體對(duì)生長(zhǎng)因子具有良好的親和性，能使生長(zhǎng)因子均勻地分散于其中，從而實(shí)現(xiàn)有效地控制釋放[6]。本研究結(jié)果表明，選用殼聚糖和肝素制備載TGF-β1的Ch-Hep納米粒，其粒徑較小，Zeta電位穩(wěn)定，包封率高，是載TGF-β1的較理想載體。

軟骨損傷修復(fù)過(guò)程存在炎癥增生期、清除期和重塑期等，不同時(shí)期種子細(xì)胞的生長(zhǎng)速度亦不同。良好的軟骨組織工程支架材料不僅要為種子細(xì)胞的正常生長(zhǎng)及細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)提供必要的微環(huán)境，同時(shí)還要能對(duì)所載生長(zhǎng)因子具有時(shí)空控制性釋放作用。膠原是構(gòu)建軟骨組織工程支架的常用材料[7-9]，能模擬體內(nèi)基質(zhì)環(huán)境，加快細(xì)胞黏附、遷移，促進(jìn)軟骨損傷的自我修復(fù)[10]。絲素蛋白能維持軟骨細(xì)胞的正常生長(zhǎng)狀態(tài)和性能，可用于軟骨及骨的重建和再生[11-13]?；谇捌诘难芯炕A(chǔ)[14-16]，本研究利用膠原和絲素蛋白材料制備了不同質(zhì)量比的5種膠原/絲素蛋白復(fù)合材料，并選取其中2種綜合性能良好的膠原/絲素蛋白復(fù)合材料分別作為復(fù)合支架的疏松層和致密層，構(gòu)建了載TGF-β1納米粒的雙層膠原/絲素蛋白復(fù)合支架。

為考察膠原/絲素蛋白復(fù)合支架對(duì)所載TGF-β1的釋放行為，本研究模擬了體液環(huán)境，考察在PBS和膠原酶兩種介質(zhì)中，復(fù)合支架疏松層→致密層（SM）和致密層→疏松層（MS）兩種不同取向?qū)ιL(zhǎng)因子釋放的影響。在PBS釋放液中，TGF-β1從疏松層→致密層（SM）較致密層→疏松層（MS）的釋放速率低，其影響因素主要與擴(kuò)散有關(guān)；在膠原酶釋放液中，TGF-β1從疏松層→致密層（SM）較致密層→疏松層（MS）的釋放速率高，表明疏松材料更易受膠原酶消化降解的影響。膠原酶釋放介質(zhì)中的釋放模式更符合生物體內(nèi)的實(shí)際情況，因此致密層→疏松層（MS）取向更利于軟骨的缺損修復(fù)。本研究構(gòu)建的膠原/絲素蛋白復(fù)合支架雙側(cè)結(jié)構(gòu)的不同導(dǎo)致TGF-β1的釋放速率不同，具有定向時(shí)空控制釋放的特點(diǎn)，這與其他文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相一致[1,17]。

本研究采用膠原和絲素蛋白設(shè)計(jì)并構(gòu)建了一種載TGF-β1納米粒的雙層異相結(jié)構(gòu)復(fù)合支架，對(duì)TGF-β1具有定向時(shí)空控制釋放性。后續(xù)將進(jìn)一步開展BMSCs在載TGF-β1納米粒的膠原/絲素蛋白復(fù)合支架上的黏附、增殖及修復(fù)軟骨缺損動(dòng)物模型的研究，為闡明載TGF-β1納米粒的膠原/絲素蛋白復(fù)合支架材料修復(fù)軟骨缺損的機(jī)理奠定實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

利益沖突 無(wú)

（圖1、3見插頁(yè)5-7，圖5見插頁(yè)5-8）

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Preparation and characterization of collagen/silk fibroin composite scaffold incorporating TGF-β1nanoparticles

Fang Zhexiang,Wang Jianhua,Cheng Niangmei,Zhang Qiqing

Institute of Biomedical and Pharmaceutical Technology,Fuzhou University,Fuzhou 350002,China(Fang ZX,Wang JH,Cheng NM);Institute of Biomedical Engineering,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Tianjin 300192,China(Zhang QQ)

Zhang Qiqing,Email:zhangqiq@126.com

Objective To construct a double layered collagen/silk fibroin composite scaffold incorporating transforming growth factor-β1(TGF-β1)nanoparticles.Methods The chitosan-heparin(Ch-Hep)nanoparticles incorporating TGF-β1 were prepared and the morphology,particle size,Zeta potential and encapsulation efficiency of the nanoparticles were observed and detected.Five kinds of collagen/silk fibroin composites that had different mass ratio of collagen to silk fibroin(2∶8,3∶7,7∶3,8∶2,10∶0)were prepared,and water absorption,porosity,loss rate in hot water and biocompatibility of the composites were determined.Two kinds of the collagen/silk fibroin composites were selected as the dense and loose layers to construct double layer collagen/silk composite scaffold incorporating TGF-β1 nanoparticles,and the morphology and in vitro TGF-β1 release kinetics of the composite scaffold were observed. Results The average particle size,Zeta potential and encapsulation efficiency of Ch-Hep nanoparticles were(718.2±73.6)nm,(25.5±0.8)mV and(84.82±1.57)%,respectively.As the content of collagen in the composite increased,the water absorption and porosity of composites increased gradually,whereas the loss rate in hot water of the composites decreased gradually.All of the collagen/silk fibroin composites could promote the growth and proliferation of bone mesenchymal stem cells(BMSCs).Based on overall evaluation,collagen/silk fibroin composites with mass ratio of 3∶7 and 7∶3 were selected as the dense layer and loose layer of collagen/silk fibroin composite scaffold.The collagen/silk fibroin composite scaffold constructed was made up of two layers with one dense layer and another loose and porous layer.In vitro TGF-β1 release kinetics study showed that the composite scaffold had the ability of controlling spatiotemporal release of TGF-β1.Conclusions The collagen/silk fibroin composite scaffoldincorporating TGF-β1 nanoparticles can control the spatiotemporal release of TGF-β1,and thus has the potential for the application in cartilage tissue engineering as the sustained and controlled release scaffold of growth factor.

Collagen; Silk fibroin;Transforming growth factor-β1;Nanoparticles

張其清，Email：zhangqiq@126.com

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．05．003

國(guó)家自然科學(xué)基金（31271023）；福建省自然科學(xué)基金（2012J01209）

2016-08-10）